Thông tin tài liệu
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN -- Nguyêñ Hồng Nhung NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỔI SỐ LƢỢNG BẢN SAO ADN TI THỂ Ở BỆNH NHÂN UNG THƢ VÚ LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội-2015 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN -- Nguyêñ Hồng Nhung NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỔI SỐ LƢỢNG BẢN SAO ADN TI THỂ Ở BỆNH NHÂN UNG THƢ VÚ Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS Trịnh Hồng Thái TS Đỗ Minh Hà Hà Nội-2015 LỜI CẢM ƠN Lời em xin chân thành bày tỏ lòng cảm ơn kính trọng sâu sắc thầy, PGS TS Trịnh Hồng Thái, người tận tình hướng dẫn em suốt trình học tập thực luận văn Thầy mở cho em vấn đề khoa học lý thú, hướng em vào nghiên cứu lĩnh vực thiết thực vơ bổ ích, đồng thời tạo điều kiện thuận lợi cho em học tập nghiên cứu Em học hỏi nhiều Thầy phong cách làm việc, phương pháp nghiên cứu khoa học Em xin trân trọng cảm ơn đến TS Đỗ Minh Hà thầy giáo, cô giáo khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, đặc biệt thầy cô giáo môn Sinh lý Thực vật Hóa sinh học tận tình giảng dạy dìu dắt tơi suốt thời gian học tập trường Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới anh chị tận tình giúp đỡ bảo tơi suốt q trình học tập thực luận văn Phòng Proteomics Sinh học Cấu trúc thuộc Phịng thí nghiệm Trọng điểm Cơng nghệ Enzyme Protein, bạn học viên cao học em sinh viên làm việc phòng, người làm tôi, bên lúc thất bại hay lúc thành cơng Trong q trình thực đề tài, nhận giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi PTNTĐ Công nghệ Enzym Protein, Trường Đại học KHTN, giúp đỡ cán nhân viên thuộc khoa Tế bào Giải phâũ bênḥ , bệnh viện K, Hà Nội việc cung cấp mẫu nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn Luận văn thực phạm vi nội dung kinh phí củađề tài cấp nhà nước (mã số KC.04.10/11-15) Tôi xin chân thành cảm ơn Con xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Bố, Mẹ người đãv ất vả nuôi khôn lớn daỵ hocc̣ làm người , cảm ơn ông bà, cô chú… người thân con, người ln dành tình cảm lời động viên Và cuối xin cảm ơn bạn bè , người ủng hô vc̣ giúp đỡ Hà Nội, tháng năm 2015 Học viên Nguyễn Hồng Nhung ADN APS ARN ATP AcN Bp cs EDTA EtBr HCC HPLC MT/mt mtADN nADN PCR Smac/DIABLO TEA TEAA tARN rARN Bảng Bảng Bảng Bảng Bảng Bảng Bảng Bảng Bảng Bảng 10 Bảng 11 Hình Hình Hình Hình Hình Hình Hình Hình Hình Hình 10 Hình 11 Hình 12 Hình 13 Hình 14 Hình 15 Hình 16 Hình 17 Hình 18 Hình 19 Hình 20 Hình 21 MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chƣơng - TỔNG QUAN 1.1.TỔNG QUAN VỀ TI THỂ 1.1.1 Cấu trúc và chức ti thể 1.1.2 Những biến đổi ti thể và bệnh ung thƣ 1.2.TỔNG QUAN VỀ UNG THƢ VÚ 1.2.1 Phân loại ung thƣ vú 1.2.2 Các giai đoạn ung thƣ vú 1.2.3 Các yếu tố nguy 1.3.NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỔI SỐ LƢỢNG BẢN SAO ADN TI THỂ Ở BỆNH NHÂN UNG THƢ VÚ 1.4.CÁC PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG ADN TI THỂ Chƣơng - ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƢỢNG 2.