Nghiên cứu khả năng hấp thụ thuốc neomycin sulfate của vật liệu cellulose tạo ra từ gluconacetobacter xylinus nuôi cấy trong môi trường nước dừa già​

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI KHOA SINH - KTNN ===  === HOÀNG THỊ QUỲNH NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG HẤP THỤ THUỐC NEOMYCIN SULFATE CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE TẠO RA TỪ GLUCONACETOBACTER XYLINUS NUÔI CẤY TRONG MÔI TRƢỜNG NƢỚC DỪA GIÀ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Sinh lý học ngƣời động vật HÀ NỘI - 2019 TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI KHOA SINH - KTNN ===  === HOÀNG THỊ QUỲNH NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG HẤP THỤ THUỐC NEOMYCIN SULFATE CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE TẠO RA TỪ GLUCONACETOBACTER XYLINUS NUÔI CẤY TRONG MƠI TRƢỜNG NƢỚC DỪA GIÀ KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Sinh lý học ngƣời động vật Ngƣời hƣớng dẫn khoa học TS CAO BÁ CƢỜNG HÀ NỘI – 2019 LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy giáo Cao Bá Cƣờng, ngƣời thầy tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ em suốt q trình thực khóa luận Em xin chân thành cảm ơn thầy, cô giáo khoa Sinh KTNN thầy cô Viện Nghiên cứu Khoa học Ứng dụng tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ cho em trình làm thực nghiệm để em hồn thành khóa luận Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè bên cạnh động viên, giúp đỡ suốt q trình học tập hồn thành khóa luận Do lần đầu em tham gia nghiên cứu khoa học, kiến thức cịn hạn chế nên khơng tránh khỏi thiếu sót Em mong nhận đƣợc góp ý thầy bạn để khóa luận tốt nghiệp em đƣợc hoàn thiện Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng năm 2019 Sinh viên Hồng Thị Quỳnh LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan đề tài tơi thực dƣới hƣớng dẫn TS Cao Bá Cƣờng Tất số liệu đƣợc thu thập từ thực nghiệm, qua xử lý thống kê, khơng có số liệu chép hay bịa đặt, không trùng với kết cơng bố Những trích dẫn khóa luận lấy từ cơng bố thức có ghi rõ ràng Nếu sai tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm Hà Nội, tháng năm 2019 Sinh viên Hoàng Thị Quỳnh MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Lý chọn đề tài Mục đích nghiên cứu Đối tƣợng phạm vi nghiên cứu Ý nghĩa khoa học thực tiễn .2 NỘI DUNG CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan vật liệu cellulose (VLC) 1.1.1 Vi khuẩn tổng hợp lên VLC 1.1.2 Môi trƣờng nuôi cấy G Xylinus 1.1.3 Cấu trúc VLC 1.1.4 Tính chất VLC 1.1.5 Ứng dụng VLC 1.2 Tình hình nghiên cứu VLC .7 1.2.1 Trên giới 1.2.2 Tại Việt Nam 1.3 Tổng quan NS 1.3.1 Công thức cấu tạo 1.3.2 Tính chất lí hóa 1.3.3 Dƣợc lý học dƣợc động học 1.3.4 Chỉ định chống định 1.4 Tình hình nghiên cứu NS 10 1.4.1 Trên giới 10 1.4.2 Tại Việt Nam 10 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11 2.1 Vật liệu nghiên cứu 11 2.1.1.Chủng vi khuẩn 11 2.1.2 Nguyên liệu hóa chất 11 2.1.3 Trang thiết bị 11 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 11 2.2.1 Chuẩn bị VLC 11 2.2.2 