(Luận án tiến sĩ) Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích kháng lên sự biểu hiện của một số gen tham gia vào quá trình tổng hợp curcuminoid ở tế bào nghệ đen (Curcuma zedoaria Roscoe)

(Luận án tiến sĩ) Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích kháng lên sự biểu hiện của một số gen tham gia vào quá trình tổng hợp curcuminoid ở tế bào nghệ đen (Curcuma zedoaria Roscoe)(Luận án tiến sĩ) Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích kháng lên sự biểu hiện của một số gen tham gia vào quá trình tổng hợp curcuminoid ở tế bào nghệ đen (Curcuma zedoaria Roscoe)(Luận án tiến sĩ) Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích kháng lên sự biểu hiện của một số gen tham gia vào quá trình tổng hợp curcuminoid ở tế bào nghệ đen (Curcuma zedoaria Roscoe)(Luận án tiến sĩ) Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích kháng lên sự biểu hiện của một số gen tham gia vào quá trình tổng hợp curcuminoid ở tế bào nghệ đen (Curcuma zedoaria Roscoe)(Luận án tiến sĩ) Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích kháng lên sự biểu hiện của một số gen tham gia vào quá trình tổng hợp curcuminoid ở tế bào nghệ đen (Curcuma zedoaria Roscoe)(Luận án tiến sĩ) Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích kháng lên sự biểu hiện của một số gen tham gia vào quá trình tổng hợp curcuminoid ở tế bào nghệ đen (Curcuma zedoaria Roscoe)(Luận án tiến sĩ) Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích kháng lên sự biểu hiện của một số gen tham gia vào quá trình tổng hợp curcuminoid ở tế bào nghệ đen (Curcuma zedoaria Roscoe)(Luận án tiến sĩ) Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích kháng lên sự biểu hiện của một số gen tham gia vào quá trình tổng hợp curcuminoid ở tế bào nghệ đen (Curcuma zedoaria Roscoe)

ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TRƯƠNG THỊ PHƯƠNG LAN NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA CHẤT KÍCH KHÁNG LÊN SỰ BIỂU HIỆN CỦA MỘT SỐ GEN THAM GIA QUÁ TRÌNH SINH TỔNG HỢP CURCUMINOID Ở TẾ BÀO NGHỆ ĐEN (Curcuma zedoaria Roscoe) LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Chuyên ngành: SINH LÝ HỌC THỰC VẬT Mã số: 9420112 Người hướng dẫn khoa học: GS.TS NGUYỄN HOÀNG LỘC HUẾ - NĂM 2019 LỜI CÁM ƠN Hoàn thành luận án này, trước hết chúng tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến GS.TS Nguyễn Hoàng Lộc quan tâm giúp đỡ hướng dẫn tận tình Xin bày tỏ lòng biết ơn tới cán giảng viên Bộ môn Sinh học Ứng dụng, Bộ môn Công nghệ Sinh học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế; Phịng thí nghiệm Các hợp chất thứ cấp, Viện tài nguyên, Môi trường Công nghệ sinh học, Đại học Huế (giai đoạn 20132014); Viện Công nghệ Sinh học, Đại học Huế giúp đỡ suốt thời gian thực đề tài Xin cám ơn Ban Giám đốc, Ban đào tạo Sau đại học Đại học Huế; Ban Giám hiệu, Phòng Nghiên cứu Khoa học hợp tác Quốc tế; Phòng Đào tạo Sau đại học -Trường đại học Khoa học; Ban chủ nhiệm Khoa sinh họcTrường Đại học Khoa học- Đại học Huế ; Ban Giám hiệu, Khoa Dược, Khoa bản, Bộ môn Sinh học-Trường Đại học Y Dược Huế có nhiều giúp đỡ quý báu, tạo điều kiện tốt để chúng tơi hồn thành luận án Xin cám ơn đồng nghiệp, bạn bè nhiệt tình động viên, hỗ trợ chúng tơi hồn thành luận án Cuối cùng, xin bày tỏ lòng biết ơn đến người thân gia đình ln giúp đỡ, động viên khích lệ vật chất lẫn tinh thần Xin trân trọng cảm ơn! Huế, ngày tháng năm 2019 Tác giả Trương Thị Phương Lan LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nêu luận án trung thực, khách quan, nghiêm túc chưa công bố cơng trình khác Nếu có sai sót tơi xin chịu hồn tồn trách nhiệm Tác giả luận án Trương Thị Phương Lan BẢNG CHÚ THÍCH CHỮ VIẾT TẮT BAP CoA cs CTAB CzDCS CzCURS1 