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu 2.1.2 Hóa chất 2.1.3 Dụng cụ 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1 Tách chiết ADN tổng số 2.2.2 Thiết kế cặp mồi cho phản ứng PCR đa mồi phục vụ mục đích định lƣợng: 2.2.3 Định lƣợng ADN HPLC và phần mềm ImageJ 2.2.4 Tính toán thống kê Chƣơng – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 TÁCH CHIẾT ADN TỔNG SỐ TỪ MÔ 3.2 THIẾT KẾ CÁC CẶP PRIMER CHO PHẢN ỨNG PCR ĐA MỒI 3.3 KẾT QUẢ ĐỊNH LƢỢNG ADN BẰNG PHƢƠNG PHÁP HPLC VÀ PHÂN TÍCH HÌNH ẢNH IMAGEJ KẾT LUẬN KIẾN NGHỊ PHỤ LỤC Dựa mức độ biệt hóa, mức độ xâm lấn, hạch di và giai đoạn bệnh chúng tơi khơng tìm thấy khác biệt có ý nghĩa thống kê nhóm Điều này khơng tƣơng đồng với kết mà Xia và cs (2009) có tƣợng biến đổi số lƣợng mtADN giai đoạn bệnh với p < 0,05 [35] Ở bệnh nhân u xơ vú, chúng tơi khơng tìm thấy khác biệt đáng kể nào số lƣợng mtADN mẫu máu và mẫu mơ bệnh nhân Cũng khơng có sai khác mẫu mô u xơ và mẫu mô ung thƣ Hiện nay, Việt Nam, chƣa có nghiên cứu nào biến đổi số lƣợng ADN ti thể ung thƣ vú nói riêng và loại ung thƣ khác nói chung, là hƣớng có tiềm cho việc tìm thị sinh học bệnh ung thƣ Bên cạnh đó, cần tăng số lƣợng mẫu nghiên cứu và kết hợp với phƣơng pháp định lƣợng khác nhƣ PCR định lƣợng, kết hợp điều tra với mẫu mô khác nhƣ mẫu máu để khẳng đinḥ kết quảnghiên cƣƣ́u và tăng khả ứng dụng thực tiễn 51 KẾT LUẬN Qua kết thu đƣợc từ phân tích biến đổi số ADN ti thể bệnh nhân ung thƣ vú nguyên phát, rút số kết luận sau: Đã tách chiết thành công 132 mẫu ADN tổng số 46 bệnh nhân ung thƣ vú (gồm mẫu u và mẫu lân cận u) và 20 bệnh nhân u xơ vú (mẫu mô và máu) Sự giảm số lƣợng ADN ti thể có liên quan tới hình thành khối u và có liên quan đến tuổi bệnh nhân ung thƣ vú Ngƣợc lại, số lƣợng ADN ti thể tăng theo kích thƣớc khối u Bằng kỹ thuật HPLC và ImageJ phân tích đƣợc biến đổi số lƣợng ADN ti thể mẫu, HPLC là kỹ thuật định lƣợng xác, cịn ImageJ là kỹ thuật định lƣợng nhanh, hiệu và tốn 52 KIẾN NGHỊ Từ trình nghiên cứu thực tế đƣa số kiến nghị sau: Tiếp tục phân tích tƣợng biến đổi số lƣợng ADN ti thể với mẫu ADN tách từ mô bệnh nhân ung thƣ vúvới số lƣợng mẫu lớn Tiến hành phân tích tƣợng biến đổi số lƣợng ADN ti thể với mẫu ADN tách từ máu vàmô vúc bệnh nhân ung thƣ vú nhằm tìm mối tƣơng quan chúng, phục vụ cho chẩn đoán bệnh dựa vào mẫu ADN máu Kết hơpg̣ với phƣơng pháp đ ịnh lƣợng khác đ ể khẳng định kết quả, góp phần timƣ̀ chỉthi sinḥ hocg̣ cho chẩn đoán vàđiều tri bệnḥ ung thƣ vú 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Anh: Alonso A, Martin P, Albarran C, Aquilera B, Garcia O, Guzman A, Oliva H, Sancho M (1997), “Detection of somatic mutations in the mitochondrial DNA control region of colorectal and gastric tumors by heteroduplex and single-strand conformation analysis”, Electrophoresis, 18, pp.682-685 Anderson S., Bankier A T., Barrell B G., de Bruijn M H L., Coulson A R., Drouin J., Eperon I C., Nierlich D P., Roe B A., Sanger F., Schreier P H., Smith A J H., Staden R & Young I G (1981), “Sequence and