PLANT YG41 PART VẬT DỤNG CƠ BẢN CỦA THÍ NGHIỆM VI SINH - Thực hành : Sử dụng vật kính dầu x100 để tăng độ chiết quang Tiêu cự khoảng cách nhìn rõ từ tiêu đến vật kính o X10: 16mm - o X40: mm o X100: 1mm Độ phóng đại = Thị kính x Vật kính Dụng cụ thực hành vi sinh: đèn cồn, kim cấy, vòng cấy, ống nghiệm, hộp petri Nhiệt độ đèn cồn busan 400 – bên ngồi 1700 Vịng cấy kim cấy làm sợi dây kim khí chóng nóng chóng nguội Hộp petri mở nắp, cho vào hộp tủ ủ để lật ngược nắp hộp xuống dưới, đáy hộp lên để tránh đọng nước Kinh hiển vi gồm phần: học quang học PHƯƠNG PHÁP NHUỘM GRAM Là phương pháp nhuộm – phương pháp nhuộm kép ( dùng hai loại màu tương phản màu sắc: Tím Gentian & đỏ Sarfranin) Nguyên tắc: Chất rượu (Alcol) tẩy màu hợp chất “Tím gentian-iod” VK G(-) Bộ thuốc nhuộm o Tím Gentian - o Dung dịch Lugol o Alcol 95o o Đỏ Safranin Thời gian trả lời xét nghiệm vi khuẩn ngày Cơ sở (đặc điểm cấu trúc loại tế bào vi khuẩn) GRAM DƯƠNG Bắt màu Thành tế bào Tím + Peptidoglican: 40 lớp (50%) + Teichoic teichuronic acid 50% khô vách, 50% khơ tế bào + Polysacharides Khơng có nội độc tố GRAM ÂM Đỏ + Peptidoglycan: 1-2 lớp (5- 10%) + Lipoprotein: liên kết chéo màng peptidoglycan + Màng ngoài: lớp phospholipid, lớp mỏng LPS + Lypopolysacharide : nội độc tố Có nội độc tố Đặc điểm Chức thành tế bào: + Duy trì hình dạng vi khuẩn => Nhóm kháng sinh beta lactam lysozyme tác động + Quy định chất nhuộm Gram + G(-) định nội độc tố, độc lực, khả gây bệnh nội độc tố + Quy định kháng nguyên thân => Xác định loại vi khuẩn + Receptor đặc hiệu - Sai kết quả: Sai kết G(-) => G(+) Tẩy màu lâu Lứa cấy q già (vách thối hóa) Dung dịch Lugol khơng chất lượng Thời gian bắt màu thuốc nhuộm tím Gentain chưa đủ Lưu hành nội Sai kết G(+) => G(-) Thời gian tẩy màu ngắn, dùng cồn lỗng Cố định tiêu cịn ướt Phết vi khuẩn dày Thời gian bắt màu thuộc nhuộm tím Gentain lâu PLANT YG41 Thời gian tạo phức lugol với tím Gentain chưa đủ PART Thời gian tạo phức Lugol tím Gentain lâu PHƯƠNG PHÁP NHUỘM KHÁNG ACID ( Ziehl- Neelsen – Fast Stain) I - - - Đặc điểm cấu tạo tế bào trực khuẩn kháng acid liên quan phương pháp nhuộm kháng acid: Trực khuẩn kháng acid ( Mycobacteria) dài, mãnh đôi phân nhánh sợi, màu đỏ o Kháng xâm nhập thuốc thử lượng lớn lipid lớp vỏ tế bào vi khuẩn o Ăn màu với Carbonfuchsin lâu 5-10p đun nóng Mycobacteria thường gặp o Mycobacterium tuberculosis : lao người o Mycobacterium bovis: lao bò o Mycobacterium leprae: phong II Bộ thuốc nhuộm kháng acid: Carbonfuchsin Xanh metylen - Dung dịch acid-alcol ( HCl 3%, alcol 70o) Dung dịch acid-alcol tẩy màu carbonfucshin tế bào biểu mô, bạch cầu, VK thường Xanh metylen bắt màu TB biểu mô, bạch cầu III Thực Lưu ý: Dùng màu tương