CzCURS2 CzCURS3 ĐC DPPH dw FRAP fw HPLC IBA KIN MAPK MeJA MS NAA NO PAA ROS SA SNP YE 6-benzylaminopurine coezyme A cộng hexadecyltrimethylammonium bromide Curcuma zedoaria DCS Curcuma zedoaria CURS1 Curcuma zedoaria CURS2 Curcuma zedoaria CURS3 đối chứng 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl dry weight (khối lượng khô) ferric reducing antioxidant power fresh weight (khối lượng tươi) high-performance liquid chromatography 3-indolebutyric acid kinetin mitogen-activated protein kinase methyl jasmonate Murashige and Skoog (1962) naphthaleneacetic acid nitric oxide phenyl acetic acid reactive oxygen species salicylic acid sodium nitroprusside yeast extract (dịch chiết nấm men) MỤC LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Phân loại elicitor khác 17 Bảng 1.2 Một số ứng dụng elicitor để cải thiện khả tích lũy hợp chất thứ cấp nuôi cấy in vitro .21 Bảng 2.1 Trình tự primer dùng để khuếch đại vùng CDS gen tổng hợp curcuminoid nghệ đen 45 Bảng 2.2 Trình tự primer dùng để khuếch đại vùng thị gen tổng hợp curcuminoid nghệ đen 47 Bảng 3.1 Ảnh hưởng AgNO3 lên khả tái sinh chồi chồi in vitro nguyên vẹn 51 Bảng 3.2 Ảnh hưởng AgNO3 lên khả tái sinh chồi chồi in vitro chẻ đôi .52 Bảng 3.3 Ảnh hưởng AgNO3 lên khả tạo rễ chồi in vitro .53 Bảng 3.4 Ảnh hưởng KIN từ 0,5-2 mg/L 2,4-D mg/L lên sinh trưởng callus nghệ đen 55 Bảng 3.5 Ảnh hưởng NAA từ 0,5-2 mg/L 2,4-D mg/L lên sinh trưởng callus nghệ đen 56 Bảng 3.6 Ảnh hưởng 2,4-D mg/L AgNO3 từ 0,5-2 mg/L lên sinh trưởng callus nghệ đen 56 Bảng 3.7 Mật độ băng DNA từ phân tích RT-PCR vùng đặc hiệu gen CzDCS, CzCURS1, CzCURS2 CzCURS3 loại mô khác nghệ đen 70 Bảng 3.8 Mật độ băng DNA vùng đặc hiệu gen tổng hợp curcuminoid 76 Bảng 3.9 Ảnh hưởng elicitor lên sinh trưởng tích lũy curcumin tế bào nghệ đen 77 DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Cấu trúc hóa học curcumin Hình 1.2 Con đường sinh tổng hợp curcuminoid nghệ vàng 30 Hình 1.3 Vai trò gen DCS CURS tổng hợp curcuminoid nghệ vàng .32 Hình 2.1 Cây nghệ đen 39 Hình 2.2 Sơ đồ thí nghiệm 40 Hình 2.3 Vector pGEM®-T Easy (Promega, Mỹ) 44 Hình 2.4 Vị trí primer xi ngược gen CzCURS1 .48 Hình 3.1 Cây nghệ đen in vitro tháng tuổi 53 Hình 3.2 Callus nghệ đen tuần tuổi sinh trưởng mơi trường có 2,4-D mg/L kết hợp với KIN 1,5 mg/L (A) đối chứng sinh trưởng mơi trường có 2,4-D mg/L kết hợp với BAP mg/L (B) 57 Hình 3.3 Đường cong sinh trưởng tế bào nghệ đen .58 Hình 3.4 Tế bào nghệ đen ni bình tam giác chứa môi trường MS bổ sung 2,4-D mg/L BAP mg/L .59 Hình 3.5 Sinh khối tươi (A) khơ (B) tế bào nghệ đen .59 Hình 3.6 Sản phẩm PCR gen tổng hợp curcuminoid khuếch đại từ DNA tổng số nghệ đen 61 Hình 3.7 Sơ đồ xếp intron/exon gen sinh tổng hợp curcuminoid nghệ đen 61 Hình 3.8 So sánh trình tự nucleotide (nu) vùng CDS gen CzDCS (MF663785) nghệ đen DCS nghệ vàng (AB495006.1) 62 Hình 3.9 So sánh trình tự nucleotide (nu) vùng CDS gen CzCURS1 (MF402846) nghệ đen CURS1 nghệ vàng (AB495007.1) 63 Hình 3.10 So sánh trình tự nucleotide (nu) vùng CDS gen CzCURS2 (MF402846) nghệ đen CURS2 nghệ vàng (AB506762.1) 64 Hình 3.11 So sánh trình tự nucleotide (nu) vùng CDS gen CzCURS3 (NCBI: MF987835) nghệ đen CURS3 nghệ vàng (NCBI: AB506763.1) 65 Hình 3.12 So sánh trình tự amino acid suy diễn gen CzDCS DCS (C0SVZ5.1) 66 Hình 3.13 So sánh trình tự amino acid suy diễn gen CzCURS1 CURS1 (AJF45913.1) 66 Hình 3.14 So sánh trình tự amino acid suy diễn gen CzCURS2 CURS2 (BAW81545.1) 67 Hình 3.15 So sánh trình tự amino acid suy diễn gen CzCURS3 CURS3 (AJF45914.1) 67 Hình 3.16 Cây phả hệ gen sinh tổng hợp curcuminoid 68 Hình 3.17 Phân tích RT-PCR vùng đặc hiệu gen CzDCS, CzCURS1, CzCURS2 CzCURS3 loại mô khác nghệ đen 70 Hình 3.18 Phổ HPLC curcumin chuẩn 71 Hình 3.19 Phổ HPLC dịch chiết củ nghệ đen 71 Hình 3.20 Phổ HPLC dịch chiết callus nghệ đen 72 Hình 3.21 RNA tổng số mẫu tế bào sau xử lý elicitor 73 Hình 3.22 Phân tích RT-PCR vùng đặc hiệu gen CzCURS1 (A) CzCURS3 (B) sau xử lý elicitor 74 Hình 3.23 Sản phẩm RT-PCR vùng đặc hiệu gen sinh tổng hợp curcuminoid nghệ đen 75 Hình 3.24 Phổ HPLC curcumin chuẩn 78 Hình 3.25 Phổ HPLC dịch chiết tế bào xử lý với YE g/L sau ngày nuôi cấy 78 Hình 3.26 Phổ HPLC dịch chiết tế bào xử lý với SA 100 µM sau ngày ni cấy 79 MỞ ĐẦU TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Cây nghệ đen (Curcuma zedoaria Roscoe) thuộc họ Gừng (Zingiberaceae) gọi nga truật, tam nại hay ngải tím lồi thảo dược địa Ấn Độ Indonesia, trồng nhiều Trung Quốc, Nhật Bản, Brazil, Nepal, Thái Lan [78] Việt Nam [7] Nghệ đen từ lâu sử dụng y học cổ truyền nhiều nước để điều trị chứng viêm, đau nhức, bệnh da vết thương vết lở loét, bất thường chu kỳ kinh nguyệt [157] Nhóm chất màu curcuminoid bao gồm curcumin dẫn xuất demethoxycurcumin bisdemethoxycurcumin nhóm hợp chất tạo nên hoạt tính sinh học quan trọng củ nghệ [76] Các nghiên cứu gần cho thấy curcuminoid, đặc biệt curcumin, có phạm vi tác dụng dược lý rộng kháng viêm, kháng khuẩn, kháng virus, chống oxy hóa mạnh, chống tia tử ngoại, ức chế phát triển khối u bảo vệ thần kinh (kháng β-amyloid) [14], [58], [116] Curcuminoid chiết xuất từ củ (thân rễ) loài nghệ khác nhau, chẳng hạn C caesia [24], C amada [50], C longa [67], C aromatica [74] C zedoaria [78] Curcuminoid sử dụng dược chất nghiên cứu lâm sàng cho bệnh nhân ung thư phổi, ung thư trực tràng, viêm khớp dạng thấp, bệnh Alzheimer, bệnh vảy nến… [35] Nhiều nghiên cứu cho thấy curcuminoid có độ an tồn cao, dung nạp tốt với thể, không độc đến liều g/kg thể trọng [46] Hiện nay, gen tham gia trình tổng hợp curcuminoid nghệ vàng (C longa) xác định phân tích mức độ biểu hiện, bao gồm hai nhóm gen mã hóa enzyme type III polyketide synthase diketide-CoA synthase (DCS) curcumin synthase (CURS1, CURS2 CURS3) [66], [67] Trước đó, Brand cs (2006) mô tả gen mã hóa enzyme type III polyketide synthase khác chalcone synthase (CHS) có Wachendorfia thyrsiflora, gen tham gia vào trình tổng hợp curcuminoid [28] Behar cs (2016) phân tích biểu gen tham gia tổng hợp curcuminoid C caesia bao gồm DCS, CURS, CURS2, CURS3 CHS1 nhận thấy mức độ biểu chúng củ cao [24] Tuy nhiên, gen tham gia tổng hợp curcuminoid loài nghệ đen đến chưa cơng bố Elicitor chất hóa học dùng để tác động vào đường chuyển hóa thứ cấp nhằm tăng cường sinh tổng hợp chất có giá trị dược phẩm ni cấy tế bào thực vật [62], [111] Theo Abraham cs (2011), dịch chiết nấm men (YE) ứng dụng ni cấy in vitro thực vật khả kích thích chế bảo vệ, tăng sản sinh chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính sinh học [9] Salicilic acid (SA) xem tín hiệu quan trọng phản ứng tự vệ sử dụng rộng rãi sản xuất chất chuyển hóa từ ni cấy tế bào thực vật [22] Methyl jasmonate (MeJA) chứng minh chất đóng vai trị quan trọng việc truyền tín hiệu điều chỉnh khả phịng vệ thực vật kích thích sản sinh chất chuyển hóa thứ cấp ni cấy tế bào [158], [169] Từ lý trên, thực đề tài “Nghiên cứu ảnh hưởng chất kích kháng lên biểu số gen tham gia vào trình tổng hợp curcuminoid tế bào nghệ đen (Curcuma zedoaria Roscoe)” nhằm xác định loại elicitor nồng độ thích hợp chúng để điều hịa tăng biểu gen mã hóa enzyme type III polyketide synthase đường phenylpropanoid tế bào nghệ đen Kết nghiên cứu cung cấp chứng vai trò SA, YE MeJA chất điều hịa dương tính biểu gen lồi dược liệu có giá trị 10 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Mục tiêu lý thuyết Cải thiện mức độ biểu gen CzDCS, CzCURS1, CzCURS2 CzCURS3 tham gia đường chuyển hóa phenylpropanoid sinh tổng hợp curcuminoid tế bào nghệ đen nuôi cấy in vitro số elicitor Mục tiêu thực nghiệm Tăng hiệu suất sinh tổng hợp curcumin, thành phần nhóm chất curcuminoid ứng dụng nhiều dược phẩm, tế bào nghệ đen nuôi cấy in vitro NỘI DUNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU Nội dung nghiên cứu - Nuôi cấy sinh khối tế bào nghệ đen in vitro hiệu suất cao cách bổ sung AgNO3 vào môi trường nuôi cấy quy mô phịng thí nghiệm - Phân lập gen CzDCS, CzCURS1, CzCURS2 CzCURS tham gia trình tổng hợp curcuminoid (các gen curcuminoid) nghệ đen - Nghiên cứu ảnh hưởng số elicitor YE, SA MeJA lên mức độ biểu gen tổng hợp curcuminoid khả tích lũy curcumin tế bào nghệ đen ni cấy in vitro ĐĨNG GĨP MỚI CỦA LUẬN ÁN Luận án có đóng góp sau: - Các nghiên cứu nuôi cấy mô tế bào nghệ đen trước chưa sử dụng AgNO3 để tăng hiệu nuôi cấy, nghiên cứu này, bổ sung AgNO3 1,5 mg/L vào môi trường nuôi cấy (bao gồm tạo in vitro, nuôi cấy callus) làm tăng hiệu trình nuôi cấy so với nghiên cứu trước - Đã phân lập thành công gen tham gia vào trình tổng hợp curcuminoid, gen tương đồng 99% so với gen tương ứng 126 155 Tohda C., Nakayama N., Hatanaka F., Komatsu K (2006), Comparison of antiinflammatory activities of six curcuma rhizomes: a possible curcuminoid indepent pathway mediated by curcuma phaeocaulis extract, Evid Based Complement Alternat Med, 3, pp 255-260 156 Tuan V.C., Hoang V.D., Loc N.H (2011), Cell suspension culture of zedoary (Curcuma zedoaria Roscoe), VNU Journal of Science, Natural Sciences and Technology, 27, pp 64-70 157 Ullah H.M.A., Zaman S., Juhara F., Akter L., Tareq S.M., Masum E.H., Bhattacharjee R (2014), Evaluation of antinociceptive, in-vivo & in-vitro anti-inflammatory activity of ethanolic extract of Curcuma zedoaria rhizome, BMC Complementary and Alternative Medicine, 14(1), pp 346 158 Walker T.S., Pal Bais H., Vivanco J.M (2002), Jasmonic acid-induced hypericin production in cell suspension cultures of Hypericum perforatum L (St John's wort), Phytochemistry, 60(3), pp 289-293 159 Wang J., Qian J., Yao L., Lu Y (2015), Enhanced production of flavonoids by methyl jasmonate elicitation in cell suspension culture of Hypericum perforatum, Bioresources and Bioprocessing, 2(1), pp 160 Wang S., Zhang S., Xiao A., Rasmussen M., Skidmore C., Zhan J (2015), Metabolic engineering of Escherichia coli for the biosynthesis of various phenylpropanoid derivatives, Metabolic Engineering, 29, pp 153159 161 Watanabe K., Shibata M., Yano S., Cai Y., Shibuya H., Kitagawa I (1986), Antiulcer activity of extracts and isolated compound from zedoary (Gajustsu) cultivated in Yakushima (Japan), Yakugaku Zasshi, 106(12), pp 1137-1142 162 Wilson B., Abraham G., Manju V.S., Mathew M., Vimala B., Sundaresan S., Nambisan B (2005), Antibacterial activity of Curcuma zedoaria and Curcuma malabarica tubers, Journal of Ethnopharmacology, 99, pp 147-151 127 163 Xie Z., Ma X., Gang D.R (2009), Modules of co-regulated metabolites in turmeric (Curcuma longa) rhizome suggest the existence of biosynthetic modules in plant specialized metabolism, Journal of Experimental Botany, 60(1), pp 87-97 164 Xing Y (1999), The chemical constituents of the essential oil from Curcuma zedoaria (Christm) Rosc., Journal of essential oil-bearing plants JEOP, 19(1), pp 95-96 165 Yeoman M.M., Meidzybrodzka M.B., Lindsey K., McLauchlan W.R (1980), The synthetic potential of cultured plant cells Plant cell cultures: results and perspectives Amsterdam, Elsevier: 327-343 166 Yu L.J., Lan W.Z., Qin W.M., Xu H.B (2001), Effects of salicylic acid on fungal elicitor-induced membrane-lipid peroxidation and taxol production in cell suspension cultures of Taxus chinensis, Process Biochemistry, 37(5), pp 477-482 167 Yu Z.Z., Fu C.X., Han Y.S., Li Y.X., Zhao D.X (2005), Salicylic acid enhances jaceosidin and siringin production in cell cultures of Saussurea medusa, Biotechnology Letters, 28(13), pp 1027-1031 168 Zhang S., Liu N., Sheng A., Ma G., Wu G (2011), In vitro plant regeneration from organogenic callus of Curcuma kwangsiensis Lindl (Zingiberaceae), Plant Growth Regulation, 64(2), pp 141-145 169 Zhao J.L., Zhou L.G., Wu J.Y (2010), Effects of biotic and abiotic elicitors on cell growth and tanshinone accumulation in Salvia miltiorrhiza cell cultures, Applied Microbiology and Biotechnology, 87(1), pp 137-144 128 PHỤ LỤC Phụ lục : Trình tự gen ngân hàng gen LOCUS DEFINITION ACCESSION VERSION KEYWORDS SOURCE ORGANISM MF663785 1382 bp DNA linear PLN 22-JUL-2018 Curcuma zedoaria diketide-CoA synthase (DCS) gene, complete cds MF663785 MF663785.1 Curcuma zedoaria Curcuma zedoaria Eukaryota; Viridiplantae; Streptophyta; Embryophyta; Tracheophyta; Spermatophyta; Magnoliophyta; Liliopsida; Zingiberales; Zingiberaceae; Curcuma REFERENCE (bases to 1382) AUTHORS Loc,N.H., Huy,N.D., Lan,T.T.P., Quan,L.V and Nghi,N.V TITLE Identification and characterization of genes in curcuminoid pathway of Curcuma zedoaria JOURNAL Unpublished REFERENCE (bases to 1382) AUTHORS Loc,N.H., Huy,N.D., Lan,T.T.P., Quan,L.V and Nghi,N.V TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (12-AUG-2017) Institute of Bioactive Compounds and Department of Biotechnology, College of Sciences, Hue University, 77 Nguyen Hue street, Hue, Thua Thien Hue 530000, Vietnam COMMENT ##Assembly-Data-START## Sequencing Technology :: Sanger dideoxy sequencing ##Assembly-Data-END## FEATURES Location/Qualifiers source 1382 /organism="Curcuma zedoaria" /mol_type="genomic DNA" /db_xref="taxon:136224" gene 1382 /gene="DCS" /note="CzDCS" mRNA join(1382) /gene="DCS" /product="diketide-CoA synthase" CDS join(1 175,303 856,942 1382) /gene="DCS" /codon_start=1 /product="diketide-CoA synthase" /protein_id="AXC59785.1" /translation="MEANGYRITHSADGPATILAIGTANPTNVVDQNAYPDFYFRVTN SEHLQELKAKFRRICEKAAIRKRHLYLTEEILRENPSLLAPMAPSFDARQAIVVEAVP KLAKEAAEKAIKEWGRPKSDITHLVFCSASGIDMPGSDLQLLKLLGLPPSVNRVMLYN VGCHAGGTALRVAKDLAENNRGARVLAVCSEVTVLSYRGPHPAHIESLFVQALFGDGA AALVVGSDPVDGVERPIFEIASASQVMLPESEEAVGGHLREIGLTFHLKSQLPSIIAS NIEQSLTTACSPLGLSDWNQLFWAVHPGGRAILDQVEARLGLEKDRLAATRHVLSEYG NMQSATVLFILDEMRNRSAAEGHATTGEGLDWGVLLGFGPGLSIETVVLHSCRLN" ORIGIN atggaagcga acggctaccg cataactcac agcgccgacg ggccggcgac gatcttggcc 61 atcggcaccg ccaaccccac caacgtcgtc gaccagaacg cttatcccga cttctatttc 121 cgggtcacca actccgagca tctgcaggaa ctcaaagcca agtttaggcg catctgtaag 129 181 241 301 361 421 481 541 601 661 721 781 841 901 961 1021 1081 1141 1201 1261 1321 1381 // atttatgtag taggaattgg aggtgagaaa gaatcctagc ggaggcggtg ccccaaatcg ctccgacctg ctacaacgtc gaacaaccgc cggcccccac tgccgcgctc cgcctcggca atatcgaacg aagaggcggt ttccgtcgat ggctgtcgga accaggtgga tcagcgagta accgctcggc tgggcttcgg ag tttgattgaa tggtttggtg gcggcgatca ttgctggctc ccgaagctag gacatcacgc cagcttctca gggtgccacg ggcgcgcggg cccgcccaca gtggtcgggt tcccaagtaa aactttaaaa aggcggccac catcgcgagc ctggaaccag ggcgcggctc cggcaacatg tgcggagggc cccgggactc tgatgggtcg gatttatgtg ggaagaggca ccatggcgcc cgaaggaggc acctcgtctt agctgctcgg ccggtggcac tgctcgccgt tcgagagcct ccgaccccgt tcgctgctcc atcaaatctt ctccgcgaaa aacatcgagc ctgttctggg ggactggaga cagagcgcca cacgccacca tccatcgaga taattcaaac ggtgcgtgtg cttgtacttg gtcgttcgac ggcggagaag ctgctccgcg gctcccgccg cgccctccgc ctgctccgag cttcgtccaa cgatggcgtc agtcgaaatt tggcaccgca ttgggctgac agagcctgac cggttcaccc aggaccggct cggtgctgtt ccggcgaggg ccgtcgtcct agaatgatcg acctgttcga actgaggaga gcgcggcagg gcgatcaagg agcggaatcg agcgtcaatc gtcgccaagg gtcaccgtgc gctctgtttg gagcgcccca aaccaaaatt ggtgatgctt cttccacctc gactgcgtgc cggcggccga cgccgcgacg catcctggac gctcgactgg ccatagttgc atgatcatgt ttacatgtgt ttttgcggga cgatcgtggt agtggggtcg acatgcccgg gcgtcatgct acctcgcgga tctcctaccg gcgacggcgc tcttcgaaat cgatcttttg ccggagagcg aagagccagc tcgccgctgg gcgatcctgg cggcacgtac gagatgcgga ggcgtgcttt agactgaact 130 LOCUS DEFINITION ACCESSION VERSION KEYWORDS SOURCE ORGANISM MF402846 1240 bp DNA linear PLN 23-MAY-2018 Curcuma zedoaria curcuminoid synthase (CURS1) gene, complete cds MF402846 MF402846.1 Curcuma zedoaria Curcuma zedoaria Eukaryota; Viridiplantae; Streptophyta; Embryophyta; Tracheophyta; Spermatophyta; Magnoliophyta; Liliopsida; Zingiberales; Zingiberaceae; Curcuma REFERENCE (bases to 1240) AUTHORS Loc,N.H., Huy,N.D., Lan,T.T.P., Quan,L.V and Nghi,N.V TITLE Identification and characterization of genes in curcuminoid pathway of Curcuma zedoaria Roscoe JOURNAL Unpublished REFERENCE (bases to 1240) AUTHORS Loc,N.H., Huy,N.D., Lan,T.T.P., Quan,L.V and Nghi,N.V TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (26-JUN-2017) Institute of Bioactive Compounds and Department of Biotechnology, College of Sciences, Hue University, 77 Nguyen Hue street, Hue, Thua Thien Hue 530000, Vietnam FEATURES Location/Qualifiers source 1240 /organism="Curcuma zedoaria" /mol_type="genomic DNA" /db_xref="taxon:136224" gene 1240 /gene="CURS1" mRNA join(1240) /gene="CURS1" /product="curcuminoid synthase 1" CDS join(1 178,249 1240) /gene="CURS1" /EC_number="2.3.1.217" /codon_start=1 /product="curcuminoid synthase 1" /protein_id="AWK77185.1" /translation="MANLHALRREQRAQGPATIMAIGTATPPNLYEQSTFPDFYFRVT NSDDKQELKKKFRRMCDKTMVKKRYLHLTEEILKERPKLCSYKEASFDDRQDIVVEEI PRLAKEAAEKAIKEWGRPKSEITHLVFCSISGIDMPGADYRLATLLGLPLTVNRLMIY SQACHMGAAMLRIAKDLAENNRGARVLVVACEITVLSFRGPNEGDFEALAGQAGFGDG AGAVVVGADPLEGIEKPIYEIAAAMQETVAESQGAVGGHLRAFGWTFYFLNQLPAIIA DNLGRSLERALAPLGVTEWNDVFWVAHPGNWAIMDAIEAKLQLSPDKLSTARHVFTEY GNMQSATVYFVMDELRKRSAVEGRSTTGDGLQWGVLLGFGPGLSIETVVLRSMPL" ORIGIN atggccaacc tccacgcgtt gcgcagggag cagagggctc aaggtcccgc caccatcatg 61 gccatcggga cggccacccc ccccaacctc tacgagcaga gcaccttccc ggacttctac 121 ttccgcgtca ccaactccga cgacaagcag gagctcaaga aaaagttccg ccgcatgtgt 181 aagtaatcga tcgatgatcc gttcagttga tgtaattcga tcggtgattg atttggagaa 241 gtaaataggc gataagacga tggtgaagaa gcggtacctg cacttgaccg aggagatcct 301 gaaggagagg cccaagctct gctcctacaa ggaggcgtcg ttcgacgacc ggcaggacat 361 cgtggtggag gagataccga gattggctaa agaagcggcg gagaaggcca tcaaggagtg 421 ggggcggccc aaatcggaga tcacccacct ggtcttctgt tccatcagcg ggatcgacat 481 gcccggcgcc gactaccgcc tcgccacgct cctcggcctc cctctcaccg tcaaccgcct 541 catgatctac agccaggcct gccacatggg cgccgccatg ctccgcatcg ccaaggacct 601 cgccgagaac aacaggggcg cgcgcgtgct ggtggtcgcc tgcgagatca ccgtgctcag 661 cttccgcggc ccgaacgagg gcgacttcga ggcgctcgcg gggcaggccg gcttcggcga 131 721 781 841 901 961 1021 1081 1141 1201 // cggcgcgggg cgagatcgcg cctgcgggcg caacctcggg cgtcttctgg gcagctgagc gcagagcgcc gcggagcacc cagcatcgag gccgtcgtcg gcggcgatgc ttcggctgga aggagcctgg gtggcgcacc ccggacaagc accgtgtact accggagacg accgttgtac tcggggccga aggagacggt cgttctactt agcgggcgtt cgggcaactg tcagcaccgc tcgtgatgga gcttgcagtg tgcgcagtat cccgctggaa ggcggagagc cctgaaccag ggcgccgctg ggccatcatg ccgccacgtc tgagctgagg gggagttctc gccactgtag ggaattgaaa cagggggcgg ctgccggcga ggggtgacgg gacgccatcg ttcacagagt aagcggtcgg ctcggttttg aacccatcta tgggcggcca tcatcgccga agtggaacga aagccaagct acggcaacat cggtggaggg ggccgggcct 132 LOCUS DEFINITION ACCESSION VERSION KEYWORDS SOURCE ORGANISM MF402847 1288 bp DNA linear PLN 23-MAY-2018 Curcuma zedoaria curcuminoid synthase (CURS2) gene, complete cds MF402847 MF402847.1 Curcuma zedoaria Curcuma zedoaria Eukaryota; Viridiplantae; Streptophyta; Embryophyta; Tracheophyta; Spermatophyta; Magnoliophyta; Liliopsida; Zingiberales; Zingiberaceae; Curcuma REFERENCE (bases to 1288) AUTHORS Loc,N.H., Huy,N.D., Lan,T.T.P., Quan,L.V and Nghi,N.V TITLE Identification and characterization of genes in curcuminoid pathway of Curcuma zedoaria Roscoe JOURNAL Unpublished REFERENCE (bases to 1288) AUTHORS Loc,N.H., Huy,N.D., Lan,T.T.P., Quan,L.V and Nghi,N.V TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (26-JUN-2017) Institute of Bioactive Compounds and Department of Biotechnology, College of Sciences, Hue University, 77 Nguyen Hue street, Hue, Thua Thien Hue 530000, Vietnam COMMENT ##Assembly-Data-START## Sequencing Technology :: Sanger dideoxy sequencing ##Assembly-Data-END## FEATURES Location/Qualifiers source 1288 /organism="Curcuma zedoaria" /mol_type="genomic DNA" /db_xref="taxon:136224" gene 1288 /gene="CURS2" mRNA join(1288) /gene="CURS2" /product="curcuminoid synthase 2" CDS join(1 184,297 1288) /gene="CURS2" /EC_number="2.3.1.217" /codon_start=1 /product="curcuminoid synthase 2" /protein_id="AWK77186.1" /translation="MAMISLQAMRKAQRAQGPATILAVGTANPPNLYEQDTYPDYYFR VTNSEHRQELKNKFRRMCEKTMVKRRYLYLTPEILKERPKLCSYMEPSFDDRQDIVVE EVPKLAAEAAEKAIKEWGGEKSAITHLVFCSISGIDMPGADYRLAKLLGLPLAVNRLM LYSQACHMGAAMLRIAKDIAENNRSARVLVVACEITVLSFRGPDERDFQALAGQAGFG DGAGAMIVGADPVLGVERPLYHIMSATQTTVPESEKAVGGHLREVGLTFHFFNQLPAI IADNVGNSLAEAFEPIGIKDWNNIFWVAHPGNWAIMDAIETKLGLEQSKLATARHVFS EFGNMQSATVYFVMDELRKRSAAENRATTGDGLRWGVLFGFGPGISIETVVLQSVPL" ORIGIN atggcgatga tcagcttgca ggcgatgcgc aaggcgcaga gagctcaagg tccggccacc 61 atcttggccg tcggcaccgc caacccgccc aatctctacg agcaggacac gtatcccgac 121 tactacttcc gcgtcaccaa ctccgagcac aggcaggagc tcaagaacaa gttccgccgc 181 atgtgtaagt tcttcgatcg atcctttttt ggttttcgaa aaaagtgagt ttttaatggg 241 aaaagcagag gatcgaggtg gaacgggagg attgatttgg tttaatttga ttgcaggcga 301 gaagacgatg gtgaagaggc ggtatcttta cctgacgccg gagatcctga aggagcggcc 361 gaagctgtgc tcgtacatgg agccgtcgtt cgacgaccgg caggacatcg tggtggagga 421 ggtgccgaag ctggccgcgg aggcagcgga gaaggccatc aaggagtggg gcggcgagaa 481 gtcggccatc acccacctgg tcttctgctc catcagcggc atcgacatgc ccggagctga 133 541 601 661 721 781 841 901 961 1021 1081 1141 1201 1261 // ctaccgcctc ccaggcctgc ccgctccgct ggacgagcgc gatgatcgtc ggcgactcag ggggctgacc cagcctggcg ggcgcacccg gagcaagctg cgtctacttc cggcgacggg cgtcgtgctc gccaagctcc cacatgggcg cgcgtcctcg gacttccagg ggggccgacc acgacggtgc ttccacttct gaggcgttcg ggcaactggg gccaccgcac gtgatggacg ctccggtggg caaagcgtgc tcgggctccc ccgccatgct tcgtcgcctg cgctggccgg ccgtcctcgg cggagagcga tcaaccagct aaccgatcgg ccatcatgga gccacgtctt agctcaggaa gcgtgctctt cgctttag gctcgccgtc gcgcatagcc cgagatcacc ccaggccggc cgtcgagcgg gaaggcggtg gccggcgatc gatcaaggac cgccatcgag ctccgagttc acggtcggcg cggcttcggc aaccgcctga aaggacatcg gtgctcagct ttcggggacg ccgctctacc gggggccacc atcgccgaca tggaacaaca accaagctgg ggcaacatgc gcggagaacc cccggcatca tgctctacag ccgagaacaa tccgcggccc gcgccggcgc acatcatgtc tccgcgaggt acgtggggaa tcttctgggt gcctggaaca agagcgccac gggcgaccac gcatcgaaac 134 LOCUS DEFINITION ACCESSION VERSION KEYWORDS SOURCE ORGANISM MF987835 1265 bp DNA linear PLN 01-SEP-2018 Curcuma zedoaria curcumin synthase (CURS3) gene, complete cds MF987835 MF987835.1 Curcuma zedoaria Curcuma zedoaria Eukaryota; Viridiplantae; Streptophyta; Embryophyta; Tracheophyta; Spermatophyta; Magnoliophyta; Liliopsida; Zingiberales; Zingiberaceae; Curcuma REFERENCE (bases to 1265) AUTHORS Loc,N.H., Huy,N.D., Truong,L.T.P., Luong,N.N., Tan,T.H., Quan,L.V and Nghi,N.V TITLE Identification and characterization of several genes in curcuminoid pathway of Curcuma zedoaria JOURNAL Unpublished REFERENCE (bases to 1265) AUTHORS Loc,N.H., Huy,N.D., Truong,L.T.P., Luong,N.N., Tan,T.H., Quan,L.V and Nghi,N.V TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (19-SEP-2017) Institute of Bioactive Compounds and Department of Biotechnology, College of Sciences, Hue University, 77 Nguyen Hue street, Hue, Thua Thien Hue 530000, Vietnam COMMENT ##Assembly-Data-START## Sequencing Technology :: Sanger dideoxy sequencing ##Assembly-Data-END## FEATURES Location/Qualifiers source 1265 /organism="Curcuma zedoaria" /mol_type="genomic DNA" /db_xref="taxon:136224" gene 1265 /gene="CURS3" /note="CzCURS3" mRNA join(1265) /gene="CURS3" /product="curcumin synthase 3" CDS join(1 178,271 1265) /gene="CURS3" /EC_number="2.3.1.217" /codon_start=1 /product="curcumin synthase 3" /protein_id="AXQ39866.1" /translation="MGSLQAIRRAQRAQGPATIMAVGTSNPPNLYEQTSYPDFYFRVT NSDHKHELKNKFRVICEKTKVKRRYLHLTEEILKQRPKLCSYMEPSFDDRQDIVVEEI PKLAKEAAEKAIKEWGRPKSEITHLVFCSISGIDMPGADYRLATLLGLPLSVNRLMLY SQACHMGAQMLRIAKDLAENNRGARVLAVSCEITVFSFRGPDAGDFEALACQAGFGDG AAAVVVGADPLPGVERPIYEIAAAMQETVPESERAVGGHLREIGWTFHFFNQLPKLIA ENIEGSLARAFKPLGISEWNDVFWVAHPGNWGIMDAIETKLGLEQGKLATARHVFSEY GNMQSATVYFVMDEVRKRSAAEGRATTGEGLEWGVLFGFGPGLTIETVVLRSVPLP" ORIGIN atgggcagcc tgcaggcgat tcgcagagca cagcgggctc aaggcccggc caccatcatg 61 gctgtcggca cctccaaccc gcctaacctc tacgagcaga cctcctaccc cgacttctat 121 ttccgcgtca ccaactccga ccacaagcac gagctcaaga acaaattccg tgttatctgg 181 aattaattcg cacccatctt ttggttattg atcagttcga tttaaattag ggagttagtt 241 aattaataat attattatta ttctaaatag gtgagaagac gaaggtgaaa agacggtact 301 tgcacttgac ggaggagatc ctgaagcaga ggcccaagct ctgctcctac atggagccct 135 361 421 481 541 601 661 721 781 841 901 961 1021 1081 1141 1201 1261 // ccttcgacga cggaaaaggc gctccatcag tccccctgtc tgctgcgcat cctgcgaaat cgtgtcaggc cgggcgtcga gcgagagggc agctgccgaa tggggatcag tggacgccat tcttcagcga ggaagcggtc tgtttgggtt cgtag ccggcaggac gatcaaggaa cggyatcgac cgtcaaccgc agccaaggac caccgtgttc cggcttcggc gaggcccatc ggtggggggc gctgatcgcg cgagtggaac cgagaccaag gtacggaaac ggcggcggag tggcccaggc atcgtggtgg tggggccgcc atgcccggcg ctcatgctct ctcgcggaga agcttccgcg gacggtgccg tacgagatcg cacctgaggg gaaaacatcg gacgtgttct ctggggctgg atgcagagcg gggcgggcca ctcaccatag aggagatacc ccaagtcgga ccgattaccg acagccaggc acaaccgggg gtcccgacgc ctgccgtcgt cggcggcgat aaatcggctg agggcagcct gggtggcgca aacaggggaa ccaccgtgta ccaccggcga aaactgtcgt gaagctggcg gatcacccac cctcgccacg ctgccacatg cgcgcgcgtc gggcgacttc cgtcggggcc gcaggaaacg gaccttccac ggcgcgggcg cccggggaat gctcgccacg cttcgtgatg aggcctggag gctacgcagt aaggaggcgg ttggtgttct ctcctcggcc ggcgcgcaga ctggccgtct gaggccctcg gaccccctcc gtgccggaga ttcttcaacc ttcaagccgc tggggcatca gcgcgccacg gacgaggtga tggggagtgc gtaccattac Phụ lục Đường chuẩn curcumin Hình Đường chuẩn curcumin dựa kết HPLC Phụ lục Hình ảnh thí nghiệm Hình 2: Tế bào nghệ đen để lắng bình tam giác 250 ml Hình 3: Cây nghệ đen in vitro Hình 4: Tế bào Callus nghệ đen Hình 5: Ni cấy tế bào nghệ đen bình tam giác 250ml đặt máy lắc Hình 6: Sinh khới tươi tế bào nghệ đen sau 14 ngày ni cấy Hình 7: Cây nghệ đen tự nhiên ... cấp ni cấy tế bào [158], [169] Từ lý trên, thực đề tài ? ?Nghiên cứu ảnh hưởng chất kích kháng lên biểu số gen tham gia vào trình tổng hợp curcuminoid tế bào nghệ đen (Curcuma zedoaria Roscoe)? ?? nhằm... CzCURS tham gia trình tổng hợp curcuminoid (các gen curcuminoid) nghệ đen - Nghiên cứu ảnh hưởng số elicitor YE, SA MeJA lên mức độ biểu gen tổng hợp curcuminoid khả tích lũy curcumin tế bào nghệ đen. .. Elicitor (hay chất kích kháng) định nghĩa chất mà đưa lượng nhỏ vào hệ thống tế bào sống khởi động cải thiện sinh tổng hợp hợp chất thứ cấp tế bào [111] Sự kích kháng thực vật (elicitation) q trình cảm