Sàng lọc và phân tích đặc điểm phân tử các đột biến FLT3 xuất hiện trên bệnh nhân mắc bệnh ung thư bạch cầu cấp dòng tủy ở việt nam 14

Luận văn thạc sĩ Đỗ Thị Thanh Trung ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Đỗ Thị Thanh Trung SÀNG LỌC VÀ PHÂN TÍCH ĐẶC ĐIỂM PHÂN TỬ CÁC ĐỘT BIẾN FLT3 XUẤT HIỆN TRÊN BỆNH NHÂN MẮC BỆNH UNG THƢ BẠCH CẦU CẤP DÒNG TỦY Ở VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – Năm 2014 Luận văn thạc sĩ Đỗ Thị Thanh Trung ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Đỗ Thị Thanh Trung SÀNG LỌC VÀ PHÂN TÍCH ĐẶC ĐIỂM PHÂN TỬ CÁC ĐỘT BIẾN FLT3 XUẤT HIỆN TRÊN BỆNH NHÂN MẮC BỆNH UNG THƢ BẠCH CẦU CẤP DÒNG TỦY Ở VIỆT NAM Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS PHẠM BẢO YÊN Hà Nội – Năm 2014 Lời cảm ơn Luận văn thạc sĩ Đỗ Thị Thanh Trung Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Phạm Bảo Yên người tận tình hướng dẫn bảo em suốt trình học tập thực luận văn Em xin chân thành cảm ơn thầy cô Bộ môn Sinh lý thực vật Hóa sinh, khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên tạo điều kiện sở vật chất cho em hoàn thành luận văn Em cảm ơn giúp đỡ tạo điều kiện vật chất trang thiết bị từ Phịng Enzym học Phân tích hoạt tính Sinh học, Phịng thí nghiệm Trọng điểm Cơng nghệ protein enzyme Đề tài thực có hỗ trợ kinh phí đề tài: “Thiết lập quy trình phát số đột biến gen FLT3, NPM1 CEBPA gây bệnh ung thư bạch cầu cấp dòng tủy bệnh nhân Việt Nam” mã số KLEPT.12.02 Phịng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệEnzyme Protein, Đại học Quốc gia Hà Nội Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình, bạn bè, người thân bên cạnh động viên, chia sẻ giúp đỡ em Em xin chân thành cảm ơn! Học viên Đỗ Thị Thanh Trung Luận văn thạc sĩ Đỗ Thị Thanh Trung MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Bệnh ung thƣ bạch cầu cấp dòng tủy (Acute Myeloid Leukemia-AML) 1.1.1 Thực trạng bệnh ung thư bạch cầu cấp dịng tủy tình hình nghiên cứu giới Việt Nam .5 1.1.2 Phân loại thể bệnh ung thư bạch cầu cấp dòng tủy .12 1.1.3 Các phương pháp chẩn đoán bệnh AML 13 1.1.4 Hướng điều trị người bệnh ung thư bạch cầu cấp dòng tủy 14 1.2 Gen FLT3 liên quan tới bệnh bạch cầu cấp dòng tủy .19 1.2.1 Cấu trúc chức gen FLT3 19 1.2.2 Các loại đột biến FLT3 20 1.2.3 Mối liên hệ đột biến gen FLT3 bệnh bạch cầu cấp dòng tủy21 1.2.4 Ý nghĩa việc nghiên cứu gen FLT3 chẩn đoán điều trị AML 22 CHƢƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 24 2.1 Nguyên liệu 24 2.1.1 Mẫu máu 24 2.1.2 Các hóa chất kit 24 2.1.3 Máy móc thiết bị 25 2.2 Phƣơng pháp 26 2.2.1 Tách DNA tổng số từ mẫu máu 26 2.2.2 Thiết kế cặp mồi đặc hiệu nhân đoạn gen có đột biến 27 i Luận văn thạc sĩ Đỗ Thị Thanh Trung 2.2.3 Nhân đoạn gen FLT3chứa đột biến với cặp mồi đặc hiệu phản ứng chuỗi polymerase (PCR) 27 2.2.4 Điện di agarose acrylamide để phân tích phổ băng đột biến .28 2.2.6 Nhân dịng đoạn gen FLT3 đọc trình tự gen phương pháp Sanger 28 2.2.7 Một số phần mềm sử dụng luận văn 30 CHƢƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 31 3.1 Thu thập tách chiết ADN hệ gen từ mẫu máu tổng số 31 3.2 Thiết kế tối ƣu quy trình phát đột biến gen