phản màu đỏ Carbonfuchsin thay xanh Methylen IV Quan sát: Hình dài, mảnh, hồng đỏ biểu mô / bạch cầu màu xanh lơ Đọc kết quả: Chỉ trả lời có hay khơng trực khuẩn kháng acid phế nhuộm đếm số lượng vi khuẩn quan sát o Riêng mẫu đàm cần quan sát dòng, dòng 100 quang trường dầu có AFB 0-3 : âm tính 4-9: ghi số cụ thể 10-99 : 1+ 1-10 / quang trường: 2+ >10/ quang trường: 3+ PHÂN LẬP VI KHUẨN I - Phương pháp cấy vạch chiều Nguyên tắc: PLVK hay tách rời vi khuẩn từ hỗn hợp dựa nguyên tắc làm cạn dần mầm cấy Dùng phương pháp cấy vạch chiều Đọc kết Chú ý quan sát khác khúm vi khuẩn Hình dạng khuẩn lạc: o Đường kính o Đường viền Lưu hành nội o Bề mặt ( lồi-lõm, khô – ướt, trơn- nhăn) o Màu sắc khuẩn lạc PLANT YG41 PART o Độ đục khuẩn lạc - Kết luận: o Có khuẩn lạc khác có nhiêu loại vi khuẩn diện hộp thạch II Phương pháp cấy ống nghiệp Môi trường lỏng Môi trường thạch nghiêng ( bề mặt) Môi trường thạch nghiêng sâu KHÁNG SINH ĐỒ - - - - - - I Đại cương Kháng sinh đồ phương pháp tìm độ nhạy vi khuẩn loại kháng sinh Gồm: o Đĩa giấy khuếch tán thạch ( Kirby – Bauer) o Pha loãng kháng sinh ống nghiệm ( liên tiếp) o E-test II Phương pháp Kirby – Bauer ( kết định tính) Nguyên tắc Kháng sinh tẩm vào đĩa giấy với nồng độ thích hợp khuếch tán mặt thạch chung quanh, ngăn chặn phát triển vi khuẩn Đường kính vịng vơ khuẩn mơ tả độ nhạy cảm vi khuẩn kháng sinh Khơng có vịng vơ khuẩn: vi khuẩn kháng thuốc kháng sinh Chuẩn bị Đĩa kháng sinh ( d =6 mm) o Tẩm thuốc kháng sinh nồng độ tiêu chuẩn o Bảo quản ống chống ẩm < -4oC , chuẩn bị dùng 2-8oC, nhiệt độ phòng 1-2h trước dùng Tiêu chuẩn lựa chọn kháng sinh: o Chọn KS đại diện cho nhóm có phổ rộng o Tùy thuộc vào loại vi khuẩn thử nghiệm o Tùy thuộc vị trí nhiễm khuẩn o Tùy theo chiến lược sách sử dụng nơi Môi trường o Môi trường tiêu chuẩn thực KSĐ MHA o Có thể thêm chất cần Streptococi (5% máu người), độ nhạy cảm Pseudoamonas Aeruginosa với aminoglycoside ( Ca2+ Mg2+) , Staphylococus kháng methicillin ( NaCl 2%) o pH = 7.2 – 7.4 o h = 4mm, bảo quản túi plastic- tủ lạnh, không dùng sau ngày, đạt nhiệt độ phòng dùng Dung dịch chuẩn độ đục o Mật độ thước mầm cấy chuẩn 108 CFU/ml máy quang phổ kế, so sánh với ống Mc Faland 0.5 ( BaSO4.2H2O) Mầm cấy o Chọn 3-4 khúm cấy ống 2-5 ml môi trường TBS BHI 370C 4-6h o Chuẩn độ đục dùng ngày 15p Vi khuẩn kiểm chứng Lưu hành nội PLANT YG41 PART o Là dòng VK chưa có biểu kháng thuốc tất loại thuốc kháng sinh dùng để kiểm tra chất lượng môi trường loại đĩa kháng sinh sử dụng thực nghiệm nhạy cảm kháng sinh o Thông thường: Escherichia coli ATCC 25923 Staphylococus aureus ATCC923 Pseudomonas aeruginosa ATCC27853 o Môi trường nuôi cấy: thêm 50% huyết bê, glycerol 10% -20 