Nghiên cứu vi sinh vật sinh methane ứng dụng cho sản xuất biogas trong điều kiện môi trường nước lợ và nước mặn 001

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN THU HOÀI NGHIÊN CỨU VI SINH VẬT SINH METHANE ỨNG DỤNG CHO SẢN XUẤT BIOGAS TRONG ĐIỀU KIỆN MÔI TRƯỜNG NƯỚC LỢ VÀ NƯỚC MẶN LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội – 2015 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN THU HOÀI NGHIÊN CỨU VI SINH VẬT SINH METHANE ỨNG DỤNG CHO SẢN XUẤT BIOGAS TRONG ĐIỀU KIỆN MÔI TRƯỜNG NƯỚC LỢ VÀ NƯỚC MẶN Chuyên ngành: VI SINH VẬT HỌC Mã số: 62 420107 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS Đinh Thúy Hằng GS TS Nguyễn Lân Dũng Hà Nội - 2015 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây cơng trình nghiên cứu tơi số kết cộng tác với cộng khác Các số liệu trình bày luận án trung thực, phần công bố tập san tạp chí khoa học chuyên ngành với đồng ý đồng tác giả Phần cịn lại chưa cơng bố cơng trình khác Tác giả luận án Nguyễn Thu Hồi LỜI CẢM ƠN Thành cơng Luận án kết cố gắng nỗ lực thân suốt trình nghiên cứu, tìm hiểu đề tài Đồng thời thân tơi cịn nhận giúp đỡ tạo điều kiện thầy cô hướng dẫn, anh chị bạn đồng nghiệp Trước tiên, cho phép gửi lời cảm ơn chân thành tới tập thể cán Phòng Sinh thái Vi sinh vật, Phịng Cơng nghệ Enzyme - Protein Viện Vi sinh vật Công nghệ sinh học - Đại học Quốc Gia Hà Nội tạo điều kiện, giúp đỡ sở vật chất khích lệ tơi q trình thực tập Nghiên cứu sinh Với lịng biết ơn sâu sắc tơi xin gửi cảm ơn tới TS Đinh Thúy Hằng - Trưởng phòng Sinh thái Vi sinh vật, Viện Vi sinh vật Công nghệ sinh học - ĐHQGHN người trực tiếp định hướng nghiên cứu, hướng dẫn bảo tận tình cho tơi suốt q trình thực luận án Đồng gửi lời cảm ơn tới GS.TS Nguyễn Lân Dũng - chuyên gia cao cấp Viện Vi sinh vật Công nghệ sinh học - người cho nhiều lời khuyên bảo giúp đỡ thời gian nghiên cứu luận án Tôi gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban lãnh đạo Viện Vi sinh vật Công nghệ sinh học - ĐHQGHN tạo điều kiện thuận lợi sở vật chất giúp tơi hồn thành Luận án Tơi xin chân thành cảm ơn Thường vụ Đảng ủy, Ban Tổng Giám đốc Trung tâm nhiệt đới Việt - Nga tạo điều kiện giúp đỡ khuyến khích, động viên tơi suốt q trình làm Nghiên cứu sinh Tôi mong muốn cảm ơn đến Phân viện trưởng bạn đồng nghiệp Phân viện Công nghệ sinh học, Trung tâm nhiệt đới Việt - Nga nhiệt tình giúp đỡ, động viên, tạo điều kiện thời gian sở vật chất suốt thời gian tham gia làm Nghiên cứu sinh Tôi muốn gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS TS Bùi Thị Việt Hà - Chủ nhiệm Bộ môn Vi sinh vật, thầy cô giáo Bộ môn Vi sinh vật học Khoa sinh học, Trường Đại học Khoa học tự nhiên - ĐHQGHN trực tiếp giảng dạy giúp đỡ tơi khóa học Nghiên cứu sinh Cuối tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới gia đình, bạn bè người thân ln ủng hộ, cổ vũ động viên vượt qua khó khăn q trình học tập nghiên cứu Hà Nội, ngày 05 tháng 12 năm 2015 Nguyễn Thu Hoài MỤC LỤC Lời cam đoan Lời cảm ơn Mục lục Danh mục ký hiệu chữ viết tắt Danh mục bảng Danh mục hình vẽ, đồ thị MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Xử lý chất thải hữu theo công nghệ phân hủy kỵ khí sinh methane điều kiện nhiễm mặn 1.1.1 Ơ nhiễm chất thải hữu mơi trường nhiễm mặn 1.1.2 Xử lý ô nhiễm chất hữu phân hủy kỵ khí 1.1.3 Xử lý chất thải hữu phân hủy kỵ khí điều kiện nhiễm mặn 1.2 Bản chất sinh học phân hủy kỵ khí sinh methane 1.3 Đa dạng di truyền đặc tính sinh học VSVSMT 1.3.1 Phân bố VSVSMT tự nhiên 1.3.2 Vị trí phân loại VSVSMT 1.3.3 Đặc tính sinh học VSVSMT 1.3.3.1 Cơ chất q trình phân hủy kỵ khí sinh methane 1.3.3.2 Sinh hóa q trình phân hủy kỵ khí sinh methane 1.3.3.3 Một số phương pháp nghiên cứu quần xã VSVSMT 1.3.3.4 VSVSMT môi trường nước lợ nước biển 1.4 Công nghệ xử lý chất thải hữu phân hủy kỵ khí sinh methane 1.4.1 Một số công nghệ phổ biến 1.