FLT3-ITD 32 3.2.1 Thiết kế trình tự mồi 32 3.2.2 Thiết kế tối ưu quy trình phát đột biến FLT3-ITD 33 3.3 Bƣớc đầu sàng lọc quy mơ phịng thí nghiệm 36 3.4 Kết đƣa sản phẩm PCR vào vectơ tái tổ hợp 37 3.5 Phân tích đặc điểm phân tử đột biến gen FLT3-ITD 40 3.5.1 Số lượng đột biến gen FLT3-ITD mẫu (số đột biến/mẫu) 40 3.5.2 Kích thước đột biến 40 3.5.3 Trình tự đột biến 44 3.5.4 Mức độ đột biến 45 KẾT LUẬN 47 KIẾN NGHỊ 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 ii Luận văn thạc sĩ Đỗ Thị Thanh Trung Bảng 1.1 Bảng 1.2 Bảng 2.1 Bảng 3.1 Bảng 3.2 Bảng 3.3 Bảng 3.4 Bảng 3.5 Bảng 3.6 Hình 1.1 Hình 1.2 Hình 1.3 Hình 1.4 Hình 2.1 Hình 3.1 Hình 3.2 Hình 3.3 Hình 3.4 Hình 3.5 Hình 3.6 Hình 3.7 Hình 3.8 iii Luận văn thạc sĩ Đỗ Thị Thanh Trung DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu, chữ viết tắt ALL AML AML-NK ATP ATRA BAALC CBF CEBPA CLL CML-BC ERG FAB FDA FLK2 FLT3 IDH ITD JM KIT MLL iv Luận văn thạc sĩ Đỗ Thị Thanh Trung MM NPM1 PCR RFLP SSCP STI571 STK1 TKD TKIs TM WHO v Luận văn thạc sĩ 29 Đỗ Thị Thanh Trung Kronke J., Bullinger L., Teleanu V., Tschurtz F., Gaidzik V.I., Kuhn M.W., Rucker F.G., Holzmann K., Paschka P., Kapp-Schworer S., et al (2013), “Clonal evolution in relapsed NPM1-mutated acute myeloid leukemia”, Blood, 122 (1), pp 100-108 30 Lee B.H., Tothova Z., Levine R.L., Anderson K., Buza-Vidas N., Cullen D.E., Mcdowell E.P., Adelsperger J., Frohling S., Huntly B.J., Beran M., Jacobsen S.E., and Gilliland D.G (2007), “FLT3 mutations confer enhanced proliferation and survival properties to multipotent progenitors in a murine model of chronic myelomonocytic leukemia”, Cancer cell, 12 (4), pp 367380 31 Lin L.I., Chen C.Y., Lin D.T., Tsay W., Tang J.L., Yeh Y.C., Shen H.L., Su F.H., Yao M., Huang S.Y., and Tien H.F (2005), “Characterization of CEBPA mutations in acute myeloid leukemia: most patients with CEBPA mutations have biallelic mutations and show a distinct immunophenotype of the leukemic cells”, Clinical Cancer Research, 11 (4), pp 1372-1379 32 Lu C., Ward P.S., Kapoor G.S., Rohle D., Turcan S., Abdel-Wahab O., Edwards C.R., Khanin R., Figueroa M.E., Melnick A., Wellen K.E., O'rourke D.M., Berger S.L., Chan T.A., Levine R.L., Mellinghoff I.K., and Thompson C.B (2012), “IDH mutation impairs histone demethylation and results in a block to cell differentiation”, Nature, 483 (7390), pp 474-478 33 Ly B.T.K., Chi H.T., Yamagishi M., Kano Y., Hara Y., Nakano K., Sato Y., and Watanabe T (2013), “Inhibition of FLT3 expression by green tea catechins in FLT3 mutated-AML cells”, PLoS ONE, (6), pp 1-9 34 Malek S.N., Update on the molecular biology of myelogenous leukemia: clinical implications 2011: American Society of Clinical Oncology p 231-236 35 Marcucci G., Maharry K., Wu Y.Z., Radmacher M.D., Mrozek K., Margeson D., Holland K.B., Whitman S.P., Becker H., Schwind S., et al (2010), “IDH1 and IDH2 gene mutations identify novel molecular subsets within de 52 Luận văn thạc sĩ Đỗ Thị Thanh Trung novo cytogenetically normal acute myeloid leukemia: a Cancer and Leukemia Group B study”, Journal of Clinical Oncology, 28 (14), pp 23482355 36 Meshinchi S and