đến 60oC tránh đột biến kháng thuốc Thực hiện: - - - Đọc kết Quan sát hộp thạch với dòng vi khuẩn kiểm chứng chuẩn ATCC ( VK mọc tốt, vịng vơ khuẩn chuẩn) Quan sát hộp thạch o Khơng có vịng vơ khuẩn: vi khuẩn kháng thuốc kháng sinh o Có vịng vơ khuẩn: kết luận mà tùy theo Đường kính vịng vơ khuẩn (mm) So sánh với chuẩn bảng hướng dẫn NCCLS Nhạy cảm (S) : đáp ứng với liều KS thông thường dùng đường thích hợp uống Trung gian (I): bị ức chế nồng độ kháng sinh đạt dùng liều lớn đường tiêm Kháng (R) vi khuẩn không bị ức chế với nồng độ kháng sinh đạt được, không chọn để điều trị III Phương pháp pha loãng liên tiếp ( định lượng) Pha loãng o Dãy ống nghiệm liên tiếp o Các giếng phiến nhựa cứng o Vào môi trường thạch ( đục giếng) Nguyên tắc Dựa tương quan nồng độ pha loãng kháng sinh tăng trưởng vi khuẩn nồng độ kháng sinh khác nhau, ta xác định độ nhạy cảm vi khuẩn kháng sinh Xác định nồng độ tối thiểu kháng sinh có khả ngăn chặn tăng trưởng VK Vật liệu: NB ( môi trường dinh dưỡng lỏng) Phương pháp Môi trường: CAMHB Điều chỉnh Ca2+ Mg2+ cần thử P.aeruginosa thử kháng sinh aminoglycosides Tiêu chuẩn mầm cấy: x 105 CFU/ml Từ độ đục chuẩn pha loãng 1:100 NB, nước muối sinh lý cho vào 1ml kháng sinh pha loãng môi trường CAMHB để đạt yêu cầu Đọc kết Kiểm tra ống MIC ( nồng độ ức chế tối thiểu) mức quy định Kiểm tra ống 10 ( chứa vi khuẩn, không KS) đục Quan sát ống nghiệm lại chia loại: ống đục hướng ống 10, ống hướng ống ( độ đục tăng dần) Ta biết: o Nồng độ kháng sinh ban đầu Lưu hành nội PLANT YG41 - PART o Tỉ lệ pha loãng kháng sinh Xác định MIC (ug/ml): nòng độ thấp kháng sinh ức chế tăng trưởng vi khuẩn quan sát mắt thường IV Phương pháp E-Test Là phương pháp kháng sinh đồ dựa nguyên tắc khuếch tán có cải tiến, kết có tính định lượng Đọc kết quả: o Xác định MIC cách cách tìm nơi bắt đầu có vịng vơ khuẩn quanh giấy tẩm kháng sinh Ở đoạn có nồng độ kháng sinh cao vịng vơ khuẩn rộng VI KHUẨN ĐƯỜNG RUỘT - - - I Tính chất Trực khuẩn Gram âm, hiếu khí kỵ khí tùy nghi Đa số di động nhờ chiên mao xung quanh thần ( trừ Shigella Kebsiella) Lên men glucose ( sinh không) Khử nitrates thành nitrites Không sản xuất men cytochrome-oxidase Vi khuẩn mọc môi trường ni cấy thơng thường Các nhóm E.Coli tiêu chảy EPEC : Enteropathogenic E.Coli: chủ yếu trẻ em PTEC: Enterotoxigenic E.Coli: độc tố LT, ST EIEC: Enterovasive E.coli : xâm lấn tế bào EHEC: Enterohemorrhagic E.coli: độc tố verotoxin EAEC: Enteroaggregative E.coli: bám dính niêm mạc ruột Shigella: A: S.dysenteriae: độc tố shiga B: S.fexneri: độc tố giống shiga C: S.boydii: không tiết độc tố D: S.sonnei: độc tố giống shiga Salmonella: 2200 type huyết dựa công thức kháng nguyên O,H,K Các loại 1983: o