organization of the human mitochondrial genome”, Nature, 290, pp.457-465 Bassam B J., Caetano-Anollés G and Gresshoff P M (1991), “Fast and sensitive silver staining of DNA in polyacrylamide gels”, Anal Biochem, 196 (1), pp.80-83 Bianchi M., Bianchi N and Bailliet G (1995), “Mitochondrial DNA mutations in normal and tumor tissues from breast cancer patients”, Cytogenet Cell Genet, 71, pp.99-103 Carew J and Huang P (2002), “Mitochondrial defects in cancer”, Mol Cancer, 12, pp.1-12 Chester K.A., Robson L., Begent R.H., Pringle H., Primrose L., Talbot I.C., Macpherson A.J., Owen S.L., Boxer G., Malcolm A.D (1990), “In situ and slot hybridization analysis of RNA in colorectal tumours and normal colon shows distinct distributions of mitochondrial sequences”, J Pathol, 162, pp.309-315 Dimauro S (2007), “Mitochondrial DNA medicin”, Biosci Rep, 27 (1–3), pp.5-9 DiMauro S and Schon E (2001), “Mitochondrial DNA mutations in human disease”, Am J Med Genet, 106, pp.18-26 Hileman E.O., Achanta G., Huang P (2001), “Superoxide dismutase: an emerging target for cancer therapeutics”, Expert Opin Ther Targets, 5, pp.697-710 54 10 Hockenbery D (2002), “A mitochondrial achilles heel in cancer?”, Cancer Cell, 2, pp.1-2 11 Jerónimo C., Nomoto S., Caballero O.L., Usadel H., Henrique R., VarzimG., OliveiraJ., Lopes C., Fliss MS Sidransky D (2001), “Mitochondrialmutations in earlystageprostatecancer and bodily fluids”, Oncogene, 20, pp.5195-5198 12 King MP., Attardi G (1989), “Human cells lacking mtDNA: repopulation with exogenous mitochondria by complementation”, Science , 246, pp.500503 13 Kornburg H (1987), "Tricarboxylic acid cycles," Bioessays , 7, pp 236-238 14 Lightowlers R.N., Chinnery P.F., Turnbull D.M & Howell N (1997), “Mammalian mitochondrial genetics, heredity, heteroplasmy and disease”, Trends Genet, 13, pp.450–455 15 Lin C.S., Wang L.S., Tsai C.M., and Wei Y.H (2008), “Low copy number and low oxidative damage of mitochondrial DNA are associated with tumor progression in lung cancer tissues after neoadjuvant chemotherapy” Interact Cardiovasc Thorac Surg., (6), pp.954-958 16 Liu V.W., Shi H.H., Cheung A.N., Chiu P.M., Leung T.W., Nagley P., Wong L.C., Ngan H.Y (2001), “ High incidence of somatic mitochondrial DNA mutations in human ovarian carcinomas”, Cancer Res, 61, pp.5998-6001 17 Liu X., Kim C., Yang J., Jemmerson R and Wang X (1996) , "Induction of apoptotic program in cell-free extracts: requirement for dATP and cytochrome c", Cell , 86, pp.147-157 18 Marchington D.R., Macaulay V., Hartshorne G.M., Barlow D & Poulton J (1998), “Evidence from human oocytes for a genetic bottleneck in an mtDNA disease”, Am J Hum Genet, 63, pp.769–775 19 Modica-Napolitano J.S., Singh K.K (2002), “Mitochondria as targets for detection and treatment of cancer”, Exp Rev Mol Med, (9), pp 1-19 55 20 Montoya J., Ojala D., Attardi G (1981), “Distinctive features of the 5'- terminal sequences of the human mitochondrial mRNAs”, Nature, 290 (5806), pp.465-70 21 Parrella P., Xiao Y., Fliss M., Sanchez-Cespedes