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến phân hủy kỵ khí sinh methane 1.4.2.1 Cân dinh dưỡng 1.4.2.2 Các yếu tố lý hóa sinh học 1.5 Nghiên cứu VSVSMT công nghệ phân hủy kỵ khí tạo biogas Việt Nam Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu 2.1.1 Đối tượng, vật liệu nghiên cứu 2.1.2 Hóa chất, mơi trường thiết bị 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Làm giàu phân lập VSVSMT 2.2.1.1 Làm giàu VSVSMT 2.2.1.2 Phân lập VSVSMT 2.2.2 Nghiên cứu đặc tính sinh học VSVSMT 2.2.2.1 Quan sát đặc điểm hình thái 2.2.2.2 Xác định ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy đến sinh trưởng VSVSMT 2.2.3 Tách DNA tổng số từ mẫu môi trường chủng khiết 2.2.3.1 Tách DNA tổng số từ mẫu môi trường 2.2.3.2 Tách DNA tổng số chủng khiết 2.2.3.3 Điện di DNA gel agarose 2.2.4 Phương pháp PCR- DGGE 2.2.4.1 Khuếch đại đoạn 16S rDNA cho phân tích DGGE 2.2.4.2 Điện di biến tính DGGE 2.2.4.3 Cắt băng thơi gel 2.2.5 Phân tích trình tự 16S rDNA chủng VSVSMT 2.2.6 Thiết lập phân tích thư viện gen mcrA(clone library) 2.2.6.1 Nhân PCR tinh sản phẩm 2.2.6.2 Phản ứng ghép nối gen vào vector 2.2.6.3 Biến nạp DNA plasmid vào tế bào khả biến E.coli DH5α phương pháp sốc nhiệt 2.2.6.4 Tách dịng giải trình tự gen mcrA 2.2.6.5 Phân tích trình tự gen mcrA dựng phân loại 2.2.7 Phân tích hóa học 2.2.7.1 Phân tích COD hòa tan 2.2.7.2 Xác định hàm lượng muối nước 2.2.7.3 Xác định tổng thể tích khí sinh q trình phân hủy kỵ khí 2.2.7.4 Xác định hàm lượng methane mơ hình thí nghiệm 2.2.7.5 Xác định hoạt tính sinh methane 2.2.8 Thiết lập mơ hình phân hủy kỵ khí chất thải hữu điều kiện nước lợ nước mặn 2.3 Sơ đồ mô tả bước thí nghiệm Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Làm giàu VSVSMT từ trầm tích biển Nha Trang Cát Bà 3.1.1 Làm giàu VSVSMT môi trường nước lợ 3.1.2 Làm giàu VSVSMT môi trường nước mặn 3.2 VSVSMT chiếm ưu mẫu làm giàu 3.2.1 Mẫu làm giàu methanol acetate 3.2.2 Mẫu làm giàu rong biển Ulva sp 3.2.2.1 Phân tích PCR-DGGE đoạn 16S rDNA 3.2.2.2 Đánh giá VSVSMT mẫu làm giàu rong biển qua thư viện gen mcrA 3.3 Phân lập VSVSMT từ mẫu làm giàu 3.4 Nghiên cứu đặc tính sinh học chủng VSVSMT phân lập 3.4.1 Khả sinh methane chủng VSVSMT phân lập 3.4.2 Ảnh hưởng độ mặn tới sinh trưởng hai chủng M7 M37 3.4.3 Các đặc điểm sinh học chủng M37 3.5 Tạo nguồn VSVSMT để hỗ trợ trình phân hủy kỵ khí điều kiện nước lợ nước mặn 3.5.1 Lựa chọn nguồn VSVSMT phù hợp 3.5.2 Tạo giống khởi động VSVSMT 3.5.3 Bảo quản nguồn VSVSMT điều kiện phịng thí nghiệm 3.6.Thiết lập vận hành mơ hình kỵ khí xử lý chất thải hữu theo phương pháp phân hủy kỵ khí sinh methane điều kiện nước lợ nước mặn 3.6.1 Thiết lập mơ hình 3.6.2 Vận hành mơ hình 3.6.3 Đánh giá VSVSMT chiếm ưu mơ hình KẾT LUẬN KIẾN NGHỊ DANH MỤC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT AF Bp Anaerobic Filter Base pair BKM Bùn kỵ khí ưa mặn BSA Bovin serum albumin VSVSMT Vi sinh vật sinh methane CTAB Cetyl trimethyl ammonium bromide COD Chemical oxygen demand DGGE Denaturing gradient gel electrophoresis DMSO Dimethyl sulfoxide DNA Deoxyribonucleic acid dNTP EDTA 2’- deoxyribonucleotide 5’- triphosphate Ethylenediamintetraacetic acid EtBr Ethidium bromide IPTG Isopropylthio - β - D – glucosamine LB Môi trường Luria – Bertani mcrA Đoạn gen mã hóa cho tiểu phần α methyl - coenzyme M reductase MPN Most probable number MQ Mili – Q SDS Sodium dodecyl sunfate TAE Tris – acetate – EDTA TE Tris – EDTA TEMED Tetramethylethylenediamine PCI Phenol - Chloroform - Isoamyl alcohol PCR Polymerase Chain Reaction RT-PCR Realtime PCR UASB Upflow Anaerobic Sludge Blanket X-Gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside 55 Kurr M., Huber R., Konig H., Jannasch W., Fricke H., Tricone A., Kristjansson J.K., Stetter K.O (1991), “Methanopyrus kandleri, gen and sp nov represents a novel group of hyperthermophilic methanogens growing at 110oC”, Arch Microbiol 156: 239-247 56 Lazar C.S., Parkes R.J., Cragg B.A., Haridon S.L., Toffin L (2011), “Methanogenic diversity and activity in hypersaline sediments of the centre of the Napoli mud volcano, Eastern Mediterranean Sea”, Environ Microbiol 13: 2078-2091 57 Lefebvre O., Quentin S., Torrijos M, Godon J.J., Delgenes J.P., Moletta R (2007) Impact of increasing NaCl concentrations on the performance and community composition of two anaerobic reactors Appl Microbiol Biotechnol DOI 10.1007/s00253-006-0799-2 58 Lettinga G., Field J., Van Lier J., Zeeman G., Hulshoff L.W (1997), “Advanced anaerobic wastewater treatment in the near future”, Water Sci Technol 35: 5-12 59 Lettinga G (1995), “Anaerobic digestion and wastewater treatment systems”, Antonie van Leeuwenhoek 67: 3-28 60 Liu Y (2010), “Green algae as a substrate for biogas production – cultivation and biogas po-tentials”, MSc Thesis, Master’s programme Science for Sustainable Development, Linköping University, Sweden 61 Luton P.E., Wayne J.M., Sharp R.J., Riley P.W (2002), “The mcrA gene an alternative to 16S rRNA in the phylogentic analysis of methanogen populations in landfill”, Microbiology 148: 3521-3530 62 Lwin K.O., Matsui H (2014), “Comparative analysis of the methanogen diversity in horse and pony by using mcrA gene and archaeal 16S rDNA 118 gene clone libraries”, Hindawi Publishing Corporation Archaea Article ID 483574, 10 pages 63 Mackie R.I., Bryant M.P (1981), “Metabolic activity of fatty acid- oxidizing bacteria and the contribution of acetate, propionate, butyrate, and CO2 to methanogenesis in cattle waste at 40 and 60°C”, Appl Environ Microbiol 41: 1363-1373 64 Madigan M.T., Martinko J.M., Stahl D.A., Clark D.P (2012), Brock Biology of Microorganisms, 13th Ed Pearson Education Inc., USA 65 Marmur J (1961), “A procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from microorganisms”, J Mol Biol 3: 208-218 66 Marta-Alvarez J., Mace S., Llabres S (2000), “Anaerobic digestion of organic solid wastes”, Biores Technol 74: 3-16 67 Matsui T., Amano T., Koike Y., Saiganji A., Saito H (2006), “Methane fermentation of seaweed biomass”, American Institude of chemical engineers annual meeting, San Francisco, CA,Omnipress 68 McInernay M.J., Bryant M.P., Hespell R.B., Costerton J.W (1981), “Syntrophomonas wolfei, gen nov sp nov., an anaerobic syntrophic, fatty