Salmonella typhi: sốt thương hàn o Samonella choleraesuis: nhiễm trùng máu, abscess nội tạng o Samonella enteritidis: viêm ruột Yersinia: Yersinia pestis: dịch hạch Yersinia enterocolitica: nhiễm trùng tiêu hóa ( giống triệu chứng Shigella) Yersinia pseudotuberculosis: nhiễm trùng tiêu hóa II Cách lấy chuyên chở bệnh phẩm Nguyên tắc chung: vô trùng, tránh nhiễm tối đa bệnh phẩm phải lấy vùng da niêm mạc o Dịch, mủ: ống vô trùng, chuyển vào môi trường chuyên chở Cary-Blair o Nước tiểu: lấy dòng, 2h o Phân: thời kỳ đầu bệnh trước dùng kháng sinh Lưu ý: Lấy bênh phẩm chuyên chở bệnh phẩm cách điều quan trọng để phân lập vi khuẩn gây bệnh III Các loại môi trường dùng để chuyển chở - Phân lập – Định danh Enterobacteriaceae: Lưu hành nội PLANT YG41 PART IV - Xác định type huyết vi khuẩn gây bệnh đường ruột E.coli EPEC: kháng huyết mẫu ETEC: o Tìm độc tố LT: ni cấy tế bào, ELISA - - o Tìm độc tố ST: chuột sơ sinh EIEC: giác mạc chuột lang, tế bào hep-2 EHEC: Tìm độc tố verotoxin tế bào vero Shigella : kháng huyết mẫu Salmonella: kháng huyết mẫu Yersinia enterocolitica: kháng huyết mẫu V Quy trình phân lập enterobacteriaceae Sau tiến hành phản ứng sinh hóa bản, bao gồm o o o o Lên men đường MR-VP H2S Omdole Lưu hành nội o Motility o Citrate o Urease o Decarboxylase tests ( Lys, Arg, Ornithine) o Phenylalanine deaninase o ONPG o Khử nitrate VI Kết cấy môi trường phân lập Môi trường MC,EMB,SS (không quan trọng) VI KHUẨN E.Coli Enterobacter Klebsiella Proteus vulgaris Salmonella Shigella ĐẶC TRƯNG CHUNG Đều MC EMB SS Vịng đỏ Tím than ánh kim Khơng mọc, khó xung quanh loại mọc ( tăng trưởng ít) : màu hồng, đỏ Nhầy Khơng màu, Màu đỏ gạch, đen đỏ giữa Bóng, nhớt Giữa đỏ Đỏ gạch, đen Không màu, nhỏ Rất nhỏ, khúm tựa sóng gợn Nhỏ Khơng màu, nhỏ Trong Đục/ Trong Giống Salmonella nhỏ Vài dòng bị ngăn chặn SS MC Đều chứa: Peptone, đường Lactose, Thạch Đều làm : Ức chế G(+) cho G(-) mọc Muối mật Natri citrate, Natri thiosulfate, Sắt citrate NaCl Cao thịt bò ( Beef extract) Brilliant green Crystal Violet Chất thị màu: đỏ trung tính EMB Đường Sucrose Dipotassium phosphate Chất thị màu: Eosin, Methylene blue Phân lập Shigella, Samonella, ức chế E.Coli - Môi trường TSI, KIA Lưu ý: Thạch TSI môi trường khảo sát tính chất sinh hóa: lên men glucose (1), lactose (10), sinh H2S ( đỏ phenol + FeSO4), gas TSI khác KIA thành phần đường Saccharo, khảo sát lên men lactose chậm VII Giải thích Bảng so sánh sau CẦU KHUẨN A CẦU KHUẨN GRAM DƯƠNG I Đặc điểm Staphylococci Tụ cầu Chùm nho Khuẩn lạc Mơi trường mọc Tính chất II III Mt dinh dưỡng (NA), mt lỏng (NB) Môi trường chọn lọc: MSA 7.5% NaCl Khí trường có 5-10% CO2 D.Enterococci: 6.5%NaCl Dễ bị ly giải muối