Chế tạo VLC nạp NS 13 2.2.3 Phƣơng pháp xử lí thống kê 15 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 16 3.1 Thu VLC tinh chế màng 16 3.1.1 Thu VLC từ môi trƣờng lên men 16 3.1.2 Tạo VLC tinh khiết 16 3.1.3 Phƣơng pháp đánh giá độ tinh khiết củaVLC .17 3.2 Phƣơng trình đƣờng chuẩn NS PBS (pH = 7,4) 18 3.3 Xác định lƣợng thuốc NS nạp vào VLC 19 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .24 TÀI LIỆU THAM KHẢO .25 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Giá trị dinh dƣỡng nƣớc dừa già 100g [9] .4 Bảng 2.1 Thành phần môi trƣờng lên men thu VLC 12 Bảng 2.2 Môi trƣờng đệm PBS với pH = 7,4 13 Bảng 3.1 Mật độ quang dung dịch Neomycin sufate nồng độ (n = 3) 18 Bảng 3.2 Giá trị OD hấp thụ thuốc NS VLC (n = 3) 19 Bảng 3.3 Khối lƣợng, hiệu suất hấp thụ thuốc NS vào VLC(n=3) 20 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc hóa học VLC Hình 1.2 Cấu trúc VLC (Yamanaka et al, 2000) Hình 1.3 Cơng thức cấu tạo Neomycin sunfate [27] Hình 3.1 VLC nuôi cấy ngày 16 Hình 3.2.VLC thơ sau thu 16 Hình 3.3 VLC 0,5 cm đƣợc tinh chế .17 Hình 3.4 Thí nghiệm kiểm tra độ tinh khiết VLC 17 Hình 3.5 Phƣơng trình đƣờng chuẩn thuốc NS 18 Hình 3.6 VLC hấp thụ thuốc NS 19 Hình 3.7 Khối lƣợng thuốc NS hấp thụ vào VLC( 0,3cm) VLC(0,5cm) giờ, 1,5 giờ, giờ21 Hình 3.8 Hiệu suất hấp thụ thuốc NS VLC(0,3cm) VLC(0,5cm) giờ, 1,5 giờ, giờ21 MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Ngày việc sử dụng vật liệu sinh học để ứng dụng lĩnh vực nhƣ: y học, mỹ phẩm, thực phẩm,…đang đƣợc nhà nghiên cứu khoa học nƣớc giới đặc biệt quan tâm Một vật liệu sinh học đƣợc nhà khoa học đặc biệt ý đến vật liệu cellulose (VLC) VLC đƣợc tổng hợp nhiều vi khuẩn, phải kể đến vi khuẩn Gluconacetobacter xylinus ( G.xylinus) – loại vi khuẩn có khả tạo VLC tốt VLC hợp chất tƣơng hợp sinh học, không độc hại, với cấu trúc siêu mịn, đặc tính học bền, dai, khả giữ ẩm cao nên có nhiều ứng dụng nhiều lĩnh vực nhƣ: công nghệ giấy, thực phẩm, y học, …[4] Trong y học, VLC đƣợc ứng dụng làm màng trị bỏng, mặt nạ dƣỡng da, mạch máu nhân tạo [4] Không vậy, VLC cịn có khả hấp thu thuốc, tăng tác dụng thuốc, hạn chế đƣợc tác dụng phụ thuốc Để tạo VLC, G.xylinus ni cấy môi trƣờng nhƣ: nƣớc dừa già, rỉ đƣờng, dịch ép hoa quả, …Trong đề tài chọn nƣớc dừa già mơi trƣờng ni cấy G.xylinus nƣớc dừa già chứa nhiều chất dinh dƣỡng cần thiết để nuôi cấy vi khuẩn G.xylinus Neomycin sunfate (NS) loại thuốc kháng sinh nhóm aminoglycoside Đƣợc sử dụng để điều trị nhiễm khuẩn da, ức chế vi khuẩn đƣờng ruột trƣớc phẫu thuật, điều trị hôn mê gan, nhiễm trùng ống tai ngoài, … NS hấp thụ qua đƣờng tiêu hóa kém, khoảng 97% lƣợng thuốc uống vào thể bị tiết dƣới dạng không đổi qua phân Kem NS điều trị bệnh viêm da có khả thẩm thấu qua da khơng cao đạt 45%, nhanh bị khơ bề mặt da,…[1] Chính cần phải nghiên cứu hệ thống hấp thụ thuốc NS để giúp thuốc đƣợc hấp thụ cách tốt 3.3 Xác định lƣợng thuốc NS nạp vào VLC VLC sau tinh chế ta lấy giấy thấm bỏ 60% nƣớc Chuẩn bị bình 250 ml, bình cho NS (2 mg/ml) tiếp tục cho dung dịch đệm PBS (pH= 7,4) đến vạch 100 ml Cho màng vào dung dịch vừa pha, rung động 180 vòng 400C giờ, 1,5 giờ, đảm bảo cho màng hấp thụ tối đa VLCđang hấp thụ thuốc đƣợc thể nhƣ hình 3.6 Hình 3.6 VLC hấp thụ thuốc NS VLC sau cho vào dung dịch đệm PBS có chứa thuốc NS (2 mg/ml) lắc khoảng thời gian lần lƣợt giờ, 1,5 giờ, lấy dung dịch đo quang phổ UV - 2450 để xác định lƣợng thuốc hấp thụ vào màng Mỗi mẫu đo OD lần, để lấy trung bình mẫu, sử dụng phần mềm Excel để phân tích thống kê số liệu, phân tích phƣơng sai xác định khoảng tin cậy Bảng 3.2 Giá trị OD hấp thụ thuốc NS VLC (n = 3) Độ dà 0, 0, Kết bảng 3.2 cho thấy sau ngâm màng giá trị OD đo đƣợc gần nhƣ không giảm, chứng tỏ lƣợng thuốc hấp thụ vào màng đạt cực đại Khối lƣợng thuốc hấp thụ vào màng hiệu suất thuốc hấp thụ đƣợc vào màng đƣợc thể bảng 3.3 Bảng 3.3 Khối lƣợng, hiệu suất hấp thụ thuốc NS vào VLC(n=3) Độ dày màng (cm) 0,3 0,5 20 khối lượng thuốc hấp thuốc hấp thụ 1.5 VLC 0,3 VLC 0,5 0.5 1.5 giờ Thời gian hấp thụ thuốc Hình 3.7 Khối lƣợng thuốc NS hấp thụ vào VLC( 0,3cm) VLC(0,5cm) giờ, 1,5 giờ, Hiệu suất hấp thụ thuốc (%) 100 88.29 87.15 89 87.31 89.24 87.37 80 60 VLC 0,3 40 VLC 0,5 20 1,5 giờ Thời gian hấp thụ thuốc VLC Hình 3.8 Hiệu suất hấp thụ thuốc NS VLC(0,3cm) VLC(0,5cm) giờ, 1,5 giờ, 21 Kết nghiên cứu đƣợc trình bày bảng 3.3, hình 3.7 hình 3.8 cho thấy: Hiệu suất hấp thụ thuốc NS vào VLC tƣơng đối lớn chiếm 87% lƣợng thuốc ban đầu đem hấp thu Cùng độ dày màng, thời gian hấp thụ thuốc khác khối lƣợng thuốc hiệu suất hấp thụ thuốc vào màng khác nhau: - VLC (0,3 cm): Khi cho VLC hấp thu thuốc giờ, 1,5 giờ, khối lƣợng thuốc hấp thụ đƣợc vào VLC lần lƣợt là: 1,766 mg; 1,782 mg; 1,785 mg Hiệu suất hấp thụ thuốc đƣợc vào VLC lần lƣợt là: 88,29%; 89,1%; 89,23% - VLC (0,5 cm): Khi cho VLC hấp thu thuốc giờ, 1,5 giờ, khối lƣợng thuốc hấp thụ đƣợc vào VLC lần lƣợt là: 1,743 mg; 1,746 mg; 1,747 mg Hiệu suất hấp thụ thuốc đƣợc vào VLC lần lƣợt là: 87.15%; 87,31%; 87,37% Cùng độ dày màng, cho VLC hấp thụ thuốc NS khối lƣợng thuốc hiệu suất hấp thụ thuốc NS vào VLC thấp Khối lƣợng thuốc hiệu suất hấp thụ thuốc NS vào VLC cao cho VLC hấp thụ thuốc Trong khoảng thời gian để VLC hấp thụ thuốc, độ dày VLC có ảnh hƣởng đến khối lƣợng hiệu suất thuốc NS hấp thụ vào VLC: - VLC hấp thụ thuốc giờ, khối lƣợng hiệu suất thuốc nạp vào VLC ( 0,3cm), VLC (0,5cm) lần lƣợt là: 1,766mg; 1,743mg; 88,29%; 87,15% - Khi cho VLC hấp thụ thuốc 1,5 giờ, khối lƣợng hiệu suất thuốc nạp vào VLC lần lƣợt là: 1,782mg; 1,746mg; 89,1%; 87, 31% - Khi cho VLC hấp thụ thuốc giờ, khối lƣợng hiệu suất thuốc nạp vào VLC lần lƣợt là: 1,785mg; 1,747mg; 89,23%; 87,37% 22 Nhƣ vậy, thời gian hấp thụ thuốc VLC (0,3cm) hấp thụ thuốc cao VLC (0,5cm) Kết thấy tƣơng tự nghiên cứu tác giả Bùi Thị Huyền Trang [3], Hoàng Xuân Thủy [6] 23 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Sau hồn thành xong khóa luận, thu đƣợc kết nhƣ sau: Nuôi cấy thu đƣợc VLC từ G xylinum môi trƣờng nƣớc dừa già - Xử lý, thu đƣợc VLC tinh khiết với độ dày 0,3 cm 0,5 cm VLC ( 0,3 cm) hấp thụ thuốc cao VLC (0,5 cm) giờ, 1,5 giờ, Sự hấp