acid oxydizing bacterium”, Appl Environ Microbiol 41: 1029-1039 69 Mikucki A.J., Liu Y., Delwiche M., Frederick S.C., David R.B (2003), “Isolation of a methanogen from deep marine sediments that contain methane hydrates and description of Methanoculleus submarinus sp nov”, Appl Environ Microbiol 69: 3311-3316 Migliore G., Alisi C., Sprocati A.R., Massi E., Ciccoli R., Lenzi., Wang A., Cremisini C (2012), “Anaerobic digestion of macroalgal biomass and 70 119 sediments sourced from the Orbetello lagoon, Italy”, Biomass Bioenerg 42: 69-77 71 Mochimaru H., Tamaki H., Hanada S., Imachi H., Nakamura K., Sakata S., Kamagata Y (2009) “Methanolobus profundi sp nov., a methylotrophic methanogen isolated from deep subsurface sediments in a natural gas field”, Int J Syst Evol Microbiol 59: 714-718 72 Mottet A., Habouzit F., Steyer J.P (2014), “Anaerobic digestion of marine microalgae in different salinity levels”, Biores Tech 158:300-306 73 Mori K., Iino T., Suzuki K.I., Yamaguchi K., Kamagata Y (2012), "Aceticlastic and NaCl-requiring methanogen Methanosaeta pelagica sp nov., isolated from marine tidal flat sediment", Appl Environ Microbiol 78: 3416-3423 Muyzer G., De Waal E.C., Utterlinden A.G (1993), “Profiling of complex microbial population by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction amplified genes coding for 16S rRNA”, Appl Environ Microbiol 59: 695-700 74 Nasir I.M., Ghazi T.I.M., Omar R (2012) “Production of biogas from solid organic wastes through anaerobic digestion: a review”, Appl Microbiol Biotechnol 95: 321-329 75 76 Nettmann E., Bergmann I., Pramschufer S., Mundt K., Plogsties V., Herrmann C., Klocke M (2010), “Polyphasic analyses of methanogenic archaeal communities in agricultural biogas plants”, Appl Environ Microbiol 76: 2540-2548 77 Newberry C.J., Webster G., Cragg B.A., Parkes R.J., Waightman A.J., Fry J.C (2004), "Diversity of prokaryotes and methanogenesis in deep subsurface sediments from the Nankai Trough, Ocean Drilling Program Leg 190", Environ Microbiol 6: 274-287 120 78 Ni S., Woese C.R., Aldrich H.C, Boone D.R (1994), “Transfer of Methanolobus siciliae to the genus Methanosarcina, naming it Methanosarcina siciliae, and emendation of the genus Methanosarcina”, Int J Syst Bacteriol 44: 357-359 79 Ni S (1994), “Study of two methylotrophic and halophilic methanogens,ud Methanosarcina siciliae HI350 and Methanolobus taylorii GS-16”, Studen Scholar Archive: 35-49 80 Nkemka V.N., Murto M (2010), “Evaluation of biogas production from seaweed in batch tests and in UASB reactors combined with the removal of heavy metals”, J Environ Manag 91: 1573-1579 81 Ollivier B., Fardeau M.L., Cayol J.L., Magot M., Patel B.K.C., Prensier G., Garcia J.L (1998) “Methanocalculus halotolerans gen nov., sp nov., isolated from an oil-producing well.” Int J Syst Bacteriol 48: 821-828 82 Oremland R.S (1988) Biogeochemistry of methanogenic bacteria, p 641 – 705 In: Biology of anaerobic microorganisms Zehnder AJB Ed John Wiley & Sons, New York 83 Oremland R.S., Cappon D.G (1988), “Use of specific inhibitor in biogeochemistry and microbial ecology”, Adv Microb Ecol 10: 285-383 84 Peck M.W., Archer D.B (1989) “Methods for the quantification of methanogenic bacteria”, Int Ind Biotechnol 9: 5-12 85 Polprasert C (1989), Organic waste recycling, John Wiley & Sons, Chichester, UK 86 Rabus R., Hansen T.A., Widdel F (2006), “Dissimilatory sulphate- and sulphur-reducing prokaryotes”, In Dworkin M, Falkow S, Rosenberg E, 121 Schleifer KH, Stackebrandt E eds, The Prokaryotes, 3rd ed Springer, Berlin Heidelberg New York 2: 659-768 87 Rebac S., Ruskova J., Gerbens S., van Lier J., Stams A.J.M., Lettinga G (1995), “High rate anaerobic treatment of wastewater under psychrophilic conditions”, J Fermen Bioen 80: 499-506 88 Riffat R., Krongthamchat K (2007), “Anaerobic treatment of hight saline wastewter using halophilic methanogens in laboratory scale anaerobic filters”, Water Environ Res 79: 191-198 89 Robertson D.E., Roberts M.F., Belay N., Stetter K.O., Boone D.R (1990), “Occurrence of β-glutamate, a novel osmolyte, in marine methanogen bacteria”, Appl Environ Microbiol 56: 1504-1508 90 Rouvière P.E., Wolfe R.S (1988), “Novel biochemistry of methanogenesis”, J Biol Chem 263: 7913-7916 91 Saitou N., Nei M (1987), “The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees”, Mol Biol Evol 4: 406-425 92 Schramm W., Lehnberg W (1984), “Mass culture of brackish-water- adapted seaweeds in sewage-enrich seawater II: Fermentation for biogas production”, Hydrobiologia 117: 282-287 93 Schulz H.D., Zabel M (2006), Marine Geochemistry, Springer Science & Business Media 94 Shahrul B.I (2013), “Anaerobic wastewater treatment of high salinity wastewaters: impact on bioactivity and biomass retention”, PhD thesis, Wageningen University 122 Shepparda S.K., McCarthyb A.J., Loughnaneb J.P., Grayc N.D., Lloyda D 95 (2005), “The impact of sludge amendment on methanogen community structure in an upland soil” Applied Soil Ecology 28, 147–162 Shlimon A.G., Friedrich M.W., Niemann H., Ramsing N.B., Finster K 96 (2004), "Methanobacterium aarhusense sp nov., a novel methanogen isolated from a marine sediment (Aarhus Bay, Denmark)", Int J System Evol Microbiol 54: 759-763 Singh N., Kendall M.M., Liu Y., Boone D.R (2005), “Isolation and 97 characterization of methylotrophic methanogens from anoxic marine sediments in Skan Bay, Alaska: description of Methanococcoides alskense sp nov., and emended description of Methanosarcina baltica”, Int J System Evol Microbiol 55: 2531-2538 Sowers K.R., Gunsalus R.P (1988), “Adaptation for growth at various 98 saline concentration by the archaebacterium Methanosarcina thermophila”, J 99 Bacteriol 170: 998-1002 Speece R.E., Parkin G.F., Gallagher D (1983), “Nickel stimulation of anaerobic digestion”, Water Res 17: 677-683 100 Stackebrandt E., Pukall R., Ulrichs G., Rheims H (1999), “Analysis of 16S rDNA clone libraries: Part of the big picture”, Methods of Microbial Community Analysis 101 Sterritt R.M., Lester J.N (1988), Microbiology for environmental and public health engineers, E & FN Spon, London 102 Thomas J.L., Arjan P., Huub J.M., Harry R.H., Godfried D.V (2000), “Methanosarcina semesiae sp nov., a dimethylsulfide – utilizing 123 methanogen from mangrove sediment”, Int J System Evol Microbiol, 50: 171-178 103 Xiao Y., Roberts D.J., (2010), “A review of anaerobic treatment of saline wastewater”, Environ Technol 31, 1025-1043 104 Vanegas C H and Bartlett J (2013), "Green energy from marine algae: biogas production and composition from the anaerobic digestion of Irish seaweed species." Environ Technol 34: 2277-2283 105 Watanabe T., Asakawa S., Nakamura A., Nagaoka K., Kimura M (2004), “DGGE method for analyzing 16S rDNA of methanogenic archaeal community in paddy field soil”, FEMS Microbiol Lett 232: 153-163 106 Whitman W.B., Bowen T.L., Boone D.R (2006), “The methanogenic bacteria”, The Prokaryotes, 3rd ed Springer, Berlin Heidelberg New York 3: 165-207 107 Weiland P., Rieger C., Ehrmann T (2003), “Evaluation of the newest biogas plants in Germany with respect to renewable energy production, greenhouse gas reduction and nutrient management”, Symposium “Future of Biogas in Europe, Eisberg October 2003 108 Widdel F., Bak F (1992) “Gram-negative mesophilic sulfate-reducing bacteria”, In Balows A, Trüper HG, Dworkin M, Harder W, Schleifer KH eds The Prokaryotes, 2nd ed Springer, Berlin Heidelberg New York: 33523378 109 Winberg P., Ghosh D., Tapsell L (2009), “Seaweed culture in integrated multi-trophic aquaculture: nutritional benefits and systems for Australia”, RIRDC Publication No 09/005; RIRDC Project No PRJ-000162 124 110 Woese C.R., Magrum L.J., Fox G.E (1987), “Archaebacterium”, J Mol Evol 11: 245-252 111 Woodford Y.D., (2004), “Anaerobic wastewater treatment systems under high salinity stress”, University of Hong kong, PhD dissertation 112 Zhilina T.N., Zavarzin G.A (1997), “Methanosarcina vacuolata sp nov., a vacuolated Methanosarcina ”, Int J Syst Bacteriol 37: 281-283 113 Zhou J., Bruns M.A., Tiedje J.M (1996), “DNA recovery from soils of diverse composition”, Appl Environ Microbiol 62: 316-322 114 Zhu C., Zhang J., Tang Y., Xu Z., Song R (2011), “Diversity of methanogenic archaea in a biogas reactor fed with swine feces as the monosubstrate by mcrA analysis”, Microbiol Res 166: 27-35 Website 115 Biopact:http://news.mongabay.com/bioenergy/2007/08/germany- considers-opening-natural-gas.html 116 China biogas: http://ecotippingpoints.org/our-stories/indepth/china- biogas.html 117 www.fistenet.gov.vn, Lợi ích việc xử lý môi trường hoạt động nuôi trồng, chế biến thủy sản 118 JAMSTEC: http://www.jamstec.go.jp/e/about/press_release/20110609/ 119 http://tietkiemnangluong.com.vn/: Chương trình Mục tiêu Quốc gia sử dụng lượng tiết kiệm hiệu - Bộ Công thương 120 www.vawr.org.vn, Nuôi tôm đồng sông Cửu Long – Những tồn thách thức ảnh hưởng đến phát triển bền vững nghề nuôi 125 PHỤ LỤC Phụ lục 1 Mơi trường khống nước lợ nước biển cho VSVSMT (Widdel, 1992) Thành phần Nước cất NaCl MgCl2.6H2O CaCl2.2H2O KCl KBr MgSO4.7H2O NH4Cl KH2PO4 Khử trùng môi trường 121oC/ 25 phút, lấy 80 oC, sục khí N2 phút, làm nguội, sau bổ sung chất sau khử trùng riêng (ml/lít mơi trường): Hỗn hợp vitamin (bảng 2.2) Hỗn hợp vi lượng (bảng 2.2) NaHCO3 M Na2S 1M Methanol 1M Trimethylamin 1M Na- Acetate M Chỉnh pH 7,2-7,4, sau chia mơi trường sang bình serum ống nghiệm sục khí N2/CO2 (90:10, v/v) 30 giây, đậy bình ống nghiệm nút cao su có kẹp nhơm hay nút vặn có lỗ hở, sử dụng bảo quản tối Thành phần hỗn hợp vi lượng vitamin (Widdel, 1992) Hỗn hợp vi lượng Thành phần HCl 25% (7,7 M) FeSO4.7H2O H3BO3 MnCl2.4H2O CoCl2.6H2O NiCl2.6H2O CuCl2.2H2O ZnSO4.7H2O Na2MoO4.2H2O Thêm nước cất đến 1000 ml Môi trường LB (%, wt/v) Tripton Cao nấm men NaCl Agar Bổ sung thành phần 100 ml môi trường: gồm IPTG - gam, ampicillin – mg, X-Gal – mg ® Phụ lục Vector pGEM -T Easy (Promega, Mỹ) Thành phần vị trí Vector pGEM®-T Easy Thành phần Lac Z Ampr f1 ori T7 promoter SP6 promoter Phụ lục Sản phẩm nhân đoạn gen mcrA từ DNA tổng số mẫu làm giàu NTLRE3 rong biển Ulva sp (A) tuyển chọn dòng tế bào mang gen mcrA sau biến nạp vào E coli DH5α (B) M mcrA 500 bp 500 bp A B Phụ lục Trình tự gen 16S rDNA chủng VSVSMT đại diện Methanosarcina sp M21 (97% tương đồng với M semesiae) mã trình tự GenBank KC571195 CTTTATGCGTCAAAGGTCCTCCGCCTGAGGATGGGTCTGCGGCCTATCAGGTA GTAGCGGGTGTAATGTACCTGCTAGCCGACGACGGGTACGGGTTGTGAGAGCA AGAGCCCGGAGATGGATTCTGAGACATGAATCCAGGCCCTACGGGGCGCAGC AGCGCGAAAACTTTACAATGCGGGCAACCGTGATAAGGGGACACCGAGTGCT AGCAAGATTTGCTGGCTGTCCAGGTGCGTACAATGCACCTGTTAGCAAGGGCC GGGCAAGACCGGTGCCAGCCGCCGCGGTAACACCGGCGGCCCGAGTGGTGAT CGTTATTATTGGGTCTAAAGGGTCCGTAGCCGGTTTGGTCAGTCCTCCGGGAAA TCTGTCAGCTTAACTGATAGGCTATCGGGGGATACTGCCAGACTTGGAACCGG GAGAGGTAAGAGGTACTACAGGGGTAGGAGTGAAATCTTGTAATCCCTGTGGG ACCACCTGTGGCGAAGGCGTCTTACCAGAACGGGTTCGACGGTGAGGGACGA AAGCTGGGGGCACGAACCGGATTAGATACCCGGGTAGTCCCAGCCG Methanolobus sp M23b (96% tương đồng với M profundii), mã trình tự GenBank KC571193 AGGAAAGTTCTGTGGCTCAAAGCTCCGGCGCCTTAGGATGAATCTGCGGCCTA TCAGGTTGTAGTGGGTGTAGTGTACCTACTAGCCTACGACGGATACGGGTTGT GAGAGCAAGAGCCCGGAGATGGATTCTGAGACATGAATCCAGGCCCTACGGG GCGCAGCAGGCGCGAAAACTTTACAATGCGGGAAACCGCGATAAGGGGATAC TGAGTGCCAGCATATTATGTTGGCTGTCCACCTGTATAAACAGCAGGTGTTAGC AAGGGCCGGGCAAGACCGGTGCCAGCCGCCGCGGTAACACCGGCGGCCCGAG TGGTGGCCACTATTATTGGGTCTAAAGGGTCCGTAGCCGGTTTGATCAGTCTTC CGGGAAATCTGACAGCTCAACTGTTAGGCTTCCGGGGGATACTGTCAGACTTG GGACCGGGAGAGGTAAGAGGTACTACAGGGGTAGGAGTGAAATCTTGTAATC CTTGTGGGACCACCAGTGGCGAAGGCGTCTTACCAGAACGGGTCCGACGGTGA GGGACGAAAGCTGGGGGCACGAACCGGATTAGATACCCGGGTAGTCCCAGCC GTAAACGATGCTCGCTAGGTGTCTGGGACGGTGCGACCTTTTCAGGTG Methanosarcina sp M25a (96% tương đồng với M vacuolata), mã trình tự GenBank KC571194 CATATGCTGGAATGCTTTATGCGTCAAATGGATTCGTCTGCCCAAGGATGGGTC TGCGGCCTATCAGGTAGTAGTGGGTGTAATGTACCTACTAGCCGACAACGGGT ACGGGTTGTGAGAGCAAGAGCCCGGAGATGGATTCTGAGACATGAATCCAGG CCCTACGGGGCGCAGCAGGCGCGAAAACTTTACAATGCGGGAAACCGTGATA AGGGGACACCGAGTGCCAGCATCATATGCTGGCTGTCCAGGTGTGTAAAATAC ACCTGTTAGCAAGGGCCGGGCAAGACCGGTGCCAGCCGCCGCGGTAACACCG GCGGCCCGAGTGGTGATCGTGATTATTGGGTCTAAAGGGTCCGTAGCCGGTTT GGTCAGTCCTCCGGGAAATCTGACAGCTCAACTGTTAGGCTTTCGGGGGATAC TGCCAGACTTGGAACCGGGAGAGGTAAGAGGTACTACAGGGGTAGGAGTGAA ATCTTGTAATGCCCTGTGGGACCACCTGTGGCGAAGGCGTCTTACCAGAACGG GTTCGACGGTGAGGGACGAAAGCTGGGGGCTACGAACCGGATTAGATACCCG GGTAGTCCCAGCCGTAAACGATGCTCGCTAGGTGTCAGGCATGGCGCGACCGT GTCTGGTGCGACAGGGAAGCC Methanosarcina sp M37 (98% tương đồng với M.siciliae), mã trình tự GenBank KC951109 AAGTTTCAGCCTTGCGGCCGTACTTCCCAGGTGGCTCGCTTCACGGCTTCCCTG CGGCACCAGACACGGTCGCGCCATGCCTGACACCTAGCGAGCATCGTTTACGG CTGGGACTACCCGGGTATCTAATCCGGTTCGTGCCCCCAGCTTTCGTCCCTCAC CGTCGAACCCGTTCTGGTAAGACGCCTTCGCCACAGGTGGTCCCACAGGGATT ACAAGATTTCACTCCTACCCCTGTAGTACCTCTTACCTCTCCCGGTTCCAAGTC TGGCAGTATCCCCCGAAAGCCTAACAGTTAAGCTGTCAGATTTCCCGGAGGAC TGACCAAACCGGCTACGGACCCTTTAGACCCAATAATCACGATCACCACTCGG GCCGCCGGTGTTACCGCGGCGGCTGGCACCGGTCTTGCCCGGCCCTTGCTAAC AGGTGTATTTTACACACCTGGACAGCCAACAAATGTTGCTGGCACTCGGTGTC CCCTTATCACGGTTTCCCGCATTGTAAAGTTTTCGCGCCTGCTGCGCCCCGTAG GGCCTGGATTCATGTCTCAGAATCCATCTCCGGGCTCTTGCTCTCACAACCCGT ACCCGTTGTCGGCTAGTAGGTACATTACACCCACTACTACCTGATAGGCCGCA GACCCATCCTTGGGCAGACGAATCCGTTTGACGCATAAAGCATTCCAGCATAT GTGCGTTATCCCGGTATTATCCCCAGTTTCCCGGGGTTATCCCGAACCCAAGGG CAGGTTCGAGACCCGTGCCCACTGTTACCAGCATGTCCTCCGGGACGATGGGT ACTCTGTGGGGACCGCCGGTGTTAAATCGGAGGAAGGTGCGGGCCACGGTAG