M., Mazzarelli P., Rinaldi M., Nicol T., Gabrielson E., Cuomo C., Cohen D., Pandit S., Spencer M., C Rabitti., Fazio VM., Sidransky D (2001), “Detection of mitochondrial DNA mutations in primary breast cancer and fine-needle aspirates”, Cancer Res, 61, pp.7623-7626 22 Pinz KG & Bogenhagen DF (1998) “Efficient repair of abasic sites in DNA by mitochondrial enzymes”, Mol Cell Biol, 18, pp.1257–1265 23 Polyak K., Li Y., Zhu H., Lengauer C., Willson J.K., Markowitz S.D., Trush M.A., Kinzler K.W., Vogelstein B (1998), “Somatic mutations of the mitochondrial genome in human colorectal tumours”, Nat Genet, 20, pp.291293 24 Sharp M.G., Adams S.M, Walker R.A., Brammar W.J., Varley J.M (1992) “Differential expression of the mitochondrial gene cytochrome oxidase II in benign and malignant breast tissue” J Pathol, 168, pp.163-168 25 Shuster R.C., Rubenstein A.J & Wallace D.C (1988), “Mitochondrial DNA in anucleate human blood cells” Biochem Biophys Res, 155, pp.1360-1365 26 Susin S.A., Lorenzo H.K., Zamzami N., Marzo I., Snow B.E., Brothers G.M., Mangion J., Jacotot E Costantini P., Loeffler M., Larochette N., Goodlett D.R., Aebersold R., Siderovski D.P., Penninger J.M., Kroemer G (1999), “Molecular characterization of mitochondrial apoptosis-inducing factor” Nature, 397, pp.441-446 27 Staniek K., Gille L., Kozlov A.V., Nohl H (2002), “Mitochondrial superoxide radical formation is controlled by electron bifurcation to the high and low potential pathways” Free Radic Res, 36, pp.381- 387 28 Taanman J.W., Street R H., and L Nw (1999), “The mitochondrial genome : structure, transcription, translation and replication”, Biochim Biophys Acta, 1410 (2), pp.103-123 56 29 Tan D.J., Bai R.K., Wong L.J (2002), “Comprehensive scanning of somatic mitochondrial DNA mutations in breast cancer”, Cancer Res, 62, pp.972976 30 Thyagarajan B., Wang R., Nelson H., Barcelo H., Koh W and Yuan J (2013), "Mitochondrial DNA copy number is associated with breast cancer risk" PLoS One, 8(6), e65968 31 Wang Y, Liu V.W., Xue W.C., Cheung A.N., Ngan H.Y (2006), “Association of decreased mitochondrial DNA content with ovarian cancer progression”, Br J Cancer, 95, pp.1087-91 32 William L.D., John S.S (2002) “Cancer of the breast”, Elsevier Health Sciences, pp.169-179 33 Wu C.W., Yin P.H., Hung W.Y., Li A.F., Li S.H., Chi C.W., et al (2005), “Mitochondrial DNA mutations and mitochondrial DNA depletion in gastric cancer”, Genes Chromosomes Cancer, 44, pp.19–28 34 Warburg O (1956), “On the origin of cancer cells”, Science, 123, pp.309- 314 35 Xia P., An H., Dang C., Radpour R., Kohler C., Fokas E., Engenhart-Cabilic R., Holzgreve W and Zhong X (2009), “Decreased mitochondrial DNA content in blood samples of patients with stage I breast cancer”, BMC Cancer, 9, pp.454 36 Yamada S., Nomoto S., Fujii T., Kaneko T., Takeda S., Inoue S., et al (2006), "Correlation between copy number of mitochondrial DNA and clinicopathologic parameters of hepatocellular carcinoma", Eur J Surg Oncol, 32, pp.303–7 37 Ye C., Shu X., Wen