Appelbaum F.R (2009), “Structural and functional alterations of FLT3 in acute myeloid leukemia”, Clinical Cancer Research, 15 (13), pp 4263-4269 37 R.B., Meshinchi S., Stirewalt D.L., Alonzo T.A., Boggon T.J., Gerbing Rocnik J.L., Lange B.J., Gilliland D.G., and Radich J.P (2008), “Structural and numerical variation of FLT3/ITD in pediatric AML”, Blood, 111 (10), pp 4930-4933 38 Murphy K.M., Levis M., Hafez M.J., Geiger T., Cooper L.C., Smith B.D., Small D., and Berg K.D (2003), “Detection of FLT3 internal tandem duplication and D835 mutations by a multiplex polymerase chain reaction and capillary electrophoresis assay”, Journal of Molecular Diagnostic, (2), pp 96-102 39 Kufe Nadler L.M., Stashenko P., Hardy R., Kaplan W.D., Button L.N., D.W., Antman K.H., and Schlossman S.F (1980), “Serotherapy of a patient with a monoclonal antibody directed against a human lymphoma-associated antigen”, Cancer research, 40 (9), pp 3147-3154 40 Nakao M., Janssen J.W., Erz D., Seriu T., and Bartram C.R (2000), “Tandem duplication of the FLT3 gene in acute lymphoblastic leukemia: a marker for the monitoring of minimal residual disease”, Leukemia, 14 (3), pp 522-524 41 Noguera N.I., Ammatuna E., Zangrilli D., Lavorgna S., Divona M., Buccisano F., Amadori S., Mecucci C., Falini B., and Lo-Coco F (2005), “Simultaneous detection of NPM1 and FLT3-ITD mutations by capillary electrophoresis in acute myeloid leukemia”, Leukemia, 19 (8), pp 14791482 53 Luận văn thạc sĩ 42 Đỗ Thị Thanh Trung Pressman D and Korngold L (1953), “The in vivo localization of anti-Wagner-osteogenic-sarcoma antibodies”, Cancer, (3), pp 619-623 43 Ravandi F., Alattar M.L., Grunwald M.R., Rudek M.A., Rajkhowa T., Richie M.A., Pierce S., Daver N., Garcia-Manero G., Faderl S., et al (2013), “Phase study of azacytidine plus sorafenib in patients with acute myeloid leukemia and FLT-3 internal tandem duplication mutation”, Blood, 121 (23), pp 46554662 44 Renneville A., Roumier C., Biggio V., Nibourel O., Boissel N., Fenaux P., and Preudhomme C (2008), “Cooperating gene mutations in acute myeloid leukemia: a review of the literature”, Leukemia, 22 (5), pp 915-931 45 Schnittger S., Schoch C., Dugas M., Kern W., Staib P., Wuchter C., Loffler H., Sauerland C.M., Serve H., Buchner T., Haferlach T., and Hiddemann W (2002), “Analysis of FLT3 length mutations in 1003 patients with acute myeloid leukemia: correlation to cytogenetics, FAB subtype, and prognosis in the AMLCG study and usefulness as a marker for the detection of minimal residual disease”, Blood, 100 (1), pp 59-66 46 Small D (2006), “FLT3 mutations: biology and treatment”, American Society of Hematology, pp 178-184 47 Steudel C., Wermke M., Schaich M., Schäkel U., Illmer T., Ehninger G., and Thiede C (2003), “Comparative analysis of MLL partial tandem duplication and FLT3 internal tandem duplication mutations in 956 adult patients with acute myeloid leukemia”, Genes, Chromosomes and Cancer, 37 (3), pp 237-251 48 M.L., Stirewalt D.L., Kopecky K.J., Meshinchi S., Appelbaum F.R., Slovak Willman C.L., and Radich J.P (2001), “FLT3, RAS, and TP53 mutations in elderly patients with acute myeloid leukemia”, Blood, 97 (11), pp 35893595 49 Stirewalt D.L and Radich J.P (2003), “The role of FLT3 in haematopoietic malignancies”, Nature Reviews Cancer, (9), pp 650-665 54 Luận văn thạc sĩ 50 Đỗ Thị Thanh Trung Tallman M.S (2005), “New strategies for the treatment of acute myeloid leukemia including antibodies and other novel agents”, Hematology / the Education Program of the American Society of Hematology American Society of Hematology Education Program, pp 143150 51 Thiede C., Steudel C., Mohr B., Schaich M., Schakel U., Platzbecker U., Wermke M., Bornhauser M., Ritter M., Neubauer A., Ehninger G., and Illmer T (2002), “Analysis of FLT3-activating mutations in 979 patients with acute myelogenous leukemia: association with FAB subtypes and identification of subgroups with poor prognosis”, Blood, 99 (12), pp 43264335 52 Vardiman J.W., Harris N.L., and Brunning R.D (2002), “The World Health Organization (WHO) classification of the myeloid neoplasms”, Blood, 100 (7), pp 2292-2302 53 Vardiman J.W., Thiele J., Arber D.A., Brunning R.D., Borowitz M.J., Porwit A., Harris N.L., Le Beau M.M., Hellstrom-Lindberg E., Tefferi A., and Bloomfield C.D (2009), “The 2008 revision of the World Health Organization (WHO) classification of myeloid neoplasms and acute leukemia: rationale and important changes”, Blood, 114 (5), pp 937-951 54 Yamamoto Y., Kiyoi H., Nakano Y., Suzuki R., Kodera Y., Miyawaki S., Asou N., Kuriyama K., Yagasaki F., Shimazaki C., et al (2001), “Activating mutation of D835 within the activation loop of FLT3 in human hematologic malignancies”, Blood, 97 (8), pp 2434-2439 Website: 55 https://www.healthbase.com/hb/cm/leukemia-leukaemia-types- acute-chronic-symptoms-treatment-chemotherapy-radiotherapyimmunotherapy-stem-cell-transplant-targeted-therapy-cost-abroad-medicaltourism.html 55 Luận văn thạc sĩ 56 Đỗ Thị Thanh Trung http://www.webmd.com/cancer/tc/leukemia-topic-overview 56 Luận văn thạc sĩ Đỗ Thị Thanh Trung PHỤ LỤC ́ KÊT QUẢĐO NANODROP AND TỔNG SỐ MẪU 1-36 STT Mẫu 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 Luận văn thạc sĩ Đỗ Thị Thanh Trung PHỤ LỤC ́ KÊT QUẢĐO NANODROP AND TỔNG SỐ MẪU 37-123 STT Mẫu 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 Luận văn thạc sĩ Đỗ Thị Thanh Trung 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 Luận văn thạc sĩ Đỗ Thị Thanh Trung Luận văn thạc sĩ Đỗ Thị Thanh Trung PHỤ LỤC ́ KÊT QUẢĐO NANODROP AND TỔNG SỐ MẪU 124-208 Luận văn thạc sĩ Đỗ Thị Thanh Trung Luận văn thạc sĩ Đỗ Thị Thanh Trung ... phân tử đột biến FLT3 xuất bệnh nhân mắc bệnh ung thƣ bạch cầu cấp dòng tủy Việt Nam? ??với mục tiêu: Thiết lập quy trình sàng lọc đột biến FLT3- ITD bệnh nhân ung thư bạch cầu cấp dòng tủy Bước... thư bạch cầu chia làm bốn loại chính: bệnh ung thư bạch cầu cấp dòng tủy (AML), bệnh ung thư bạch cầu cấp dòng lympho (ALL), bệnh ung thư bạch cầu mãn tính dịng lympho (CLL) ,bệnh ung thư bạch cầu. .. trình xây dựng để sàng lọc đột biến FLT3- ITD bệnh nhân ung thư bạch cầu cấp dịng tủy quy mơ phịng thí nghiệm Luận văn thạc sĩ Đỗ Thị Thanh Trung Phân tích đặc điểm phân tử đột biến FLT3- ITD tìm CHƢƠNG