GTCAGTATGCCCCGAATTTCCCGGGCTACACGCGGGCTACAATGAATGGGACA ATGGGTCCCTTCCCCGAAAGGGGTTGGTAATCTCACAAACCCATCCGTAGTTC GGATCGAGGGCTGTAACTCGCCCTCGTGAAGCTGGAATCCGTAGTAATCGCGT TTCAATATAGCGCGGTGAATACGTCCCTGCTCCTTGCACACACCGCCCGTCAAA CCACCCGAGTGAGGTATGGGTGAGGGCACGGACTCAGTGCCGTGTTCGAACCT GAATTTTGCAAGGGGGGTTAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTACGGGAATCTGCG GCTGGATCACTCAA Clone 09 GCTGGATGACTTCTCCTACTACGCCTGCGACTACGCTCTGGACAAGTTCGGCGA GTGGGCAACTGCACCCGCCACCTTGGAGACTGCCAAGGACATCGCCACCGAGA CCACCCTGTACGCCATGGAACAGTACGAAGCCTTCCCAACCCTACTGGAAGAC CACTTCGGTGGATCTCAGAGGTCGGCAGTCATGGCCGCCGCCAGTGCCATCGG CACTGCCTGTTTGACTGGAAACAGCTCTACAGGATTGTCCGCCTGGTATCTCAG CCACCTGATTCACAAGGACAGCTGGGGCAGAATGGGCTTCTTCGGATACGACC TGCAGGACCAGTGTGGTCCCACCAACGTGTTCAGCTACCAGGGTGACGAGGGC AACCCATTGGAGCTGAGAGGCGCCAACTACCCAAACTACGCAATGAAAA Clone 20 CCTGGTAGCTGAACACGTTGGTGGGACCACACTGGTCCTGCAGGTCGTATCCG AAGAAGCCCATTCTTCCCCAGCCTTCCTTGTGAATCAGGTGGCTGAGATACCA AGCGGACAGTGCAGCCTGGCTGTTTCCGGTCAGGCAACCAGTGGAAACACCG C TGGCGGCAGCCATGATACCGGACCTCTGGGATCCACCGGAGTGGTCTTCCAGC AGGGTTGGGAATGCTTCGTACTGCTCCATGGAGTACAAGGTGGTCTCGGTGGC CAGATCTTTGGCGGTCTCCAAGGTTGCGGGAGCCTCTCCCCAGCCACCATACTT GTCCACACCGTAATCTGAGCCATAGTAGGAGAAGTCATCCAACACGTCGTTGG TGTAAGCAGCTGTTGCGTACTGTGTGAATCCGACACCACCAATCACTAGTGAA TTCGCGGCCGCCTGCAGGTCGACCATATGGGAGAGCTCCCAACGCGTTGGATG CATAGCTTGAGTATTCTATAGT Clone 25 GAGGCAGTACCTGACACATCATCGACGAGTACACCTACTATGGTATGGACTAC CTGAAGGACAAGTATGGCTTCGACTACTCCAACCCGGACCCCGCAGCATCTGT TGCTCCGACTCAGGAGATCGTGAACGATCTTGCAACTGAGGTCAACCTCAATG CAATGGAGCAGTACGAGCAGTACCCGACACTGATGGAGGACCACTTTGGTGGT TCCCAGCGTGCCGGTGTTATGGCGGCAGCCTGTGGTCTGACCTGTTCGATCGGT ACCGGAAACTCCAACGCCGGTCTGAACGGATGGTACCTTTCCATGCTTATGCA CAAGGAAGGCTGGTCACGTCTTGGTTTCTTCGGATACGATCTTCAGGACCAGT GTGGTTCAGCAAACTCTCTCTCCATGGAGCCTGACCGCGGTCTGATGGGCGAA CTTCGTGGACCGAACTACCCTAACTACGCAATGAAAA Clone 28 AAGGCAATTACCTGATACATTCTTGATGATTCACATACTACGGTATGGACTACA TCAAAGACAAATACGGCGTAGACTACACCAACCCTGACCCCGCAAAGCTTGTC AAGCCATCACAGGAAGTTGTAAACGATATCGCATCCGAGGTAAACCTCAATGC AATGGAGCAGTATGAACAGTTCCCAACCATGATGGAGGATCACTTCGGTGGTT CACAGCGTGCCGGTGTCATGGCAGCTGCATGTGGTCTGTCCACATCCATCGCA ACCGGAAACTCAAACGCAGGTCTGAACGGATGGTACCTTTCAATGCTTATGCA CAAGGAAGGCTGGTCACGTCTCGGATTCTTCGGATACGATCTTCAGGACCAGT GTGGTTCAGCAAACTCACTTTCAATGGAACCGGACCGTGGTCTCATTGGAGAA CTGCGTGGACCAAACTACCCAAACTACGCAATGAAA Clone 40 TGATTAACTACCTGACACTCCTTGAGGACTTTGTCTACTACGGTATAGACTACA TCAAGGACAAGTACGGCGACTTCAACTCAGTCAAGCCATCAGTCGATGAAATA CAGAAGATCTCAACAGACATAGGCATCTACTGTCTTGAGACCTACGAAAACTA CCCGACCGTTATGGAGTCACACTTTGGTGGCAGCCAGCGCGCAGCATGTATCT CTGCAGCATCAGGTTGTACGACCGCAATGGCCACAGGTTCAGCACAGGCCGGC GCAAACGCATGGTACCACTCCATGATCCTCCACAAGGAAGAGATGGGTAGGCT CGGCTTCTACGGTTACGACTTGCAGGACATGTGTGGTTCATCCAACTCATTCTC ATTCAGGTCAGACGAGGGTCTGCCATTCGAGATGAGGGGTCCAAACTACCCAA ACTACGCAATGAAAA ... NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN THU HOÀI NGHIÊN CỨU VI SINH VẬT SINH METHANE ỨNG DỤNG CHO SẢN XUẤT BIOGAS TRONG ĐIỀU KIỆN MÔI TRƯỜNG NƯỚC LỢ VÀ NƯỚC MẶN Chuyên ngành: VI SINH VẬT... với mơi trường nước lợ nước mặn, chủ động hỗ trợ q trình vận hành cơng nghệ Đề tài: ? ?Nghiên cứu vi sinh vật sinh methane ứng dụng cho sản xuất biogas điều kiện môi trường nước lợ nước mặn? ?? nhằm... đích nghiên cứu tập hợp vi sinh vật sinh methane có hoạt tính sinh học cao, thích nghi tốt với điều kiện môi trường nước lợ nước mặn để chủ động hỗ trợ cho công nghệ xử lý kỵ khí, áp dụng cho