Nghiên cứu, tuyển chọn vi khuẩn đối kháng chống ralstonia solanacearum gây bệnh héo xanh cây trồng

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - LÊ THỊ THANH THỦY NGHIÊN CỨU, TUYỂN CHỌN VI KHUẨN ĐỐI KHÁNG CHỐNG Ralstonia solanacearum GÂY BỆNH HÉO XANH CÂY TRỒNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội - 2015 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN LÊ THỊ THANH THỦY NGHIÊN CỨU, TUYỂN CHỌN VI KHUẨN ĐỐI KHÁNG CHỐNG Ralstonia solanacearum GÂY BỆNH HÉO XANH CÂY TRỒNG Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 62420107 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS Lê Như Kiểu PGS TS Lại Thúy Hiền Hà Nội - 2015 ii LỜI CÁM ƠN Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới: Tiến sĩ Lê Như Kiểu PGS TS Lại Thúy Hiền người thày tận tình giúp đỡ, hướng dẫn tơi suốt q trình thực đề tài Luận án Tôi xin trân trọng cảm ơn: - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội tổ chức khoá đào tạo tiến sỹ này, giúp tơi có điều kiện học tập nghiên cứu để nâng cao trình độ chuyên mơn - Phịng Đào tạo sau Đại học, Khoa Sinh học, Bộ môn Vi sinh vật, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên tạo điều kiện giúp đỡ tơi hồn thành Luận án - Ban lãnh đạo Viện Thổ nhưỡng Nơng hóa, tập thể cán Bộ mơn Vi sinh vật phịng liên quan - Viện Cơng nghệ Sinh học, Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương Cuối cùng, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới người thân gia đình, bạn bè tạo điều kiện, động viên giúp đỡ suốt thời gian thực Luận án Hà Nội, ngày 20 tháng 07 năm 2015 Tác giả Lê Thị Thanh Thủy iii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: - Đây cơng trình nghiên cứu tơi số kết cộng tác với cộng khác - Các số liệu trình bày luận án trung thực, phần công bố tập san tạp chí khoa học chuyên ngành với đồng ý cho phép đồng tác giả - Phần cịn lại chưa cơng bố cơng trình khác Tác giả luận án Lê Thị Thanh Thủy iv TT MỞ ĐẦU Tính cấp thiết luận Mục tiêu luận án Nội dung nghiên cứu c Ý nghĩa khoa học th Đối tượng, phạm vi, đị Những đóng góp c CHƯƠNG I TỔNG Q 1.1 Tình hình trồng ớt, lạc 1.1.1 Tình hình trồng ớt lạ 1.1.2 Tình hình trồng ớt lạ 1.2 Vi khuẩn Ralstonia sol 1.2.1 Đặc điểm phân loại vi k 1.2.2 Đặc điểm sinh lý, sinh h 1.2.3 Các hình thức xâm nhập 1.2.4 Một số yếu tố ảnh hưởn solanacearum 1.3 Tình hình nghiên cứu Nam giới 1.3.1 Bệnh héo xanh vi kh 1.3.2 Tình hình nghiên cứu bệ 1.3.3 Tình hình nghiên cứu bệ 1.4 Vi sinh vật đối kháng v 1.4.1 Vi sinh vật đối kháng 1.4.1.1 Vai trò vi khuẩn đối 1.4.1.2 Các yếu tố ảnh hưởng đ vật 1.4.2 Cơ chế đối kháng v 1.4.2.1 Cơ chế kháng sinh 1.4.2.2 Cơ chế siderophor 1.4.2.3 Cơ chế tăng cường sứ 1.5 Tình hình nghiên 1.5.1 Nghiên cứu vi sinh vậ 1.5.2 Nghiên cứu vi sinh vậ CHƯƠNG II VẬT L NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu 2.2 Phương pháp nghiên 2.2.1 Khảo sát tình hình b Bắc miền Trung V 2.2.1.1 Đánh giá tình hình bệ miền Trung Việt Nam 2.2.1.2 Phân lập vi khuẩn R ớt lạc 2.2.2 Nghiên cứu vi khuẩn 2.2.2.1 Phân lập tuyển chọ 2.2.2.2 Đánh giá hoạt tính si kháng 2.2.2.3 Phân loại vi khuẩn đố 2.2.2.4 Đánh giá an toàn sinh 2.2.2.5 Đánh giá khả ki (trong nhà lưới) c 2.2.2.6 Tách xác định Itur 2.2.2.7 Tách xác định Phe 2.2.3 Nghiên cứu sản xuất 2.2.3.1 Nghiên cứu tương fluorescens ĐKP1 trê 2.2.3.2 Xác định điều kiệ B subtilis ĐKB1 P 2.2.3.3 Nghiên cứu tạo chất m 2.2.3.4 Nghiên cứu quy trình 2.2.4 Đánh giá hiệu c lạc đồng ruộng 60 2.2.4.1 Đánh giá hiệu chế phẩm vi sinh HX ớt lạc điều kiện thí nghiệm ngồi đồng ruộng 2.2.4.2 61 Đánh giá hiệu chế phẩm vi sinh HX ớt lạc mơ hình đồng ruộng 2.2.5 3.1 Phương pháp xử lý số liệu 62 CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 63 Khảo sát tình hình bệnh héo xanh ớt lạc R 63 solanacearum miền Bắc miền Trung Việt Nam 3.1.1 Bệnh héo xanh ớt 3.1.2 Bệnh héo xanh lạ 3.1.3 Phân lập vi khuẩn R lạc 3.1.3.1 Phân lập vi khuẩn R 3.1.3.2 Phân lập vi khuẩn R 3.1.3.3 Đánh giá khác nha lạc) YH3 (gây bện 3.1.3.4 Hình thái kích thướ 3.2 Nghiên cứu vi khuẩn 3.2.1 Phân lập, tuyển chọn 3.2.1.1 Phân lập, lựa chọn cá bệnh héo xanh ớt 3.2.1.2 Phân lập, lựa chọn cá bệnh héo xanh lạ 3.2.1.3 Khả kiểm soát b lưới hai chủng vi 3.2.2 Hoạt tính sinh học c 3.2.3 Phân loại vi khuẩn đ 3.2.3.1 Sử dụng kit API 50 CH 3.2.3.2 Sử dụng phương pháp 3.2.4 Đánh giá an tồn sin 3.2.4.1 Xác định độc tính toàn sinh học vi si 3.2.4.2 Xác định độc tính 3.2.5 Xác định loại kháng chọn sinh 3.2.5.1 Xác định phenazine bằ (TLC) sắc ký lỏng c 3.2.5.2 Xác định Iturin A (UPLC/MS/MS) 3.3 Nghiên cứu sản xuất 3.3.1 Phối hợp chủng v 3.3.1.1 Đánh giá khả tồn chủng B.subtilis ĐKB 3.3.1.2 Đánh giá khả ức chủng B.subtilis ĐKB 3.3.2 Xác định điều kiệ chủng B subtilis Đ 3.3.2.1 Nghiên cứu lựa chọn m 3.3.2.2 Xác định pH ban đầu 3.3.2.3 Xác định nhiệt độ phù 3.3.2.4 Xác định lượng không 3.3.2.5 Xác định tốc độ khuấy 3.3.2.6 Xác định tỷ lệ giống c 3.3.2.7 Xác định thời gian nhâ 3.3.2.8 Hoạt tính đối kháng củ 3.3.3 Nghiên cứu tạo chất 3.3.4 Sản xuất chế phẩm v XỬ LÝ SỐ LIỆU Bảng 3.26: Ảnh hưởng tỷ lệ giống cấp đến chất lượng sinh khối VK Mật độ tế bào chủng B.subtilis ĐKB1 sau 36h nhân sinh khối % cấp 0,5 Mật độ tế bào chủng P fluorescens ĐKP1 sau 30h nhân sinh khối % cấp 0,5 XỬ LÝ SỐ LIỆU Bảng 3.27: Ảnh hưởng nguồn dinh dưỡng đến sinh trưởng chủng vsv Mật độ tế bào chủng B.subtilis ĐKB1 DD King B SPA SX1 SX2 SX3 SX4 Mật độ tế bào chủng P fluorescens ĐKP1 DD King B SPA SX1 SX2 SX3 SX4 XỬ LÝ SỐ LIỆU Bảng 3.28: Hoạt lực đối kháng R solanacearum chủng vi khuẩn trước sau nhân sinh khối Ký hiệu chủng B subtilis ĐKB1 P fluorescens ĐKP1 XỬ LÝ SỐ LIỆU Bảng 3.31: Mật độ tế bào chủng vi khuẩn chất mang dạng bột sau 30 ngày nhiễm Đơn chủng B subtilis ĐKB1 x 10 x 10 x 10 x 10 x 10 x 10 P fluorescens x 106 ĐKP1 x 10 B subtilis x 10 x 10 ĐKB1 x 10 x 10 x 10 P fluorescens x 10 x 106 ĐKP1 x 10 XỬ LÝ SỐ LIỆU Bảng 3.32: Hoạt lực đối kháng R solanacearum chủng VK chất mang dạng bột sau 30 ngày nhiễm Đơn chủng Đường kính vịng phân giải (D-d,mm) B subtilis ĐKB1 P fluorescens ĐKP1 Đường kính vịng phân giải (D-d,mm) B subtilis ĐKB1 P fluorescens ĐKP1 XỬ LÝ SỐ LIỆU BẢNG 3.33 Khả tồn chủng VK chất mang than bùn Đơn chủng Mật độ tế bào chủng B.subtilis ĐKB1 Thời gian (tháng) Mật độ tế bào chủng P fluorescens ĐKP1 Thời gian (tháng) Mật độ tế bào chủng B.subtilis ĐKB1 Thời gian (tháng) Mật độ tế bào chủng P fluorescens ĐKP1 Thời gian (tháng) Bảng 3.34: Khả tồn B subtilis ĐKB1 P fluorescens ĐKP1 chế phẩm sau thời gian bảo quản Mật độ tế bào chủng B.subtilis ĐKB1 Thời gian (tháng) Mật độ tế bào chủng P fluorescens ĐKP1 Thời gian (tháng) SỐ LIỆU THÔ THÍ NGHIỆM ĐỒNG RUỘNG TRÊN CÂY LẠC ỨNG HỒ – HÀ NỘI, Vụ Hè Thu, 2013 Điểm Điểm Điểm Điểm Điểm Cao lạc (THÍ NGHIỆM) Điểm Điểm Điểm Điểm Điểm Năng suất lý thuyết lạc (ĐỐI CHỨNG) Điểm Điểm Điểm Điểm Điểm Năng suất lý thuyết (THÍ NGHIỆM) Điểm Điểm Điểm Điểm Điểm Năng suất LT lạc ĐC 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 SỐ LIỆU THƠ THÍ NGHIỆM ĐỒNG RUỘNG TRÊN CÂY ỚT MÊ LINH – HÀ NỘI, Vụ Hè Thu, 2013 THÍ NGHIỆM ĐỒNG RUỘNG - TRÊN CÂY Ớt Cao lô ( ĐC) Điểm 5 Năng suất tươi ( tấn/ha) ( ĐC ) Năng suất tươi ( tấn/ha ) ( TN ) THÍ NGHIỆM ĐỒNG RUỘNG - TRÊN CÂY Ớt Hiệu phòng tr bệnh héo xanh vi khuẩn hại ớt chế phẩm HXL Giai đoạn Lô 1: Đ/C Điểm Điểm Điểm Điểm Điểm Giai đoạn nụ, hoa, Lô 1: Đ/C Điểm Điểm Điểm Điểm Điểm THÍ NGHIỆM ĐỒNG RUỘNG - TRÊN CÂY LẠC Hiệu phòng trừ bệnh héo xanh vi khuẩn lạc ( Ứng Hoà ) CT1 Điểm Điểm Điểm Điểm Điểm Giai đoạn nụ, hoa, Điểm Điểm Điểm Điểm Điểm Giai đoạn trước thu hoạch Điểm Điểm Điểm Điểm Điểm SỐ LIỆU THÔ MƠ HÌNH ĐỒNG RUỘNG TRÊN CÂY LẠC TĨNH GIA – THANH HỐ, Vụ Đơng Xn, 2014 Tỉ lệ héo xanh lạc Thanh Hoá ( ĐC ) G Điểm Điểm Điểm Điểm Điểm Điểm Điểm Điểm Điểm Điểm 10 Tỉ lệ héo xanh lạc Thanh Hoá ( TN ) G Điểm Điểm Điểm Điểm Điểm Điểm Điểm Điểm Điểm Điểm 10 C Điểm Điểm Điểm Điểm Điểm Điểm Điểm Điểm Điểm Điểm 10 C Điểm Điểm Điểm Điểm Điểm Điểm Điểm Điểm Điểm Điểm 10 MƠ HÌNH ĐỒNG RUỘNG - TRÊN CÂY LẠC Năng suấ t lạc ĐC Quả Cây Cây Cây Cây Cây Cây Cây Cây Cây Cây 10 Cây 11 Cây 12 Cây 13 Cây 14 Cây 15 Cây 16 Cây 17 Cây 18 Cây 19 Cây 20 Cây 21 Cây 22 Cây 23 Cây 24 Cây 25 Cây 26 Cây 27 Cây 28 Cây 29 Cây 30 Cây 31 Cây 32 Cây 33 Cây 34 Cây 35 Cây 36 Cây 37 Cây 38 Cây 39 Cây 40 Cây 41 Cây 42 Cây 43 Cây 44 Cây 45 Cây 46 Cây 47 Cây 48 Cây 49 Cây 50 SỐ LIỆU THƠ MƠ HÌNH ĐỒNG RUỘNG TRÊN CÂY ỚT MÊ LINH – HÀ NỘI, Vụ Đơng Xn, 2014 MƠ HÌNH ĐỒNG RUỘNG - TRÊN CÂY ỚT Hiệu phòng bệnh héo xanh vi khuẩn hại ớt chế phẩm HXL ( Mê Linh ) Giai đoạn Điểm Điểm Điểm Điểm Điểm Điểm Điểm Điểm Điểm Điểm 10 Giai đoạn nụ hoa, quả, CT Điểm Điểm Điểm Điểm Điểm Điểm Điểm Điểm Điểm Điểm 10 Giai đoạn trước thu hoạch CT Điểm Điểm Điểm Điểm Điểm Điểm Điểm Điểm Điểm Điểm 10 MƠ HÌNH ĐỒNG RUỘNG - TRÊN CÂY ỚT Hiệu chế phẩm vi sinh HXL tới ớt ( Mê Linh ) Cao ớt - ĐC Điểm Điểm Điểm Điểm Điểm Điểm Điểm Điểm Điểm Điểm 10 Cao ớt TN Điểm Điểm Điểm Điểm Điểm Điểm Điểm Điểm Điểm Điểm 10 Năng suất tươi Cây Điểm Điểm Điểm Điểm Điểm Điểm Điểm Điểm Điểm Điểm 10 Năng suất tươi Cây Điểm Điểm Điểm Điểm Điểm Điểm Điểm Điểm Điểm Điểm 10 ... phát từ lý trên, lựa chọn đề tài luận án: ? ?Nghiên cứu, tuyển chọn vi khuẩn đối kháng chống Ralstonia solanacearum gây bệnh héo xanh trồng? ?? Trong số trồng quan trọng nơng nghiệp Vi? ??t Nam lạc ớt có... TỰ NHIÊN LÊ THỊ THANH THỦY NGHIÊN CỨU, TUYỂN CHỌN VI KHUẨN ĐỐI KHÁNG CHỐNG Ralstonia solanacearum GÂY BỆNH HÉO XANH CÂY TRỒNG Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 62420107 LUẬN ÁN... luận án Tuyển chọn chủng vi khuẩn đối kháng có khả kháng cao với vi khuẩn R solanacearum để sản xuất chế phẩm vi sinh ứng dụng phòng trừ bệnh héo xanh ớt lạc Xác định chế kháng vi khuẩn R solanacearum