Sử Dụng Chế Phẩm Nấm Mốc Trichoderma Sp. Thủy Phân Phế Phẩm Khóm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC SỬ DỤNG CHẾ PHẨM NẤM MỐC Trichoderma sp THỦY PHÂN PHẾ PHẨM KHÓM CÁN BỘ HƯỚNG DẪN ThS VÕ VĂN SONG TOÀN ThS DƯƠNG THỊ HƯƠNG GIANG SINH VIÊN THỰC HIỆN NGUYỄN DUY TIẾN MSSV: 3064421 LỚP: CNSH K32 Cần Thơ, Tháng 6/2010 PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN ThS Võ Văn Song Toàn Nguyễn Duy Tiến CÁN BỘ HƯỚNG DẪN ThS Dương Thị Hương Giang DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… Cần Thơ, ngày tháng năm 2010 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG LỜI CẢM TẠ Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp Đại học này, ngồi cố gắng thân, tơi cịn nhận hướng dẫn, ủng hộ, giúp đỡ nhiều người Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu trường Đại Học Cần Thơ, Ban Giám Đốc Viện Nghiên cứu Phát triển Công Nghệ Sinh Học - trường Đại Học Cần Thơ tạo điều kiện thuận lợi cho học tập, nghiên cứu thực đề tài Xin chân thành cảm ơn tất quý thầy cô trường Đại Học Cần Thơ nhiệt tình giảng dạy truyền đạt kiến thức chun mơn cho tơi suốt q trình học tập trường Tôi xin chân thành cảm ơn thầy Võ Văn Song Tồn Dương Thị Hương Giang tận tình hướng dẫn, bổ sung kiến thức tạo điều kiện cho thời gian thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn cô Trần Thị Xuân Mai, cố vấn học tập lớp Công Nghệ Sinh Học khóa 32, ln quan tâm, động viên tạo điều kiện tốt cho tơi suốt q trình học thực đề tài Xin gửi lời cảm ơn đến thầy Lê Thanh Hùng, chị Nguyễn Thị Xuân Dung anh chị cán phịng cơng nghệ enzyme, phịng cơng nghệ thực phẩm - Viện Nghiên Cứu Phát Triển Công Nghệ Sinh Học, trường Đại Học Cần Thơ giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho thực tốt đề tài Xin cảm ơn ba mẹ động viên, khuyến khích, hỗ trợ cho học tập hoàn thành tốt đề tài Cảm ơn tất bạn lớp CNSH K32, CNSH K32TT, CNSH K33, cổ vũ giúp đỡ tơi suốt thời gian qua Tơi xin kính chúc quý thầy cô bạn sinh viên dồi sức khoẻ công tác tốt Cần Thơ, ngày tháng Nguyễn Duy Tiến năm 2010 Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 32 – 2010 Trường ĐHCT TĨM LƯỢC Đề tài “Sử dụng chế phẩm nấm mốc Trichoderma sp thủy phân phụ phẩm khóm” tiến hành nhằm mục đích góp phần làm giảm thiểu nhiễm mơi trường từ loại phụ phẩm khóm q trình sản xuất thải tận dụng nguồn phế phẩm dồi kết hợp với nấm mốc Trichoderma sp để sản xuất thức ăn ứng dụng chăn nuôi Kết thí nghiệm cho thấy điều kiện tối ưu để nấm mốc Trichoderma sp thủy phân phụ phẩm khóm nồng độ nấm 0,2%; thời gian ngày; nhiệt độ 50 oC Sản xuất thử nghiệm quy mô nhỏ với kg bã khóm điều kiện tối ưu, thí nghiệm đạt hiệu suất thủy phân vật chất khô 28,57%; hiệu suất thủy phân cellulose đạt 38,84%; lượng đường khử tạo thành tăng gấp 6,6 lần so với bã khóm ban đầu Từ khóa: Trichoderma sp., cellulase, phụ phẩm khóm, thủy phân Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học i Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 32 – 2010 Trường ĐHCT MỤC LỤC Trang PHẦN KÝ DUYỆT LỜI CẢM TẠ TÓM LƯỢC i MỤC LỤC ii DANH SÁCH BẢNG v DANH SÁCH HÌNH vi CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Phụ phẩm khóm 2.2 Cellulose enzyme cellulase 2.2.1.Cellulose 2.2.2 Enzyme cellulase Phân loại Tính chất Cơ chế tác động cellulase lên cellulose 2.3 Vi sinh vật tổng hợp cellulase nấm mốc Trichoderma sp 2.3.1 Vi sinh vật tổng hợp cellulase 2.3.2 Nấm mốc Trichoderma sp 2.4 Lược khảo số phương pháp sử dụng thí nghiệm 10 2.4.1 Phương pháp định lượng hàm lượng cellulose 10 2.4.2 Phương pháp xác định hàm lượng tro sản phẩm 10 2.4.3 Định lượng đường khử phương pháp Nelson Somogyi 10 2.5 Tình hình nghiên cứu nước nước 10 2.5.1 Trong nước 10 2.5.2 Ngoài nước 11 CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 3.1 Phương tiện nghiên cứu 12 3.1.1 Địa điểm - thời gian 12 3.1.2 Vật liệu 12 3.1.3 Thiết bị - dụng cụ 12 Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học ii Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 32 – 2010 Trường ĐHCT 3.1.4 Hoá chất 13 3.2 Phương pháp thí nghiệm 13 3.2.1 Mục đích thí nghiệm 13 3.2.2 Chuẩn bị vật liệu 14 3.2.3 Thí nghiệm 1: Khảo sát thành phần bã khóm 15 3.2.4 Thí nghiệm 2: Khảo sát lượng chế phẩm nấm mốc Trichoderma sp cần bổ sung để thủy phân bã khóm 15 3.2.5 Thí nghiệm 3: Khảo sát thời gian thích hợp để chế phẩm nấm mốc Trichoderma sp thủy phân bã khóm 16 3.2.6 Thí nghiệm 4: Khảo sát nhiệt độ thích hợp cho q trình thủy phân 17 3.2.7 Thí nghiệm 5: Tiến hành sản xuất thử nghiệm 17 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 19 4.1 Kết phân tích thành phần nguyên liệu 19 4.2 Khảo sát lượng chế phẩm nấm mốc Trichoderma sp cần bổ sung để thủy phân bã khóm 20 4.3 Khảo sát thời gian thích hợp để chế phẩm nấm mốc Trichoderma sp thủy phân bã khóm 21 4.4 Khảo sát nhiệt độ thích hợp cho trình thủy phân 24 4.5 Sản xuất thử nghiệm 27 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 30 5.1 Kết luận 30 5.2 Kiến nghị 30 TÀI LIỆU THAM KHẢO 31 PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1: Các phương pháp phân tích Phương pháp xác định độ ẩm phương pháp sấy khô Phương pháp xác định vật chất khô phương pháp sấy khô Phương pháp xác định hiệu suất thủy phân vật chất khô Phương pháp xác định hàm lượng cellulose Phương pháp xác định hiệu suất thủy phân cellulose Phương pháp xác định hạm lượng tro Phương pháp Nelson Somogyi (1942) PHỤ LỤC 2: Số liệu thí nghiệm Bảng 9: Đường chuẩn glucose Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học iii Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 32 – 2010 Trường ĐHCT Bảng 10: Khảo sát thành phần nguyên liệu bã khóm Bảng 11: Hiệu suất thủy phân bã khóm theo nồng độ nấm mốc Trichoderma sp Bảng 12: Lượng đường khử tạo thành theo nồng độ nấm mốc Trichoderma sp Bảng 13 : Hiệu suất thủy phân vật chất khô theo thời gian Bảng 14: Lượng đường khử tạo thành theo thời gian Bảng 15: Hiệu suất thủy phân vật chất khô theo nhiệt độ Bảng 16: Lượng đường khử tạo thành theo nhiệt độ Bảng 17: Hàm lượng cellulose mẫu bã khóm ban đầu mẫu thủy phân 10 Bảng 18: Hiệu suất thủy phân hàm lượng cellulose thí nghiệm sản xuất thử 11 Bảng 20: Hàm lượng đường khử mẫu bã khóm thủy phân thí nghiệm sản xuất thử PHỤ LỤC 3: Kết thống kê Kết thống kê thí nghiệm 1.1 Kết thống kê hiệu suất thủy phân bã khóm theo nồng độ nấm mốc Trichoderma sp khác 1.2 Kết thống kê lượng đường khử tạo thành theo nồng độ nấm mốc Trichoderma sp khác Kết thống kê thí nghiệm 2.1 Kết thống kê hiệu suất thủy phân vật chất khô theo thời gian 2.2 Kết thống kê lượng đường khử tạo thành theo thời gian Kết thống kê thí nghiệm 3.1 Kết thống kê hiệu suất thủy phân vật chất khô theo nhiệt độ 3.2 Kết thống kê lượng đường khử tạo thành theo nhiệt độ Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học iv Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 32 – 2010 Trường ĐHCT DANH SÁCH BẢNG Bảng số Tựa bảng Trang Bảng 1: Thành phần hóa học giá trị dinh dưỡng số phụ phẩm khóm Bảng 2: Thành phần cellulose, hemicellulose ligin số thực vật Bảng 3: Bảng bố trí thí nghiệm khảo sát lượng chế phẩm nấm mốc cần bổ sung 15 Bảng 4: Bảng bố trí thí nghiệm khảo sát thời gian thủy phân 16 Bảng 5: Bảng thí nghiệm khảo sát nhiệt độ thủy phân 17 Bảng 6: Bảng bố thí nghiệm sản xuất thử 17 Bảng 7: Thành phần ngun liệu bã khóm thí nghiệm 19 Bảng 8: Thành phần nguyên liệu bã khóm bã khóm thủy phân 27 Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học v Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 32 – 2010 Trường ĐHCT DANH SÁCH HÌNH Hình số Tựa hình Trang Hình 1: Cấu trúc cellulose Hình 2: Quá trình thủy phân cellulose Hình 3: Vỏ mắt khóm 12 Hình 4: Chế phẩm nấm Trichoderma sp 12 Hình 5: Một số thiết bị sử dụng thí nghiệm 13 Hình 6: Quy trình xử lý nguyên liệu bã khóm 14 Hình 7: Phụ phẩm khóm trước sau nghiền 14 Hình 8: Quy trình sản xuất thử nghiệm bã khóm thủy phân 18 Hình 9: Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng lượng chế phẩm nấm mốc Trichoderma sp lên q trình thủy phân bã khóm 20 Hình 10: Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng lượng chế phẩm nấm mốc Trichoderma sp lên trình thủy phân bã khóm để tạo lượng đường khử 21 Hình 11: Biểu đồ thể phần trăm chất bã khóm bị thủy phân theo thời gian (ngày) 22 Hình 12: Biểu đồ biểu diễn lượng đường khử sinh theo thời gian 23 Hình 13: Quá trình ủ bọc polypropylen sau ngày 24 Hình 14: Biểu đồ thể hiệu suất thủy phân chất nhiệt độ khác 25 Hình 15: Biểu đồ thể lượng đường khử tạo thành nhiệt độ khác 26 Hình 16: Hiệu suất thủy phân hàm lượng cellulose hàm lượng vật chât khô bổ sung chế phẩm nấm mốc Trichoderma sp 28 Hình 17: Lượng đường khử mẫu bã khóm ban đầu mẫu bã khóm thủy phân 28 Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học vi Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 32 – 2010 Trường ĐHCT CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU Với diện tích trồng khóm 365.396 (niên giám thống kê 2003) sản lượng nước đạt 337.500 khóm tươi/năm nguồn nguyên liệu dồi cho nhà máy chế biến khóm đóng hộp, nước khóm, khóm đặc, khóm tươi,… Tuy nhiên cơng nghiệp chế biến khóm thu khoảng 25% phẩm cịn lại 75% phụ phẩm phế thải Nếu không xử lý hợp lý kịp thời nguồn phụ phẩm góp phần gây nhiễm mơi trường, đồng thời chi phí cho việc xử lý rác thải lớn Tại nhà máy chế biến rau Tiền Giang, lượng bã khóm thải vào vụ lên đến 100 tấn/ngày, lượng bã thải từ dây chuyền chế biến nước cô đặc chiếm khoảng 50%, để giải lượng bã công ty gần hai trăm triệu đồng Trong công ty dịch vụ kỹ thuật nông nghiệp An Giang (Antesco) năm công ty tỷ đồng để xử lý nguồn phế phẩm trình sản xuất khóm thải (http://vneconomy.vn/20090306104756934P0C16/rac-nong-nghiep- cung-mang-ve-do-la.htm) Do việc tận dụng nguồn phế phẩm dồi vừa góp phần làm giảm thiểu ô nhiễm môi trường, vừa tăng thêm khoản thu cho nhà máy chế biến (bã khóm sau sấy khơ giá khoảng 1.100 - 1.200 đ/kg) Cơng ty Antesco (An Giang) tận dụng vỏ khóm ủ chua xuất thu thêm 70.000 USD/năm (tiết kiệm chi phí vận chuyển rác 700 triệu đồng) (http://vneconomy.vn/20090306104756934P0C16/rac-nong-nghiepcung-mang-ve-do-la.htm) Có nhiều phương pháp để tận dụng nguồn phụ phẩm khóm như: sấy khô nghiền nhiệt độ cao, ủ chua yếm khí, trộn với nguồn nguyên liệu khác,… Bên cạnh đó, việc sử dụng enzyme cellulase để phân cắt cellulose từ phụ phẩm khóm thành hợp chất carbon dễ tiêu vừa mang lại hiệu cao so với phương pháp nghiền sấy khơng có bổ sung enzyme vừa có tính an tồn khơng có chất độc hại Enzyme cellulase ly trích từ: nấm mốc, xạ khuẩn, vi khuẩn Tuy nhiên nấm mốc có thành phần mơi trường ni cấy đa dạng, thời gian tổng hợp cellulase ngắn (từ 36 - 48 cho hoạt tính cao) phát triển môi trường acid (pH 4,55,5) (Nguyễn Đức Lượng, 2004).Nên sinh khối nấm mốc sử dụng để xử lý Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1: Các phương pháp phân tích Phương pháp xác định độ ẩm phương pháp sấy khô: (Bùi Thị Nhu Thuận et al., 1991) Độ ẩm (hay gọi thủy phần) lượng nước tự có thực phẩm Nguyên tắc: Dùng sức nóng làm bay có thực phẩm Cân trọng lượng thực phẩm trước sau sấy khơ, từ tính phần trăm nước có thực phẩm Dụng cụ, vật liệu: - Tủ sấy điều chỉnh nhiệt độ đến 105oC 130oC; - Cân phân tích xác đến 0,0001 g; - Bình hút ẩm; - Cốc, đủa thủy tinh Tiến hành : Cân 5g mẫu, đem sấy 100-105 oC trọng lượng khô không đổi Để nguội bình hút ẩm cân trọng lượng sau sấy Tính kết quả: X  (G0  G1 ).100 G0 Trong đó: G0 : trọng lượng mẫu đem phân tích (g) G1 : trọng lượng mẫu sau sấy đến khối lượng không đổi (g) X : độ ẩm (%) Phương pháp xác định vật chất khô phương pháp sấy khô Vật chất khô (trọng lượng khơ) phần cịn lại sau đun nóng mẫu đến khối lượng không đổi Nguyên tắc: Dùng sức nóng làm bay có mẫu Cân trọng lượng mẫu trước sau sấy khơ, từ tính phần trăm vật chất khơ có mẫu phân tích Dụng cụ, vật liệu: - Tủ sấy điều chỉnh nhiệt độ đến 105oC 130oC - Cân phân tích xác đến 0,0001 g - Bình hút ẩm Tiến hành: Cân toàn mẫu, đem sấy 100-105oC trọng lượng khô không đổi Để nguội bình hút ẩm cân trọng lượng sau sấy Tính kết quả: X  G1 100 G0 Trong đó: X: Phần trăm vật chất khơ (%) G0: Trọng lượng mẫu đem phân tích (g) G1: Trọng lượng mẫu sau sấy đến khối lượng không đổi (g) Phương pháp xác định hiệu suất thủy phân vật chất khô Hiệu suất thủy phân vật chất khô hiệu suất đạt phần trăm chất trình thủy phân so với mẫu đối chứng (mẫu đối chứng có lượng vật chất khơ đinh mẫu đối chứng có hàm lượng vật chất khơ 100% có hiệu suất thủy phân vật chất khô 0%) Nguyên tắc: Dựa vào lượng vật chất khô thu sau sấy khô mẫu đến khối lượng khơng đổi, từ tính hiệu suất thủy phân Tiến hành: Sấy cân toàn khối lượng mẫu đối chứng đến trọng lượng không đổi (G0) Sấy cân toàn khối lượng mẫu phân tích đến trọng lượng khơng đổi (G1) Tính kết quả: X  G1 100 G0 Trong đó: X: Hiệu suất thủy phân vật chất khô (%) G0: Lượng vật chất khô mẫu đối chứng (g) G1: Lượng vật chất khơ mẫu phân tích (g) Phương pháp xác định hàm lượng cellulose: Mục đích thí nghiệm: nhằm khảo sát hàm lượng cellulose có bã khóm thu được, làm sở cho thí nghiệm Tiến hành thí nghiệm: a chuẩn bị hóa chất: dung dịch NaOH 0,5%, dung dịch HCl 10%, dung dịch hypoclorite Natri (nước Javel) b Cách tiến hành: quy trình định lượng hàm lượng cellulose bã khóm thực theo hình 20 Bã khóm nghiền mịn Sấy 105oC - Cân xác g vào cốc - Cân trọng lượng mẫu cốc (FO) - Lắp cốc vào máy phân tích (FIWE) Thêm vào 150ml H2SO4 1.25% Đun nóng 30 phút (kể từ lúc sơi) Lọc rữa lần với 30ml nước nóng Thêm 150ml KOH 1.25% Hình 18:Hệ thống phân tích xơ (FIWE 6) Đun Đunnóng nóng30 30phút phút(kể (kểtừtừlúc lúcsơi) sơi) Lọc rữa lần với 30ml nước nóng Rữa lần với 30 ml nước lạnh Rữa lần với 30 ml acetone - Sấy mẫu cốc 105oC - Cân trọng lượng thu (F1) - Tiếp tục nung 550oC - Cân trọng lượng thu (F2) Hình 19: Hệ thống nung (Nabertherm) % xơ = Hình 20: Các bước định lượng hàm lượng cellulose bã khóm Phương pháp xác định hiệu suất thủy phân cellulose Hiệu suất thủy phân cellulose hiệu suất đạt phần trăm cellulose mẫu đối chứng ban đầu bị trình thủy phân (mẫu đối chứng ban đầu có lượng cellulose định, mẫu đối chứng có hàm lượng cellulose 100% hiệu suất thủy phân cellulose lúc 0%) Hiệu suất thủy phân cellulose tính cơng thức: X  G1 100 G0 Trong đó: X: Hiệu suất thủy phân cellulose (%) G0: Lượng cellulose mẫu đối chứng (%) G1: Lượng cellulose mẫu phân tích (%) Phương pháp xác định hạm lượng tro: - Nung chén sứ rữa lò nung tới 550 oC-600oC đến trọng lượng khơng đổi Để nguội bình hút ẩm cân xác đến 0.0001 g - Cho khoảng gam mẫu vào chén sứ cân tất với độ xác Cho tất vào lị nung sấy đến 600 oC Nung tro trắng, nghĩa hết chất hữu cơ, thông thường khoảng 6-7 tùy loại mẫu Trường hợp tro đen, lấy để nguội cho thêm vài giọt H2O2 30% HNO3 đậm đặc nung lại tro trắng - Để nguội bình hút ẩm cân đến độ xác Tiếp tục nung thêm nhiệt độ 30 phút để nguội bình hút ẩm cân trọng lượng không đổi Kết lần nung liên tiếp không cách 0.5 mg cho gam chất thử - Tính kết quả: Hàm lượng tro tồn phần : X= Trong đó: X: hàm lượng tro toàn phần (g) G: Trọng lượng chén sứ (g) G1: Trọng lượng chén sứ trọng lượng mẫu phân tích trước cân (g) Phương pháp Nelson (1942) a Chuẩn bị hóa chất: - Dung dịch đệm maleic: hòa tan 11.6g acid maleic 900ml nước cất chỉnh pH 6.0 NaOH, thêm 0.74g CaCl2.H2O, chỉnh pH 6.0 sau đưa thể tích lít - Tinh bột 1% (w/v) (tinh bột hịa tan nước, đun nóng khuấy hồ hóa hồn tồn (dung dịch trong, khơng lắng cặn)) - Tinh bột 1% hịa tan dung dịch đệm maleic pH 6.0 - 2% (w/v) Tris-baz - Sodium phosphate buffer 0.2M (Na2HPO4/NaH2PO4) với dãy pH tăng dần từ 5.0-8.0 - Thuốc thử Đồng: Hỗn hợp A1:A2 = 4:1  A1: hòa tan 15g K-Na-tartrate H2O (muối Rochelle) 30g Na2CO3 (khan) vào 300ml H2O Thêm 20g NaHCO3 Hòa tan 180g Na2SO4 (khan) 500ml H2O nóng đun sơi để loại khí Trộn dung dịch sau làm nguội đưa thể tích lít nước cất  A2: Hịa tan 5g CuSO4.5H2O 45g Na2SO4 khan 250ml nước cất - Thuốc thử Arsenomolybdate: hỗn hợp B3:B4 = 1:2  B1: 26.5g (NH4)6Mo7O24.4H2O / 450ml H2O Vừa khuấy vừa thêm 21ml H2SO4 đậm đặc  B2: 3g Na2HAsO4.7H2O / 25ml H2O  B3: Hòa trộn B1 B2 với nhau, để tủ ủ 37oC thời gian từ 24 đến 48 bảo quản tối  B4: 41ml H2SO4 đậm đặc / lít nước cất ta thu H2SO4 1.5 N - 100mM dung dịch đệm Sodium Acetate pH 5.0 - Dung dịch chuẩn Glucose 0-1 mM 50 mM dung dịch đệm Sodium Acetate pH 5.0 b Cách tiến hành: + Dựng đường chuẩn glucose:  Pha dung dịch đường chuẩn: chuẩn bị ống nghiệm, cho vào ống thành phần chất theo bảng sau: [Glucose](mM) 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 Dung dịch glucose (1mM) 0.0ml 0.2ml 0.4ml 0.6ml 0.8ml 1.0ml H2O 1ml 0.8ml 0.6ml 0.4ml 0.2ml 0ml Tổng thể tích 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml  Dựng đường chuẩn: chuẩn bị dãy ống eppendorf (nghiệm thức lập lại lần) [Glucose](mM) 0.0mM 0.2mM 0.4mM 0.6mM 0.8mM 1.0mM Dung dịch glucose 150l 150l 150l 150l 150l 150l Thuốc thử Đồng 150l 150l 150l 150l 150l 150l Đun sôi 10 phút, để nguội nhiệt độ phòng Thuốc thử 150l Arseno-molybdate 150l 150l 150l 150l 150l Nước cất 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml Ủ 20 phút Ly tâm có cặn, đo quang phổ bước sóng 520nm  Ghi nhận kết Vẽ biểu đồ đường chuẩn + Xác định hàm lượng đường khử sản phẩm thủy phân: Đối chứng Dịch khóm Dịch thuỷ phân Dịch trích 150µl 150µl 150µl Hỗn hợp sau ủ 150 300 300 Thuốc thử Đồng 150µl 150µl 150µl Đun sơi 10 phút sau ổn định nhiệt độ phịng Thuốc thử Arseno-molybdete 150µl 150µl 150µl Nước cất 1.000µl 1.000µl 1.000µl Ủ tối 20 phút, ly tâm mẫu có cặn Đo quang phổ bước sóng 520 nm + Tính tốn kết quả: Dựa vào đường chuẩn xây dựng suy hàm lượng đường khử PHỤ LỤC 2: Số liệu thí nghiệm Bảng 9: Đường chuẩn glucose OD 520 nm Nồng độ glucose mM 0.2 0.4 0.6 0.8 ODLần 0.091 0.025 0.299 0.390 0.505 ODLần 0.090 0.022 0.311 0.418 0.489 ODLần 0.084 0.021 0.296 0.406 0.486 ODTB 0.088 0.023 0.302 0.405 0.493 0,2 0,4 0,6 0,8 Hình 21: phản ứng màu đường chuẩn glucose Hình 22: Đường chuẩn glucose Bảng 10: Khảo sát thành phần nguyên liệu bã khóm Các tiêu khảo sát Lần Lần Lần Trung bình pH 4,09 4,08 4,06 4,08 Độ ẩm (%) 82,51 82,44 82,46 82,47 Vật chất khô (g) 17,49 17,56 17,54 17,53 Hàm lượng cellulose (g) 2,64 2,64 2,65 2,64 Hàm lượng đường khử (g) 0,4237 0,4397 0,4297 0,4310 Hàm lượng tro (g) 1.1208 1.1344 1.1236 1,1262 Bảng 11: Hiệu suất thủy phân bã khóm theo nồng độ nấm mốc Trichoderma sp KL mẫu cịn lại sau sấy khơ (g) Mẫu lượng nấm (g) Lặp lại Lặp lại Lặp lại TB Hiệu suất thủy phân (%) ĐC 17,49 17,56 17,54 17,53 0,00 h 0,1 14,16 14,37 14,32 14,28 18,52 b 0,2 13,68 13,75 13,87 13,77 21,47 a 0,3 14,56 14,58 14,71 14,62 16,62 c 0,4 14,49 14,62 14,53 14,55 17,02 c 0,5 15,91 15,86 15,63 15,80 9,87 g 0,6 15,79 15,63 15,72 15,71 10,36fg 0,7 15,52 15,77 15,31 15,53 11,39ef 0,8 15,47 15,33 15,39 15,40 12,17de 0,9 15,26 15,35 15,09 15,23 13,10 d 10 15,02 15,59 15,34 15,32 12,63de ĐC: Bã khóm ban đầu Bảng 12: Lượng đường khử tạo thành theo nồng độ nấm mốc Trichoderma sp OD 520nM Lượng nấm (g) V TB (ml) ĐC 37,33 150 0,209 0,217 0,1 30,50 150 0,513 0,2 29,67 150 0,3 29,67 0,4 Pha loãng (lần) TB HL đường khử (g) 0,212 0,213 0,43g 0,522 0,504 0,513 0,84a 0,541 0,547 0,546 0,545 0,87a 150 0,424 0,480 0,487 0,464 0,74b 29,67 150 0,487 0,473 0,487 0,482 0,77b 0,5 29,67 150 0,321 0,329 0,323 0,324 0,52f 0,6 28,67 150 0,375 0,312 0,355 0,347 0,54ef 0,7 29,00 150 0,354 0,387 0,353 0,365 0,57cde 0,8 28,33 150 0,391 0,403 0,373 0,389 0,60 cd 0,9 29,33 150 0,411 0,393 0,363 0,389 0,62c 10 27,33 150 0,362 0,363 0,382 0,369 0,55 def Mẫu Lặp lại Lặp lại Lặp lại ĐC: Bã khóm ban đầu Bảng 13 : Hiệu suất thủy phân vật chất khô theo thời gian Mẫu Thời gian (ngày) Khối lượng mẫu lại (g) Lặp lại Lặp lại Lặp lại TB Hiệu suất thủy phân (%) ĐC 17,49 17,56 17,54 17,53 0,00 g 1 14,64 14,75 14,86 14,75 15,86 f 2 13,94 14,06 13,99 14,00 20,16 e 3 13,85 14,03 13,9 13,93 20,56de 4 13,79 13,74 13,88 13,80 21,26 d 5 13,71 13,52 13,56 13,60 22,44 c 6 13,26 13,49 13,12 13,29 24,19 b 7 12,93 13,02 13,03 12,99 25,88 a ĐC: Bã khóm ban đầu Bảng 14: Lượng đường khử tạo thành theo thời gian thời gian (ngày) V TB (ml) Pha loãng (lần) Lặp lại Lặp lại Lặp lại TB HL đường khử (g) ĐC 37,33 150 0,209 0,217 0,212 0,213 0,43c 1 33,00 150 0,298 0,306 0,287 0,297 0,53b 2 29,33 150 0,407 0,405 0,406 0,406 0,64a 3 26,67 150 0,452 0,449 0,454 0,451 0,65a 4 22,33 150 0,237 0,244 0,225 0,236 0,29d 5 18,33 150 0,124 0,122 0,114 0,120 0,12e 6 13,67 150 0,104 0,097 0,090 0,097 0,07f 7 11,67 150 0,081 0,077 0,091 0,083 0,05g Mẫu OD 520nM ĐC: Bã khóm ban đầu Bảng 15: Hiệu suất thủy phân vật chất khô theo nhiệt độ Khối lượng lại (g) Mẫu Nhiệt độ (oC) Lặp lại Lặp lại Lặp lại TB Hiệu suất thủy phân (%) ĐC Phòng 17,49 17,56 17,54 17,53 0,00 e Phòng 15,94 15,87 15,76 15,86 9,55 d 30 15,89 15,97 15,81 15,89 9,36 d 40 14,45 14,84 14,63 14,64 16,49 c 50 12,26 12,16 12,87 12,43 29,09 a 60 12,79 12,87 13,02 12,89 26,45 b ĐC: Bã khóm ban đầu Bảng 16: Lượng đường khử tạo thành theo nhiệt độ Nhiệt độ (oC) V TB (ml) Pha lỗng (lần) ĐC Phịng 37,33 150 0,203 0,210 Phòng 35,00 150 0,188 30 35,67 150 40 35,67 50 60 Mẫu ĐC: Bã khóm ban đầu OD 520nM TB HL đường khử (g) 0,201 0,205 0,42d 0,168 0,179 0,178 0,34e 0,171 0,173 0,174 0,173 0,34e 150 0,507 0,525 0,515 0,516 0,99c 36,33 300 0,711 0,720 0,727 0,719 2,82a 35,33 300 0,595 0,605 0,604 0,601 2,29b Lặp lại Lặp lại Lặp lại Bảng 17: Hàm lượng cellulose mẫu bã khóm ban đầu mẫu thủy phân chất khơ (g) Mẫu Bã Khóm 342,62 Mẫu thủy phân 245,3 kl cốc (g) kl mẫu sau phân tích (g) Tro (g) HL xơ (g) 29,4658 29,628 0,1622 0,0104 0,1510 1,0046 28,9168 29,0793 0,1625 0,0105 0,1513 Lần 1,0023 30,429 30,5897 0,1607 0,0102 0,1501 Lần 1,0017 30,0431 30,1826 0,1395 0,0101 0,1292 Lần 1,0068 30,2911 30,4303 0,1392 0,0101 0,1282 Lần 1,001 30,1264 30,2655 0,1391 0,0100 0,1290 Lặp lại kl mẫu (g) kl cốc+mẫ u (g) Lần 1,0057 Lần HL xơ TB (g) Xơ tổng (g) 0,1508 51,67 0,1288 31,60 10 Bảng 18: Hiệu suất thủy phân hàm lượng cellulose thí nghiệm sản xuất thử Mẫu chất khô (g) Xơ tổng (g) HS thủy phân cellulose (g) Bã khóm 342.62 51.67 Bã khóm thủy phân 245.3 31.60 38.84 Bảng 19: Hiệu suất thủy phân vật chất khơ thí nghiêm sản xuất thử Khối lượng cịn lại (g) Mẫu Lần Lần Lần Bã khóm 249.46 Bã khóm thủy phân 241.13 243.65 TB HS thủy phân (%) 342.62 0.00 244.75 28.57 11 Bảng 20: Hàm lượng đường khử mẫu bã khóm thủy phân thí nghiệm sản xuất thử V (ml) Mẫu Bã khóm thủy phân Lần Lần Lần TB Pha loãng (lần) 880 872 867 873 300 OD 520 nm Lần Lần Lần TB 0.688 0.675 0.684 0.682 HL đường khử (g) 64.308 HL đường khử (%) 3,22 PHỤ LỤC 3: Số liệu thống kê Kết thống kê thí nghiệm 1.1 Kết thống kê hiệu suất thủy phân bã khóm theo nồng độ nấm mốc Trichoderma sp khác Bảng 21: Thống kê hiệu suất thủy phân bã khóm theo nồng độ nấm mốc Trichoderma sp khác Multiple Range Tests for Hiệu suất thủy phân by Lượng nấm -Method: 95,0 percent LSD Lượng nấm Count Mean Homogeneous Groups -ĐC 0,0 0,5 9,86667 X 0,6 10,3633 XX 0,7 11,3867 0,8 12,17 XX 12,6267 XX 0,9 13,1033 X 0,3 16,6167 X 0,4 17,0167 X 0,1 18,5233 0,2 21,4667 X XX X X -ĐC : Bã khóm ban đầu 1.2 Kết thống kê lượng đường khử tạo thành theo nồng độ nấm mốc Trichoderma sp khác Bảng 22: Thống kê lượng đường khử tạo thành theo nồng độ nấm mốc Trichoderma sp khác Multiple Range Tests for HL duong khu by Lượng nấm -Method: 95,0 percent LSD Lượng nấm Count Mean Homogeneous Groups -ĐC 0,43 0,5 0,52 X 0,6 0,536667 XX 0,546667 XXX 0,7 0,573333 XXX 0,8 0,596667 XX 0,9 0,616667 X 0,3 0,743333 X 0,4 0,773333 X 0,1 0,843333 X 0,2 0,873333 X X -ĐC : Bã khóm ban đầu Kết thống kê thí nghiệm 2.1 Kết thống kê hiệu suất thủy phân vật chất khô theo thời gian Bảng 23: Thống kê hiệu suất thủy phân vật chất khô theo thời gian Multiple Range Tests for HS thuy phan by Thời gian -Method: 95,0 percent LSD Thời gian Count Mean Homogeneous Groups -0 0,0 X 15,86 20,1567 X 3 20,5533 XX 21,2567 X 22,4367 24,19 25,8767 X X X X 2.2 Kết thống kê lượng đường khử tạo thành theo thời gian Bảng 24: Thống kê lượng đường khử tạo thành theo thời gian Multiple Range Tests for HL duong khu by Thời gian -Method: 95,0 percent LSD Thời gian Count Mean Homogeneous Groups -7 0,0533333 X 0,0733333 0,116667 0,286667 0,43 0,53 0,64 X 3 0,65 X X X X X X Kết thống kê thí nghiệm 3.1 Kết thống kê hiệu suất thủy phân vật chất khô theo nhiệt độ Bảng 25: Thống kê hiệu suất thủy phân vật chất khô theo nhiệt độ Multiple Range Tests for HS thuy phan by nhiệt độ -Method: 95,0 percent LSD Nhiệt độ Count Mean Homogeneous Groups -ĐC 0,0 30 9,35333 X Phong 9,54333 X 40 16,4867 60 26,45 50 29,09 X X X X -ĐC : Bã khóm ban đầu 3.2 Kết thống kê lượng đường khử tạo thành theo nhiệt độ Bảng 26: Thống kê lượng đường khử tạo thành theo nhiệt độ Multiple Range Tests for HL duong by Nhiệt độ -Method: 95,0 percent LSD Nhiệt độ Count Mean Homogeneous Groups -30 0,336667 X Phong 0,34 X ĐC 0,416667 c 0,993333 60 2,29667 50 2,82 40 X X X X ... trình thủy phân chế phẩm nấm mốc Trichoderma sp (trong chế phẩm TRICƠ-KHĨM) chất bã khóm nghiền, rút số kết luận sau: Nấm mốc Trichoderma sp chế phẩm có khả sinh enzyme cellulase để thủy phân. .. thể bổ sung lượng chế phẩm nấm mốc từ 0,1 g – 0,4 g cho hiệu suất thủy phân cao bổ sung lượng chế phẩm nấm mốc từ 0,5 g – g Trong lượng chế phẩm nấm mốc 0,2 g cho hiệu suất thủy phân cao (21,47%)... hưởng lượng chế phẩm nấm mốc Trichoderma sp lên q trình thủy phân bã khóm Qua biểu đồ kết phân tích thống kê (Hình 9) cho thấy hiệu suất thủy phân bã khóm tăng bổ sung lượng chế phẩm nấm mốc định