W., Pierce L., Courtney R., Gao Y., Zheng W and Cai Q (2008), "Quantitative analysis of mitochondrial DNA 4977-bp deletion in sporadic breast cancer and benign breast diseases", Breast Cancer Res Treat, 108 (3), pp.427–34 38 Yin P.H., Lee H.C., Chau G.Y., Wu Y.T., Li S.H., Lui W.Y., Wei Y.H., Liu T.Y., and Chi C.W (2004), “Alteration of the copy number and deletion of 57 mitochondrial DNA in human hepatocellular carcinoma”, Br J Cancer, 90 (12), pp.2390–6 58 39 Yu M., Zhou Y., Shi Y., Ning L., Yang Y., Wei X., N Zhang, X Hao, and Niu R (2007), “Reduced mitochondrial DNA copy number is correlated with tumor progression and prognosis in Chinese breast cancer patients”, IUBMB Life, 59 (7), pp 450–457 Tài liệu trang web 40 http://benhvienk.com/ (20.05.2014) 41 http://breastcancer.about.com/od/types/a/bc_types.htm (30/1/2015) 42 http://www.cancerresearchuk.org/ (12.05.2014) 43 http://www.cancer.org/cancer/breastcancer/detailedguide/breast-cancer-risk- factors 44 http://globocan.iarc.fr/old/FactSheets/cancers/breast-new.asp 59 PHỤ LỤC Phụ lục Danh sách bệnh nhân u xơ số liệu phân tích ImageJ, HPLC Mã STT BN 13477 27215 27222 27236 27237 27241 27253 27257 27263 10 27269 11 27896 12 27901 13 27905 14 27907 15 27908 16 27913 17 27921 18 27927 19 27931 20 27936 60 Phụ lục Danh sách bệnh nhân ung thƣ vú số liệu phân tích ImageJ, HPLC Mã TT Tên BN 8239 Phạm Thị X 8304 Nguyễn Thị H 8625 Nguyễn Thị Ƣ 10073 Nguyễn Thị P 10106 Đoàn Thị B 10193 Ngô Ngọc O 25366 Chu Thị T 25766 Lê Thị N 26136 Ngô Thị C 10 26137 Đào Thị L 11 26300 Bùi Thị C 12 26301 Vũ Thị L 13 26452 Nguyễn Thị T 14 26454 Trƣơng Hồng T 15 26661 Nguyễn Thị Kim A 16 17 26671 26708 Vũ Thi X Nguyễn Thị S 18 27054 Nguyễn Thị T 19 20 27136 27398 Vũ Thị L Nguyễn Thị L 21 27400 Phạm Thị L 22 31249 Hoàng Thị L 23 31250 Vũ Thị D 24 31371 Nguyễn Thị B 25 31403 Nguyễn Thị H 26 31404 Vũ Thị L 27 28 31420 31646 Nguyễn Thị N Phạm Thị T 29 31654 Hoàng Thị M 30 31716 Ngô Thị Diệp H 31 32 31720 31755 Hà Thị C Nguyễn Thị T 33 32009 Dƣơng Thị N 34 32427 Vũ Thị P 35 36 33190 33286 Nguyễn Thị N Lê Thị T 37 33354 Trần Thị Ánh H 38 39 33538 33696 Phan Thị V Trƣơng Thị T 40 34115 Vũ Thị T 41 34695 Ngô Thị Thanh T 42 35670 Phạm Thị Bích L 43 36235 Nghiêm Thị L 44 19320 Nguyễn Tố H 45 46 9956 Thái Thị Hồng L Đoàn Thị M ... 1.2.TỔNG QUAN VỀ UNG THƢ VÚ 1.2.1 Phân loại ung thƣ vú 1.2.2 Các giai đoạn ung thƣ vú 1.2.3 Các yếu tố nguy 1.3.NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỔI SỐ LƢỢNG BẢN SAO ADN TI THỂ Ở BỆNH NHÂN UNG THƢ VÚ 1.4.CÁC PHƢƠNG... TỰ NHIÊN -- Nguyêñ Hồng Nhung NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỔI SỐ LƢỢNG BẢN SAO ADN TI THỂ Ở BỆNH NHÂN UNG THƢ VÚ Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420 114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Ngƣời... nhiều nghiên cứu biến đổi số lƣợng ADN ti thể, nhƣng Việt Nam là hƣớng nghiên cứu Cho đến nay, chúng tơi chƣa tìm thấy cơng bố thƣƣ́c v? ?nghiên cứu biến đổi số lƣợng mtADN bênḥ ung thƣ nói chung
Ngày đăng: 20/11/2020, 08:53
Xem thêm:
