Nghiên cứu khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng thủy phân sụn khớp chân gà với xúc tác enzyme flavour nhằm thu dịch acid amin thủy phân

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA HĨA ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGÀNH: CƠNG NGHỆ THỰC PHẨM ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN PHẢN ỨNG THỦY PHÂN SỤN KHỚP CHÂN GÀ VỚI XÚC TÁC ENZYME FLAVOUR NHẰM THU DỊCH ACID AMIN THỦY PHÂN Người hướng dẫn: ThS BÙI VIẾT CƯỜNG Sinh viên thực hiện: NGUYỄN VĂN QUANG Số thẻ sinh viên: 107140144 Lớp: 14H2B Đà Nẵng, 2019 TĨM TẮT Mục đích nghiên cứu sử dụng sụn khớp chân gà để sản xuất N-acid amin thủy phân phản ứng thủy phân với xúc tác enzyme flavour Sụn khớp chân gà nguyên liệu thích hợp để sản xuất N-acid amin thủy phân với hàm lượng protein (13,34 ± 0,075%) Điều kiện phản ứng thủy phân tối ưu tương ứng với yếu tố ảnh hưởng xác định: Nhiệt độ phản ứng 500C ; nồng độ xúc tác 0,72%; thời gian phản ứng 20 phút; thể tích phản ứng 90 mL PH Hiệu suất thu hồi N-acid amin đạt giá trị cực đại (60.46 ± 1,313%) điều kiện phản ứng thủy phân tối ưu Nghiên cứu cung cấp thông tin quan trọng cho ứng dụng xúc tác enzyme flavour để thủy phân nguyên liệu phụ phẩm nhằm thu nhận N-acid amin thủy phân Theo khảo sát, thủy phân sụn khớp chân gà với xúc tác enzyme flavour chưa tiến hành giới Việt Nam ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc KHOA HÓA NHIỆM VỤ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Họ tên sinh viên: Nguyễn Văn Quang Lớp: 14H2B Số thẻ sinh viên: 107140144 Khoa: Hóa Ngành: Cơng nghệ thực phẩm Tên đề tài đồ án: Nghiên cứu khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng thủy phân sụn khớp chân gà với xúc tác enzyme flavour nhằm thu dịch acid amin thủy phân Đề tài thuộc diện: ☐ Có ký kết thỏa thuận sở hữu trí tuệ kết thực Các số liệu liệu ban đầu: Nội dung phần thuyết minh tính tốn: Lời mở đầu Chương 1: Tổng quan Chương 2: Đối tượng phương pháp nghiên cứu Chương 3: Kết thảo luận Chương 4: Kết luận kiến nghị Tài liệu tham khảo Phụ lục Các vẽ, đồ thị ( Không ) Họ tên người hướng dẫn: ThS Bùi Viết Cường Ngày giao nhiệm vụ đồ án: Ngày hoàn thành đồ án: Đà Nẵng, ngày … Tháng… năm 2019 Trưởng Bộ môn PGS.TS Đặng Minh Nhật Người hướng dẫn ThS Bùi Viết Cường LỜI MỞ ĐẦU Lí chọn đề tài Sụn khớp chân gà phụ phẩm ngành công nghiệp giết mổ gia cầm với trữ lượng lớn, Việt Nam nhập sụn khớp chân gà Công nghiệp chế biến giết mổ gà đóng vai trị quan trọng kinh tế nhiều quốc gia giới sản lượng thịt gà dự đoán đạt đến mức 97,8 triệu năm 2019 Tuy nhiên, khoảng 63% khối lượng thịt gà sử dụng làm thức ăn cho người phần cịn lại thải mơi trường dạng chất thải rắn như: chân gà, đầu, da, xương, máu lơng Trong đó, chân gà chiếm 3,9 - 5,3% khối lượng gà sản xuất phụ phẩm công nghiệp chế biến gà Phụ phẩm có giá trị dinh dưỡng thấp nước Châu Âu phụ phẩm thường làm thức ăn cho gia súc loại bỏ Nếu phụ phẩm không xử lý triệt để gây đề mơi trường lãng phí nguồn acid amin hữu Vì nghiên cứu thủy phân sụn khớp chân gà cần thiết vừa tận dụng nguồn phụ phẩm vừa tăng giá trị kinh tế cho phụ phẩm từ ngành công nghiệp giết mổ gà Từ thực tế nêu ra, đề tài “Nghiên cứu khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng thủy phân sụn khớp chân gà với xúc tác enzyme flavour nhằm thu dịch acid amin thủy phân” Mục tiêu nghiên cứu • Khảo sát thành phần hóa học sụn khớp chân gà • Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ, pH, nồng độ xúc tác, thời gian thủy phân thể tích phản ứng đến q trình thủy phân sụn khớp chân gà • Đánh giá lựa chọn điều kiện tối ưu cho yếu tố ảnh hưởng • Tìm nghiệm tối ưu Đối tượng nghiên cứu Sụn khớp chân gà tên khoa học “articular caritilage of the chicken” cung cấp cơng ty TNHH TM&DV HỒNG PHÁT Phương pháp nghiên cứu Phương pháp thủy phân, phương pháp sấy, phương pháp tro hóa khơ, phương pháp Kjeldahl, phương pháp chiết soxhlet, phương pháp đồng, xử lý số liệu phần mềm excel minitab Nội dung nghiên cứu 5.1 Xác định thành phần hóa học sụn khớp chân gà - Xác định hàm lượng ẩm, tro, protein, lipid 5.2 Nghiên cứu khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ, pH, nồng độ xúc tác, thời gian phản ứng, thể tích phản ứng 5.3 Đưa phương trình hồi quy tìm nghiệm tối ưu cho phản ứng Cấu trúc đồ án tốt nghiệp Báo cáo đồ án tốt nghiệp gồm nội dung sau: Tóm tắt Lời mở đầu Lời cảm ơn Lời cam đoan Mục lục Chương 1: Tổng quan Chương 2: Đối tượng phương pháp nghiên cứu Chương 3: Kết thảo luận Chương 4: Kết luận kiến nghị Tài liệu tham khảo Phụ lục LỜI CẢM ƠN Sau tháng nghiên cứu, hướng dẫn tận tình thầy Bùi Viết Cường, với giúp đỡ thầy cô bạn sinh viên phịng thí nghiệm, tơi hồn thành đồ án tốt nghiệp Đầu tiên, xin chân thành gửi lời cảm ơn sâu sắc tới thầy Bùi Viết Cường hết lòng hướng dẫn tận tình, giúp đỡ tơi từ việc chọn đề tài hoàn thành đồ án tốt nghiệp Thầy cấp cho tơi nhiều kiến thức bổ ích, ln định hướng, góp ý sửa chửa, để từ giúp tơi nắm bắt kĩ lưỡng, chi tiết nội dung, vấn đề liên quan đến đồ án hoàn thành đồ án cách tốt Tôi chân thành cảm ơn thầy, cô giáo môn Công nghệ Thực phẩm, thầy, phịng thí nghiệm tất bạn bè giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho suốt thời gian thực đề tài tốt nghiệp Và xin tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè quan tâm, chia sẻ động viên để tơi hồn thành công việc Cuối cho cảm ơn thầy cô hội đồng bảo vệ tốt nghiệp dành thời gian quý báu để đọc nhận xét cho đồ án Với điều kiện thời gian kinh nghiệm hạn chế sinh viên, nghiên cứu tránh thiếu sót Tơi mong nhận hướng dẫn, đóng góp ý kiến thêm thầy để tơi có điều kiện bổ sung, nâng cao kiến thức mình, phục vụ tốt cơng tác thực tế sau Trân trọng cảm ơn! Đà Nẵng, ngày tháng năm 2019 Formatted: Justified, Line spacing: Multiple 1,15 li Sinh viên thực Formatted: Justified, Line spacing: Multiple 1,15 li Nguyễn Văn Quang CAM ĐOAN Với danh dự trách nhiệm cá nhân, xin cam đoan đồ án “ Nghiên cứu khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng thủy phân sụn khớp chân gà với xúc tác enzyme flavour để thu dịch acid amin thủy phân” hướng dẫn thầy Bùi Viết Cường cơng trình nghiên cứu độc lập thực thân tơi Việc hồn thành đồ án tốt nghiệp soạn thảo cách độc lập sáng tạo không chép từ đề tài khác Các kết số liệu thu trung thực, khách quan khơng có chỉnh sửa, chép Tài liệu tham khảo sử dụng đồ án xác có độ tin cậy cao, trích dẫn đầy đủ quy định Đà Nẵng, ngày tháng năm 2019 Sinh Viên Nguyễn Văn Quang Formatted: Justified, Line spacing: Multiple 1,15 li MỤC LỤC LỜI MỞ ĐẦU Lí chọn đề tài Mục tiêu nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu 4 Phương pháp nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Xác định thành phần hóa học sụn khớp chân gà 5.1 5.2 Nghiên cứu khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ, pH, nồng độ xúc tác, thời gian phản ứng, thể tích phản ứng Đưa phương trình hồi quy tìm nghiệm tối ưu cho phản ứng 5.3 Cấu trúc đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu sụn khớp chân gà 1.1.1 Tình hình sản xuất gà giới 1.1.2 Sụn khớp chân gà 1.1.3 Thành phần hóa học sụn khớp chân gà 1.1.4 Ứng dụng sụn khớp chân gà 1.1.5 Ảnh hưởng nguyên liệu đến môi trường 1.2 Phản ứng thủy phân 1.2.1 Định nghĩa 1.2.2 Chất xúc tác thủy phân 1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình thủy phân protein sụn khớp chân gà enzyme 1.3 Axit amin 1.3.1 Giới thiệu axit amin 1.3.2 Giá trị sinh học số axit amin có sụn khớp chân gà8 1.3.3 Khả tiêu hóa protein axit amin thực phẩm người [19] 1.3.4 Các ứng dụng thương mại axit amin có sụn chân gà 11 1.4 Tối ưu hóa phương pháp bề mặt 12 1.4.1 Nguyên tắc phương pháp bề mặt đáp ứng 12 1.4.2 Ứng dụng RSM 12 1.4.3 Các mơ hình xây dựng ma trận thí nghiệm RSM 13 1.5 Tình hình nghiên cứu chiết protein từ sụn khớp gà 14 1.4.1 Tình hình nghiên cứu giới 14 1.4.2 Tình hình nghiên cứu Việt Nam 15 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 Đối tượng nghiên cứu 16 2.1.1 Nguyên liệu 16 2.1.2 Hóa chất 16 2.1.3 Chất xúc tác 16 2.2 Phương pháp nghiên cứu 17 2.2.1 Phản ứng thủy phân sụn khớp chân gà 17 2.2.2 So sánh đánh giá trình xử lý nhiệt khơng xử lý nhiệt 17 2.2.3 gà Khảo sát ảnh hưởng PH đến trình thủy phân sụn khớp chân 18 2.2.4 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến phản ứng thủy phân 17 2.2.5 Khảo sát ảnh hưởng tỉ lệ enzyme đến phản ứng thủy phân 18 2.2.6 Khảo sát ảnh hưởng thời gian phản ứng đến trình thủy phân sụn khớp chân gà 18 2.2.7 Khảo sát ảnh hưởng thể tích đến q trình thủy phân sụn khớp chân gà 18 2.2.8 2.3 Tối ưu hóa yếu tố 19 Các phương pháp phân tích 22 2.3.1 Xác định thành phần hóa học tương đối sụn khớp chân gà 22 2.3.2 Xác định hiệu suất thủy phân 22 2.3.3 Xác định hàm lượng acid amin 22 2.3.4 Phương pháp tính tốn phân tích số liệu 23 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 24 3.1 Thành phần sụn khớp chân gà 24 3.2 Đánh giá ảnh hưởng trình xử lý nhiệt khơng xử lý nhiệt ngun liệu phản ứng thủy phân 25 3.3 Kết xác định thơng số tối ưu cho q trình thủy phân sụn khớp chân gà 25 3.3.1 Kết xác định ảnh hưởng nhiệt độ 25 3.3.2 Kết xác định ảnh hưởng PH 27 3.3.3 Kết xác định ảnh hưởng nồng độ enzyme flavour đến trình thủy phân sụn khớp chân gà 28 3.3.4 Kết xác định ảnh hưởng thời gian thủy phân 29 3.3.5 Kết xác định ảnh hưởng thể tích phản ứng 30 3.4 Kết thảo luận 32 3.4.1 Kết thí nghiệm 32 3.4.2 Phương trình hồi qui 35 3.4.3 Phác đồ đường viền 2D phác đồ bề mặt 3D 36 3.4.4 Tìm nghiệm tối ưu 40 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41 4.1 Kết luận 42 4.2 Kiến nghị 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO 43 Tiếng Việt 43 Tiếng Anh Error! Bookmark not defined PHỤ LỤC 44 1.1 Nguyên tắc 45 1.2 Các bước tiến hành 45 1.2.1 Dựng đường chuẩn Tyrosin 45 1.3 Xác định hoạt tính enzyme flavour 45 1.4 Tính tốn 46 1.5 Kết Quả 46 PHỤ LỤC 46 PHỤ LỤC 49 3.1 Pha môi trường đệm 49 Nghiên cứu khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng thủy phân sụn khớp chân gà với xúc tác enzyme flavour nhằm thu dịch acid amin thủy phân Nghiệm tối ưu phương trình hồi quy phù hợp với phân tích phác đồ đường viền 2D phác đồ bề mặt 3D Hiệu suất thu nhận N-acid amin thực tế đạt giá trị cực đại Hmax = 60.46 ± 1.313% điều kiện phản ứng tối ưu Có sai khác hiệu suất thu nhận N-acid amin tính phương trình hồi quy so với thực nghiệm sai số q trình thí nghiệm, điều kiện thí nghiệm tính tốn kết thí nghiệm SVTH: Nguyễn Văn Quang - GVHD: Th.S Bùi Viết Cường 41 Nghiên cứu khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng thủy phân sụn khớp chân gà với xúc tác enzyme flavour nhằm thu dịch acid amin thủy phân CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Nghiên cứu thành cơng xây dựng mơ hình tốn học mô tả ảnh hưởng yếu tố tương tác yếu tố đến hiệu suất thu nhận N-acid amin kết hợp nhiệt độ phản ứng, pH, nồng độ xúc tác, thời gian phản ứng thể tích phản ứng Điều kiện phản ứng chuyển hóa tối ưu nhiệt độ thủy phân 73.780C, pH 7.37, nồng độ xúc tác 0.95%, thời gian thủy phân 12.43 phút thể tích phản ứng 113.78 mL phù hợp với phân tích phác đồ đường viền 2D phác đồ bề mặt 3D Với điều kiện phản ứng tối ưu, hiệu suất thu nhận N-acid amin cực đại tính phương trình hồi quy Hmax= 88.3786% thực tế Hmax= 60.46 ± 1.313% Có sai khác Hmax thực nhiệm Hmax lý thuyết q trình thí nghiệm thao tác chưa xác tuyệt đối, sai số dụng cụ thiết bị làm thí nghiệm Nghiên cứu cung cấp thông tin quan trọng cho nghiên cứu trình thủy phân phụ phẩm sụn khớp chân gà để thu hồi N-acid amin 4.2 Kiến nghị Qua trình nghiên cứu cho phép em đề xuất số ý kiến việc nghiên cứu sau: - Thực tinh chế dịch N-acid amin thủy phân thô để thu nhận chế phẩm Nacid amin - Đề xuất xây dựng quy trình sản xuất dịch N-acid amin thủy phân từ sụn khớp chân gà quy mô pilot trước đưa sản xuất quy mô công nghiệp SVTH: Nguyễn Văn Quang - GVHD: Th.S Bùi Viết Cường 42 Nghiên cứu khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng thủy phân sụn khớp chân gà với xúc tác enzyme flavour nhằm thu dịch acid amin thủy phân TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt [10] T T Truyền and B V Cường, Cơ sở kĩ thuật thực phẩm Đại học Bách Khoa Đại học Đà Nẵng, 2013 [11] T T Á Phạm Thị Trân Châu, Hóa sinh học NXB Giáo Dục, 2006 [18] Q L Hà and N T Hiền, “Công Nghệ Sản Xuất Axit Amin ứng dụng.” Nhà xuất giáo dục Việt Nam, pp 22–25, 2011 [20] N M Thủy, Dinh dưỡng người Đại học Cần Thơ, 2005 [24] T N Thao, V Nguyen, T Nhu, N T Nguyen, D Thi, and A Dao, “EXTRACTION OF CHONDROITIN SULFATE FROM CHICKEN KEEL CARTILAGE BY COMBINED APPLICATIONOF,” vol 56, pp 127–137, 2018 [25] N H Huong, “Thuc hanh hoa sinh,” 2009 [26 ] Cuong Viet Bui, W.S Wareepat Tiyabhorn, N.L Thammanont Wattanasiritham, and and Siwarutt Boonyarattanakalin, Conversion of konjac powder into glucomannan-oligosaccharides, mannose, and glucose by hydrolysis facilitated by microwave heating and HCl catalyst 2016 [27]TCVN 3708 – 1990 Tiếng Anh [4] and F U N J Graf 1, E Stofft 2, U Freese 1, “The ultrastructure of articular cartilage of the chicken’s knee joint,” pp 113–119, 1993 [7] S C Shin, S J You, B K An, and C W Kang, “Study on extraction of mucopolysaccharide-protein containing chondroitin sulfate from chicken keel cartilage,” Asian-Australasian J Anim Sci., vol 19, no 4, pp 601–604, 2006 [8] J M Seyer, D M Brickley, and M J Glimcher, “The identification of two types of collagen in the articular cartilage of postnatal chickens,” Calcif Tissue Res., vol 17, no 1, pp 43–55, 1974 [9] A Lasekan, F Abu Bakar, and D Hashim, “Potential of chicken by-products as sources of useful biological resources,” Waste Manag., vol 33, no 3, pp 552–565, 2013 [12] B Liaset, K Julshamn, and M Espe, “Chemical composition and theoretical nutritional evaluation of the produced fractions from enzymic hydrolysis of salmon frames with ProtamexTM,” Process Biochem., vol 38, no 12, pp 1747–1759, 2003 [15] G Wu, F W Bazer, and J Wang, “Amino Acid Nutrition in Animals : Protein Synthesis and Beyond Amino Acid Nutrition in Animals : Protein Synthesis and Beyond,” no November 2015, 2014 [19] S Gilani et al., “Report of a Sub-Committee of the 2011 FAO Consultation on " Protein Quality Evaluation in Human Nutrition " on: The assessment of amino acid digestibility in foods for humans and including a collation of published ileal amino acid digestibility ,” vol 2012, no August 2011, 2012 SVTH: Nguyễn Văn Quang - GVHD: Th.S Bùi Viết Cường 43 Nghiên cứu khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng thủy phân sụn khớp chân gà với xúc tác enzyme flavour nhằm thu dịch acid amin thủy phân [22] T Nakano and J S Sim, “A Study of the Chemical Composition of the Proximal Tibial Articular Cartilage and Growth Plate of Broiler Chickens,” pp 538– 550, 1994 [23] E S NASCIMENTO, C A de A GADELHA, M S MADRUGA, T K A BEZERRA, T SANTI-GADELHA, and Í B da S ARẲJO, “Optimal conditions for obtaining collagen from chicken feet and its characterization,” Food Sci Technol., vol 38, no suppl 1, pp 167–173, 2018 Trang web [1] “Toàn cảnh thị trường thịt tháng đến tháng 12/2018,” 2019 [Online] Available: http://agromonitor.vn/toan-canh-thi-truong-thit-thang-12-2018 -nhu-cau-su-dung-thitga-tang-manh-trong-boi-canh-dich-lmlm-tren-heo-lan-rong-va-kho-kiem-soat-day-giaga-mien-bac-tang-tot-trong-nhung-tuan-cuoi-thang_101526.html [Accessed: 17-Mar2019] [2] “Tổng quan ngành chăn nuôi gà Việt Nam,” 2017 [Online] Available: http://nhachannuoi.vn/tong-quan-ve-nganh-chan-nuoi-ga-cua-viet-nam/ [Accessed: 29-Dec-2018] [3] David L Meeker, “Chế biến phụ phẩm giết mổ,” 2004 [Online] Available: http://assets.nationalrenderers.org/essential_rendering_book_vietnamese.pdf [Accessed: 30-Dec-2018] [5] “Lịch sử nghiên cứu Collagen,” 2018 [Online] Available: http://collagen6500.com/tin-tuc/lich-su-nghien-cuu-collagen/ [Accessed: 19-Mar2019] [14] “Các acid amin vai trò dinh dưỡng chúng,” 2015 [Online] Available: https://voer.edu.vn/m/cac-acid-amin-va-vai-tro-dinh-duong-cua-chung/5a88396b [Accessed: 27-Mar-2019] [28] “Acid amin,” 2018 [Online] Available: http://huepharmuni.edu.vn/index.php/vi/tin-tuc/thong-tin-y-duoc/310-cac-phuong-phap-san-xuat-acidamin [6] “No Title.” [Online] Available: https://www.nirschl.com/knee-replacement/ [Accessed: 03-Apr-2019] [13] “Axit Amin,” 2018 [Online] Available: https://vi.wikipedia.org/wiki/Axit_amin [Accessed: 28-Mar-2019] [16] “Proline,” 2018 [Online] Available: https://aminoacidsguide.com/Pro.html [Accessed: 28-Mar-2019] [17] “Alanine,” 2018 [Online] Available: https://aminoacidsguide.com/Ala.html [Accessed: 28-Mar-2019] [21] “Commercial Applications of Amino Acids: Applications,” 2019 [Online] Available: http://www.biologydiscussion.com/amino-acids/commercialapplications-of-amino-acids-3-applications/10334 [Accessed: 28-Mar-2019] SVTH: Nguyễn Văn Quang - GVHD: Th.S Bùi Viết Cường 44 Nghiên cứu khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng thủy phân sụn khớp chân gà với xúc tác enzyme flavour nhằm thu dịch acid amin thủy phân PHỤ LỤC XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ENZYME FlAVOUR 1.1 Nguyên tắc Dưới tác dụng protease, casein bị phân giải thành đoạn peptide ngắn acid amin có tyrosine Xác định lượng tyrosine tạo thành thuốc thử Folin, phản ứng tyrosine làm Follin chuyển thành màu xanh hấp thu quang mạnh bước sóng 660nm Dựa vào đồ thị chuẩn để tính lượng tyrosin tương ứng với lượng sản phẩm thủy phân tác dụng enzyme 1.2 Các bước tiến hành 1.2.1 Dựng đường chuẩn Tyrosin Pha dung dịch Tyrosin 1mM: Cân xác 90,595mg Tyrosin thêm dung dịch HCl 0,1M cho vừa đủ 500 mL Từ dung dịch pha tiếp dung dịch Tyrosin nồng độ khác nhau: 0; 0.1; 0.2; 0.4; 0.8 mM Cách pha theo bảng sau: [Tyrosine] (mM) 0.1 0.2 0.4 0.8 HCl 0,1M (ml) 0.9 0.8 0.6 0.2 Tyrosine 1mM (ml) 0.1 0.2 0.4 0.8 Thêm ml dung dịch Na2CO3 0,4 M vào ml dung dịch Tyrosin (các nồng độ khác trên) thêm mL thuốc thử Folin pha loãng lần vào dung dịch hỗn hợp Sau trộn đều, để ổn định dung dịch 15 phút Đo độ hấp thụ dung dịch bước sóng 660 nm (ghi nhận kết A0; A1; A2; A3; A4; A5) Dựng đường chuẩn theo hàm lượng g Tyrosin độ hấp thụ 1.3 Xác định hoạt tính enzyme flavour Cho ml dung dịch chất casein 1% vào ống nghiệm, ủ nhiệt độ 37  0,5oC 10 -15 phút Sau thời gian ủ, cho mL dung dịch enzyme vào lắc Đem ủ hỗn hợp nhiệt độ 37  0,50C 60 phút Sau đó, cho vào hỗn hợp mL dung dịch acid Trichloracetic 0,4M Để ổn định dung dịch 15 phút, sau lọc dung dịch qua giấy lọc để loại tủa Cho ml dung dịch Na2CO3 0,4M vào ml dịch lọc, thêm ml thuốc thử Folin pha loãng lần vào dung dịch hỗn hợp Trộn đều, để yên 15 phút Khi dung dịch xuất màu xanh, đem đo độ hấp thụ bước sóng 660 nm (Am) Mẫu đối chứng: lấy mL enzyme, ml dung dịch acid Trichloracetic 0,4M cho vào ống nghiệm lắc Thêm mL dung dịch chất casein 1% tiến hành bước tương tự mẫu thí nghiệm với điều kiện Ghi nhận kết độ hấp thụ bước sóng 660 nm (At) SVTH: Nguyễn Văn Quang - GVHD: Th.S Bùi Viết Cường 45 Nghiên cứu khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng thủy phân sụn khớp chân gà với xúc tác enzyme flavour nhằm thu dịch acid amin thủy phân 1.4 Tính tốn Một đơn vị hoạt tính (ĐVHT) enzyme protease xác định lượng enzyme để tạo lượng amino acid tương đương với 1M Tyrosin phút điều kiện thí nghiệm Hoạt tính enzyme protease: N= ( Am − At ) − b  a V  1000 t ve Trong đó: Am: Độ hấp thụ mẫu At: Độ hấp thụ mẫu đối chứng a,b: Là hệ số lấy từ phương trình đường chuẩn tyrosin ( y= ax+b) 1000: hệ số chuyển đổi từ mM sang M V: Tổng thể tích hỗn hợp ống nghiệm (4ml) (mL) t: Thời gian thực phản ứng (phút) v: Thể tích dịch lọc đem đo OD (1mL) (mL) e: Thể tích dịch enzyme đem đo hoạt tính (mL) N: Hoạt độ enzyme (UI/mL) 1.5 Kết Quả [Tyrosine] (mM) 0.1 0.2 0.4 0.8 Giá trị OD 0,152 0,274 0,59 1,18 1,411 OD mẫu: Flavourzyme: 0,033 SVTH: Nguyễn Văn Quang - GVHD: Th.S Bùi Viết Cường 46 Nghiên cứu khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng thủy phân sụn khớp chân gà với xúc tác enzyme flavour nhằm thu dịch acid amin thủy phân PHỤ LỤC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH CÁC CHỈ TIÊU HÓA SINH 2.1 Xác định hàm lượng ni-tơ tổng số protein thô thịt đỏ cá ngừ phương pháp Kjeldhal 2.1.1 Ngun lý Vơ hóa mẫu H2SO4 đậm đặc chất xúc tác, sau dùng kiềm mạnh (NaOH hay KOH) để đẩy NH3 từ muối (NH4)2SO4 hình thành thể tự Định lượng NH3 HCl 2.1.2 Cách tiến hành Hỗn hợp xúc tác: 2,5g bột selenium dioxide (SeO2) + 100g Kali sunfat (K2SO4) + 20g đồng sunfat (CuSO4.5H2O) Cân xác – 4g mẫu cho vào bình Kjeldhal 250mL, cho tiếp 2g hỗn hợp chất xúc tác 25mL acid sunfuric (H2SO4) 95% - 97% Sau đun nóng bình Kjeldhal có chưa mẫu chất xúc tác lửa nhỏ cho chất lỏng bình khơng sủi bọt, khơng bắt lên cổ bình Trong q trình gia nhiệt, lắc bình Kjeldhal nhiều lần để tạ pha đồng Mẫu đun nóng dịch bình chuyển sang màu xanh nhạt mặt bình hồn tồn Ngừng đun, làm lạnh dung dịch phân hủy định mức lên 100mL nước cất Ni-tơ protein mẫu phản ứng với H2SO4 tạo thành (NH4)2SO4 Chất xúc tác Dùng pipet hút 5mL dung dịch sau pha loãng cho vào bình chưng cất, thêm 10mL NaOH 30% Khi chưng cất, (NH4)2SO4 phản ứng với NaOH giải phóng NH3 ngưng tụ ống sinh hàn Amoniac thu lại bình nón có chứa giọt thị Hỗn hợp thị gồm 10mL bromocresol xanh 0,1% + 2mL dung dịch metyl đỏ - 0,1% metyl đỏ cồn 95% (w/v) + 5mL acid boric (H3BO3) 2% Aicd boric có dung dịch thị chuyển từ màu tím sang màu xanh tác dụng với NH3 Hỗn hợp bình nón chuẩn độ acid clohydric (HCl) dung dịch màu xanh Thực tương tự mẫu trắng nước cất Xanh Không màu 2.1.3 Tính kết Ni-tơ protein mẫu tính theo cơng thức: (ST − BT) × M × 14 × V × 100 Nitrogen (%) = AD × W × 1000 Protein (%) = Nitrogen (%) × 6,25 SVTH: Nguyễn Văn Quang - GVHD: Th.S Bùi Viết Cường 47 Nghiên cứu khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng thủy phân sụn khớp chân gà với xúc tác enzyme flavour nhằm thu dịch acid amin thủy phân Trong đó: ST: thể tích HCl tiêu tốn chuẩn độ mẩu thử (mL) BT: thể tích HCl tiêu tốn chuẩn độ mẫu trắng (mL) M: nồng độ HCl (M) V: thể tích mẫu sau phân hủy (mL) AD: thể tích mẫu phân hủy lấy (5mL) W: khối lượng mẫu khơ (g) 100: hệ số tính phần trăm 2.2 Xác định hàm lượng chất béo phương pháp chiết Soxhlet 2.2.1 Nguyên tắc Chất béo nguyên liệu trích ly ete etylic thiết bị chết Soxhlet Dung môi làm bay lượng chất béo lại xác định cách cân 2.2.2 Tiến hành Cân 10 – 20g mẫu thử cho vào bình chiết thiết bị nối với bình cầu Chất béo thơ mẫu chiết dầu ete tuần hồn chứa bình cầu Thời gian chiết 16h với tốc độ tuần hồn ete từ bình chiết xuống bình cầu ngược lại – lần 1h Quá trình chiết thực nồi chưng cách thủy Chất béo thô thu nhận ống nghiệm thiết bị Soxhlet Vào cuối q trình chiết, dung mơi bị bốc hết ngưng tụ lên bình chiết máy cất Chất béo thơ sấy khơng khí nóng với nhiệt độ sấy 80 - 90°C thời gian 45 – 50 phút Đem để nguội bình hút ẩm cân Quá trình sấy lặp lại chênh lệch khối lượng hai lần liên tiếp nhỏ 1mg 2.2.3 Tính kết Hàm lượng chất béo (X%), biểu thị phần tram khối lượng theo công thức: Mchất béo 𝑋(%) = × 100 Mmẫu thử Trong đó: Mchất béo – khối lượng chất béo thu (g) Mmẫu thử – khối lượng mẫu thử (g) 2.3 Phương pháp xác định hàm lượng tro tổng số 2.3.1 Nguyên tắc Mẫu nung nhiệt độ từ 500°C đến 550°C để đốt cháy hết hợp chất hữu sau cân phần tro cịn lại 2.3.2 Cách tiến hành Cân xác 5g đến 10g mẫu, cho vào chén sứ biết trước khối lượng Cho chén chứa mẫu thử vào lò nung, nâng nhiệt độ từ từ đến khoảng 525°C giữ thời gian đến mẫu thử thành tro trắng Tắt điện lò nung, chờ cho nhiệt độ hạ bớt lấy chén tro ra, sau làm nguội bình hút ẩm mang cân Tiếp tục nung nhiệt độ 30 phút, để nguội cân Quá trình lặp lại chênh lệch khối lượng hai lần liên tiếp nhỏ 1mg SVTH: Nguyễn Văn Quang - GVHD: Th.S Bùi Viết Cường 48 Nghiên cứu khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng thủy phân sụn khớp chân gà với xúc tác enzyme flavour nhằm thu dịch acid amin thủy phân 2.3.3 Tính kết Hàm lượn tro tổng số, X1, tính theo cơng thức: (W2 − W) × 100 % X1 (%) = (W1 − W) Trong đó: W1: khối lượng chén sứ mẫu thử, tính theo g W2: khối lượng chén sứ tro, tính theo g W: khối lượng chén sứ, tính theo g 2.4 Phương pháp xác định hàm lượng ẩm 2.4.1 Nguyên tắc Dùng nhiệt để loại bỏ nước khỏi mẫu thử Hiệu số khối lượng mẫu trước sau sấy khơ lượng nước có mẫu thử 2.4.2 Cách tiến hành Cân xác 5g mẫu cho vào cốc sứ Sau đem mẫu sấy khơ khơng khí nóng nhiệt độ 100°C 18h Sau sấy, làm nguội mẫu bình hút ẩm đem cân Tiếp tục sấy đến khối lượng chênh lệch hai lần cân liên tiếp nhỏ – 5mg 2.4.3 Tính kết Độ ẩm mẫu tính cơng thức: (W1 − W2 ) × 100 % Độ ẩm (%, theo khối lượng) = W1 − W Trong đó: W: khối lượng đĩa nhôm sạch, (g) W1: khối lượng đĩa nhôm mẫu thử trước sấy, (g) W2: khối lượng đĩa nhôm mẫu thử sau sấy, (g) PHỤ LỤC 3.1 Pha môi trường đệm ❖ pH = 3,4,5,6 Sử dụng dung dịch đệm citrate (pH = 3,0– 6,2) - Dung dịch acid citric 0,1M (a): 21,01 g C6H8O7.H2O hòa tan định mức đến 1000 mL - Dung dịch trinatri citrate 0,1M (b): 29,41 g C6H5O7Na3.2H2O hòa tan dẫn nước đến 1000 mL Dung dịch đệm citrate có giá trị pH khác phụ thuộc vào số ml dung dịch (a) số ml dung dịch (b) theo bảng sau: pH a b 46,5 3.5 33 17 20,5 29,5 9,5 40,5 SVTH: Nguyễn Văn Quang - GVHD: Th.S Bùi Viết Cường 49 Nghiên cứu khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng thủy phân sụn khớp chân gà với xúc tác enzyme flavour nhằm thu dịch acid amin thủy phân ❖ pH=7,8,9,10 Sử dụng dung dịch đệm vạn 0,1M - Dung dịch acid acetic 0,1M (a): 5,7 ml CH3COOH đặc định mức nước cất đến 1000 ml - Dung dịch acid phosphoric 0,1M (b): 6,45 ml H3PO4 đậm đặc định mức nước cấtđến 1000 ml - Dung dịch acid ortho-boric 0,1M (c): hòa tan 6,18 g acid ortho-boric nước cất định mức đến 1000 mL - Dung dịch natri hydroxide 1N (d): hòa tan 40 g NaOH nước cất định mức đến 1000 mL Trộn lẫn dung dịch (a), (b), (c) với thể tích nhận dung dịch đệm 0,1M có pH = 1,8 Điều chỉnh giá trị pH dung dịch đệm khoảng pH = 1,8 đến pH = 10 cách bổ sung dung dịch NaOH 1N (d) Các dung dịch đệm vạn nồng độ khác chuẩn bị tương tự SVTH: Nguyễn Văn Quang - GVHD: Th.S Bùi Viết Cường 50 Nghiên cứu khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng thủy phân sụn khớp chân gà với xúc tác enzyme flavour nhằm thu dịch acid amin thủy phân PHỤ LỤC ẢNH HƯỞNG CỦA NHIỆT ĐỘ THỦY PHÂN ĐẾN QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN SỤN KHỚP CHÂN GÀ Bảng 4.1 Kết đo ảnh hưởng nhiệt độ phản ứng đến hiệu suất thủy phân Nhiệt độ phản ứng Giá trị 1(%) Giá trị 2(%) Giá trị 3(%) Trung bình Độ lệch chuẩn (0C) 30 29.37 29.42 27.25 28.68 1.24 40 24.79 31.24 45.50 33.84 10.60 50 43.69 53.88 41.68 46.42 6.54 60 41.03 30.02 29.10 33.38 6.64 70 30.69 38.34 26.46 31.83 6.02 80 26.89 26.98 26.94 0.06 Bảng 4.2 Kết đo ảnh hưởng nhiệt độ phản ứng đến hiệu suất thu nhận N-acid amin Nhiệt độ phản ứng Giá trị 1(%) Giá trị 2(%) Giá trị 3(%) Trung bình Độ lệch chuẩn ( C) 30 2.099 2.099 3.148 2.45 0.61 40 3.130 3.123 2.099 2.78 0.59 50 3.161 4.206 3.155 3.51 0.61 60 4.215 4.206 3.148 3.86 0.61 70 4.198 3.136 3.148 3.49 0.61 80 2.086 1.049 1.57 0.73 SVTH: Nguyễn Văn Quang - GVHD: Th.S Bùi Viết Cường 51 Nghiên cứu khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng thủy phân sụn khớp chân gà với xúc tác enzyme flavour nhằm thu dịch acid amin thủy phân PHỤ LỤC ẢNH HƯỞNG CỦA pH ĐẾN QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN SỤN KHỚP CHÂN GÀ Bảng 5.1 Kết đo ảnh hưởng pH đến hiệu suất thủy phân pH Giá trị 1(%) Giá trị 2(%) Giá trị 3(%) Trung bình Độ lệch chuẩn 15.87 13.76 18.32 15.98 2.28 17.92 17.63 15.17 16.91 1.51 17.95 19.95 18.52 18.81 1.03 16.76 19.25 18.19 18.07 1.25 11.82 13.39 15.00 13.40 1.59 7.41 14.10 10.75 10.75 3.35 7.25 11.82 10.40 9.82 2.34 Bảng 5.2 Kết đo ảnh hưởng pH đến hiệu suất thu nhận N-acid amin pH Giá trị 1(%) Giá trị 2(%) Giá trị 3(%) Trung bình Độ lệch chuẩn 8.396 10.495 10.453 9.78 1.20 13.481 15.711 13.671 14.29 1.24 16.691 19.980 17.841 18.17 1.67 15.774 14.752 15.805 15.44 0.60 5.268 5.206 4.215 4.90 0.59 4.198 4.181 3.161 3.85 0.59 2.091 1.054 1.052 1.40 0.60 SVTH: Nguyễn Văn Quang - GVHD: Th.S Bùi Viết Cường 52 Nghiên cứu khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng thủy phân sụn khớp chân gà với xúc tác enzyme flavour nhằm thu dịch acid amin thủy phân PHỤ LỤC ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ XÚC TÁC ĐẾN QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN SỤN KHỚP CHÂN GÀ Bảng 6.1 Kết đo ảnh hưởng nồng độ xúc tác đến hiệu suất thủy phân Nồng độ xúc Giá trị 1(%) Giá trị 2(%) Giá trị 3(%) Trung bình Độ lệch chuẩn tác (%) 0.32 17.95 19.95 18.52 18.81 1.03 0.42 17.83 20.63 18.89 19.12 1.42 0.52 18.68 19.33 20.06 19.35 0.69 0.62 18.89 19.25 20.58 19.57 0.89 0.72 21.11 18.84 19.00 19.65 1.26 0.82 21.48 19.74 18.19 19.80 1.64 0.92 22.13 19.58 17.79 19.83 2.18 Bảng 6.2 Kết đo ảnh hưởng nồng độ xúc tác đến hiệu suất thu nhận N-acid amin Nồng độ xúc Giá trị 1(%) Giá trị 2(%) Giá trị 3(%) Trung bình Độ lệch chuẩn tác (%) 0.32 16.691 19.980 17.841 18.17 1.67 0.42 19.980 18.891 19.980 19.62 0.63 0.52 19.900 20.782 19.821 20.17 0.53 0.62 22.083 21.074 20.864 21.34 0.65 0.72 23.994 22.996 21.908 22.97 1.04 0.82 24.042 23.042 23.181 23.42 0.54 0.92 23.275 24.138 22.996 23.47 0.60 SVTH: Nguyễn Văn Quang - GVHD: Th.S Bùi Viết Cường 53 Nghiên cứu khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng thủy phân sụn khớp chân gà với xúc tác enzyme flavour nhằm thu dịch acid amin thủy phân PHỤ LỤC ẢNH HƯỞNG CỦA THỜI GIAN THỦY PHÂN ĐẾN QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN SỤN KHỚP CHÂN GÀ Bảng 7.1 Kết đo ảnh hưởng thời gian đến hiệu suất thủy phân Thời gian (phút) Giá trị 1(%) Giá trị 2(%) Giá trị 3(%) Trung bình Độ lệch chuẩn 10 16.23 12.70 14.98 14.64 1.79 20 21.11 18.84 19.00 19.65 1.26 30 18.89 19.58 21.01 19.82 1.08 40 21.01 19.25 22.22 20.83 1.49 50 22.01 22.44 25.02 23.15 1.63 60 23.59 22.60 25.40 23.86 1.42 70 23.13 23.66 25.25 24.01 1.10 80 23.66 25.63 23.81 24.36 1.10 Bảng 7.2 Kết đo ảnh hưởng thời gian đến hiệu suất thu nhận N-acid amin Thời gian Giá trị 1(%) Giá trị 2(%) Giá trị 3(%) Trung bình Độ lệch chuẩn (phút) 10 17.877 20 23.994 30 16.792 15.711 16.79 1.08 22.996 21.908 22.97 1.04 23.135 23.088 23.135 23.12 0.03 40 23.136 23.181 24.138 23.48 0.57 50 25.087 24.235 21.995 23.77 1.60 60 24.042 25.238 22.039 23.77 1.62 70 24.186 24.186 23.135 23.84 0.61 80 25.238 23.181 24.138 24.19 1.03 SVTH: Nguyễn Văn Quang - GVHD: Th.S Bùi Viết Cường 54 Nghiên cứu khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng thủy phân sụn khớp chân gà với xúc tác enzyme flavour nhằm thu dịch acid amin thủy phân PHỤ LỤC ẢNH HƯỞNG CỦA THỂ TÍCH PHẢN ỨNG ĐẾN QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN SỤN KHỚP CHÂN GÀ Bảng 8.1 Kết đo ảnh hưởng thể tích phản ứng đến hiệu suất thủy phân Thể tích phản ứng Giá trị 1(%) Giá trị 2(%) Giá trị 3(%) Trung bình Độ lệch chuẩn (mL) 30 10.05 13.76 11.46 11.76 1.87 50 21.11 18.84 19.00 19.65 1.26 70 23.59 21.54 22.60 22.57 1.03 90 26.01 25.25 26.66 25.97 0.71 110 30.44 28.75 27.61 28.93 1.42 130 35.71 33.60 34.39 34.57 1.07 Bảng 8.2 Kết đo ảnh hưởng thể tích phản ứng đến hiệu suất thu nhận N-acid amin Thể tích phản ứng Giá trị 1(%) Giá trị 2(%) Giá trị 3(%) Trung bình Độ lệch chuẩn (mL) 30 6.927 9.445 8.202 8.19 1.26 50 23.994 22.996 21.908 22.97 1.04 70 24.878 27.972 30.916 27.92 3.02 90 39.910 41.643 41.148 40.90 0.89 110 43.693 38.862 44.133 42.23 2.92 130 43.484 46.573 43.658 44.57 1.74 SVTH: Nguyễn Văn Quang - GVHD: Th.S Bùi Viết Cường 55 ... 1,15 li Nghiên cứu khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng thủy phân sụn khớp chân gà với xúc tác enzyme flavour nhằm thu dịch acid amin thủy phân Protein có sụn khớp chân gà có acid amin có giá... Nghiên cứu khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng thủy phân sụn khớp chân gà với xúc tác enzyme flavour nhằm thu dịch acid amin thủy phân 1.3.4 Các ứng dụng thương mại axit amin có sụn chân gà. .. ? ?Nghiên cứu khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng thủy phân sụn khớp chân gà với xúc tác enzyme flavour nhằm thu dịch acid amin thủy phân? ?? Mục tiêu nghiên cứu • Khảo sát thành phần hóa học sụn khớp