thụ thuốc NS VLC đạt hiệu suất nạp thuốc cao 89,23% với điều kiện: độ dày màng 0,3 cm, chế độ lắc 180 vòng, thời gian hấp thụ thuốc 120 phút 400c Sự hấp thụ thuốc NS VLC đạt hiệu suất nạp thuốc thấp 87,15% với điều kiện: độ dày màng 0,5 cm, chế độ lắc 180 vòng, thời gian hấp thụ thuốc 60 phút 400c Kiến nghị Tiếp tục nghiên cứu khả hấp thụ thuốc NS VLC từ chủng G xylinus, mơi trƣờng khác nhƣ: nƣớc mía, rỉ đƣờng,… Tiếp tục nghiên cứu khả hấp thụ loại thuốc khác VLC nhằm tăng tác dụng loại thuốc 24 TÀI LIỆU THAM KHẢO Bộ Y tế (2007), Dƣợc thƣ quốc gia Việt Nam, Nxb Y học Bộ Y tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, NXB Y học, trang 450- 452 Bùi Thị Huyền Trang (2017), “Nghiên cứu khả hấp thụ thuốc famotidin màng cellulose vi khuẩn lên men từ môi trƣờng nƣớc dừa già” Đinh Thị Kim Nhung (2012), Nghiên cứu thu nhận màng cellulose từ vi khuẩn Acetobacter, ứng dụng trị bỏng, đề tài trọng điểm cấp Bộ giai đoạn 2010 – 2012 Đinh Thị Kim Nhung, Nguyễn Thị Thuỳ Vân, Trần Nhƣ Quỳnh (2012), “Nghiên cứu vi khuẩn Acetobacter tạo màng Bacterial cellulose ứng dụng điều trị bỏng”, Tạp chí Khoa học Hoàng Xuân Thủy (2018), “Nghiên cứu khả hấp thụ thuốc captopril màng cellulose vi khuẩn lên men từ môi trƣờng nƣớc dừa già” Huỳnh Thị Ngọc Lan, Nguyễn Văn Thanh (2006), Nghiên cứu đặc tính màng cellulose vi khuẩn từ Acetobacter xylinum sử dụng làm màng trị bỏng, Tạp chí Dƣợc học, 361, 18 – 20 Nguyễn Văn Mùi (2001), Thực hành Hóa sinh học, Nxb Đại học Quốc gia Hà Nội Nguyễn Văn Thanh (Chủ nhiệm) (2006), “Nghiên cứu chế tạo màng cellulose trị bỏng từ Acetobacter xylinum”, Đề tài KH&CN cấp Bộ, Bộ Y tế 10 Nguyễn Xuân Thành, Triệu Nguyên Trung, Phan Thị Huyền Vy, Bùi Minh Thy, Phùng Thị Kim Huệ, (2018) “Tối ƣu hóa hiệu suất nạp thuốc famotidin vật liệu cellulose vi khuẩn lên men từ dịch trà xanh theo phƣơng pháp đáp ứng bề mặt mơ hình Box-Behnken”, Tạp chí dƣợc học (501), trang Công nghệ (50), trang 453-462 11 Phạm Tiệp Vũ Ngọc Thúy (2009), Thuốc biệt dược cách sử dụng, NXB Y Hà Nội, trang 639 25 12 Phan Thị Thu Hồng cộng (2015), “Sử dụng cellulose tổng hợp từ vi khuẩn Acetobacter xylinum để chế tạo vật liệu nhựa composite sinh học nhựa polyvinyl alcohol”, Tạp chí phát triển KH&CN, 18 (4), trang 114-124 13 Alguacil J et al (2015), “Binding thermodynamics of paromomycin, neomycin, neomycin-dinucleotide and - diPNA conjugates to bacterial and human rRNA”, J Mol Recognit 14 drug Almeida I.F et al (2014), “Bacterial cellulose membranes as delivery systems: An in vivo skin compatibility study”, European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 86(3), 332-336 15 Amita H Patel L and Riddhi M Dave (2015), “Formulation anh evaluation of sustained release in situ ophthalmic gel of neomycin sulphate”, Bulletin of Pharmaceutical Research ;5(1):1-5 16 have Armando JD et al (2014),”Do bacterial cellulose membranes potential in drug-delivery systems”, Expert Opin 17 the Blanchard C et al (2015), “Neomycin Sulfate Improves Antimicrobial Activity of Mupirocin-based Antibacterial Ointments”, Antimicrob Agents