mật, Optochin, tiêu huyết thạch máu Sơ đồ phân lập Đoc kết Thử nghiệm Catalase Coagulase Đường manitol Hemolysin Kháng Novobiocin Tiêu huyết Bacitracin ( TAXO A) CAMP test DƯƠNG TÍNH / ÂM TÍNH Sủi bọt Lợn cợn Màu vàng / màu đỏ Vòng sáng tiêu huyết Khơng có 16mm ĐẶC ĐIỂM Coagulase gồm tự liên kết (xem 10s đầu) / + Beta: tiêu huyết hồn tồn: tạo vịng tiêu huyết sáng + Alpha: tiêu huyết khơng hồn tồn, tạo vịng tiêu huyết mờ, ánh xanh + Gamma: Khơng ly giải, khơng có vịng trịn Vịng vơ khuẩn Đầu vạch cấy có vùng tiêu huyết hình mũi tên hướng vạch cấy Nâu đen đậm Bile-Esculin Kết tụ Latex Streptococci Streptococcus Liên cầu Phế cầu Chuỗi dài ngắn Đơi, hình mũi giáo Đôi đám Chuỗi tụ đám Thạch máu, thạch chocolate, tim óc hầm Yếu tố CAMP hiệp đồng tiêu huyết với betahemolysin Nguyên tắc: thủy phân esculin ( mật) tạo glucose esculetin Esculetin phản ứng muối Fe cho màu nâu đậm / đen Nguyên tắc: Hạt nhựa latex phủ kháng thể đặc hiệu nhóm ABCDEG tụ lại gặp kháng nguyên tương ứng ASLO (Anstreptolysin O) Optochin (TAXO P) Tan muối mật Thử nghiệm phồng nang - - Ống chứng - Lỗ chứng: tan máu - Lỗ chứng HC: không tan máu, HC lắng xuống đáy lỗ Ống thử - Không tan máu: (+) - Tan máu (-) Vịng vơ khuẩn >= 14mm Trong suốt Phồng nang ( KHV) Nguyên tắc: ASLO trung hịa độc Streptolysin O nên khơng ly giải hồng cầu => xác định hiệu giá kháng thể chẩn đoán sốt thấp khớp, viêm cầu thận cấp Nguyên tắc: Pneomococus nhạy cảm Optochin Nguyên tắc: Muối mật làm tăng khả ly giải vi khuẩn Pneumococcus Nguyên tắc: nang yếu tố gây bệnh, nang phồng to gặp kháng huyết chuyên biệt IV Chú ý Liên cầu Phế cầu ( Streptococcus pneumonia) Taxo P ( Optochin) Lậu cầu Não mô cầu (Neisseria meningitides) Maltose Liên cầu o A => Taxo A = Bacitracin o B => Camp test o D => Esculin test B CẦU KHUẨN GRAM ÂM V Nguyên tắc Dựa vào tính chất sinh hóa Neisseria định danh vi khuẩn o N.Sicca: (+) hết o N.Favescent (-) hết trừ NA o N.Gonorrhoeae (-) hết trừ Glucose o N.Meningitidis giống Gonorrhoeae khác Maltose (-) VI Sơ đồ phân lập vi khuẩn CÁC LƯU Ý KHI LÀM TRẮC NGHIỆM - Nuôi cấy 37oC, trừ 15-45oC NaCl 7.5% đặc biệt Các tiêu xét nghiệm VSV o Coliform: tình trạng vệ sinh chung nguồn nước o Faccal coliform VSV nguồn nước o Faccal streptococci chứng nguồn nước nhiễm phân o Clostridium perfringens chất lượng khử khuẩn mẫu nước o Staphylococcus gây tiêu chảy ngộ độc thực phẩm - Kiểm tra vi sinh khơng khí o BA cho tất VSV ( 5-10% CO2 / 24h) o MC cho trực khuẩn G(-) (24h) o SA cho vi nấm ( 72h) Sử dụng BA,MC,SA để kiểm tra vi sinh khơng khí o Các phương pháp kiểm tra vi sinh khơng khí Phương pháp lắng bụi Koch Phương pháp hút bụi màng lọc Gelatin Phương pháp hút bụi trực tiếp lên mặt thạch đặt máy hút bụi