Chemother, pii: AAC,02083-15 18 Brown R.M (1999), Pure Appl Chem 71 19 Bworm E (2007), Bacterial cellulose Thermoplastic polymer namocomposites, Master of sciencein chaemical engineering, washington state university 20 Czaja W et al (2006), “Microbial cellulose – the natural power to heal wounds”, Biomaterials, 27, 145–151 21 Czaja W., Young D.J., Kawecki M., Browm R.M (2007) “The future prospects of microbial cellulose in biomedical applications” Biomacromolecules, 8:1–12 22 Fontana J.D., et al (1990), “Acetobacter cellulose pellicle as a temporary skin substitute”, Appl Biochem Biotechnol, 24–25:253–264 23 Fukuda M, et al (2008), “Cimetidine inhibits salivary gland tumor cell adhesion to neural cells and induces apoptosis by blocking NCAM expression”, Cancer, 10(2407), – 376 26 24 Hestrin, S.; Schramm, M (1954) "Synthesis of cellulose by Acetobacter xylinum: II Preparation of freeze – dried cells capable of polymerizing glucose to cellulose" Biochem J 58 (2): 345–352 Jong S.C et al (2015), “Novel neomycin sulfate-loaded hydrogel dressing with enhanced physical dressing properties and wound-curing effect”, Drug Deliv 25 26 Klemm D et al (2009), “Nanocellulose materials – different cellulose, different functionality”, Macromol Symp, 280, 60–71 27 Mohd C., et al - Bacterial Cellulose Film Coating as Drug Delivery System 28 Muhammad MA et al (2014), “A review of bacterial cellulosebased drug delivery systems: their biochemistry, current approaches and future prospects”, Journal of Pharmacy and Pharmacology, 66, pp 1047– 1061 29 Nguyen TX et al (2014), “Chitosan - coated nano - liposomes for the oral delivery of berberine hydrochloride”, J Mater Chem B, 2, 7149 – 7159 30 P.A Harris, IM Leigh and HA Navsaria (1998), “The future for cultured Skin Replacements Buns”, 24 (7), 453 – 457 31 Pedersoli WM et al (1994), “Disposition and bioavailability of neomycin in Holstein calves”, J Vet Pharmacol Ther 17(1),5-11 32 Selman A., Waksman (1949), "Neomycin-production and antibiotic properties" Journal of Clinical Investigation 28 (5): 934 33 Selman A., Waksman (1949), "Neomycin-production and antibiotic properties" Journal of Clinical Investigation 28 (5): 934 34 Wei B et al (2011), “ Preparation and evaluation of a kind of bacterial cellulose dry films with antibacterial properties”, Carbohydr Polym , 84, 533–538 27 ... ===  === HOÀNG THỊ QUỲNH NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG HẤP THỤ THUỐC NEOMYCIN SULFATE CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE TẠO RA TỪ GLUCONACETOBACTER XYLINUS NUÔI CẤY TRONG MÔI TRƢỜNG NƢỚC DỪA GIÀ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP... cellulose tạo từ Gluconacetobacter xylinus nuôi cấy môi trƣờng nƣớc dừa già” Mục đích nghiên cứu Tạo VLC từ mơi trƣờng nƣớc dừa già để hấp thụ thuốc NS, nhằm tăng khả hấp thụ thuốc vào VLC tối đa, từ. .. phụ thuốc, tăng khả thẩm thấu thuốc qua da để thuốc hấp thụ vào thể tốt nhất, rút ngắn thời gian điều trị bệnh Đó lí mà chọn đề tài: ? ?Nghiên cứu khả hấp thụ thuốc Neomycin sulfate vật liệu cellulose