Nghiên cứu bào chế chế phẩm có tác dụng hạ Lipid trong máu từ ba dược liệu táo mèo, hà thủ ô đỏ, cốt khí củ ở vùng Tây Bắc

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRỌNG ĐIỂM CẤP NHÀ NƯỚC GIAI ĐOẠN 2013-2018 "KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ PHỤC VỤ PHÁT TRIỂN BỀN VỮNG VÙNG TÂY BẮC" MÃ SỐ CHƯƠNG TRÌNH: KHCN-TB/13-18 BÁO CÁO TỔNG HỢP ĐỀ TÀI ĐỀ TÀI: “NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ CHẾ PHẨM CÓ TÁC DỤNG HẠ LIPID TRONG MÁU TỪ BA DƯỢC LIỆU TÁO MÈO, HÀ THỦ Ô ĐỎ, CỐT KHÍ CỦ Ở VÙNG TÂY BẮC” MÃ SỐ: KHCN-TB.04C/13-18 Cơ quan chủ trì đề tài : Học viện Quân y Chủ nhiệm đề tài : TS Nguyễn Văn Bạch HÀ NỘI – 2016 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ TRỌNG ĐIỂM CẤP NHÀ NƯỚC GIAI ĐOẠN 2013-2018 "KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ PHỤC VỤ PHÁT TRIỂN BỀN VỮNG VÙNG TÂY BẮC" MÃ SỐ CHƯƠNG TRÌNH: KHCN-TB/13-18 BÁO CÁO TỔNG HỢP ĐỀ TÀI ĐỀ TÀI: “NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ CHẾ PHẨM CÓ TÁC DỤNG HẠ LIPID TRONG MÁU TỪ BA DƯỢC LIỆU TÁO MÈO, HÀ THỦ Ơ ĐỎ, CỐT KHÍ CỦ Ở VÙNG TÂY BẮC” MÃ SỐ: KHCN-TB.04C/13-18 Chủ nhiệm đề tài Cơ quan chủ trì đề tài TS Nguyễn Văn Bạch HÀ NỘI – 2016 THÔNG TIN CHUNG VỀ ĐỀ TÀI CƠ QUAN CHỦ TRÌ: Học viện Quân y CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI: TS Nguyễn Văn Bạch CÁ NHÂN THAM GIA THỰC HIỆN CHÍNH - TS Nguyễn Văn Bạch - TS Hoàng Việt Dũng - PGS TS Nguyễn Minh Chính - PGS TS Trịnh Nam Trung - ThS Bùi Thị Bích Vân - TS Nguyễn Xuân Nhiệm - PGS TS Đỗ Quyên - ThS Phạm Tuấn Anh - TS Hoàng Quỳnh Hoa ĐƠN VỊ THAM GIA THỰC HIỆN - Học viện Quân y - Đại học Dược Hà Nội - Viện hóa sinh biển Viện Sinh thái & Tài nguyên sinh vật – Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam - Công ty Cổ phần sản xuất thương mại Hồng Bàng THỜI GIAN THỰC HIỆN: từ tháng 09/2014 đến tháng 12/2016 KINH PHÍ: 4.200,000 triệu đồng MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH NỘI DUNG Trang ĐẶT VẤN ĐỀ Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ BA DƯỢC LIỆU TÁO MÈO, HÀ THỦ Ô ĐỎ VÀ CỐT KHÍ CỦ 1.1.1 Tổng quan Táo mèo 1.1.1.1 Đặc điểm thực vật Táo mèo 1.1.1.2 Thành phần hóa học Táo mèo 1.1.1.3 Tác dụng dược lý Táo mèo 1.1.2 Tổng quan dược liệu Hà thủ ô đỏ 1.1.2.1 Đặc điểm thực vật Hà thủ đỏ 1.1.2.2 Thành phần hóa học Hà thủ ô đỏ 1.1.2.3 Một số tác dụng dược lý Hà thủ ô đỏ 11 1.1.3 Tổng quan dược liệu Cốt khí củ 14 1.1.3.1 Đặc điểm thực vật Cốt khí 14 1.1.3.2 Đặc điểm vi học rễ Cốt khí củ 16 1.1.3.3 Thành phần hố học Cốt khí củ 17 1.1.3.4 Một số tác dụng sinh học Cốt khí củ 18 1.1.3.5 Cơng dụng sử dụng vị thuốc Cốt khí củ 19 1.2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU THUỐC NGUỒN GỐC DƯỢC LIỆU CÓ 20 TÁC DỤNG ĐỐI VỚI BỆNH RỐI LOẠN LIPID MÁU 1.3 TỔNG QUAN VỀ VAI TRÒ CỦA ENZYM LIPASE TỤY, ENZYM CHOLESTEROL ESTERASE VÀ PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH ỨC CHẾ HAI ENZYM 27 1.3.1 Vai trò enzym lypase tụy trình chuyển hóa lipid đường tiêu hóa phương pháp đánh giá hoạt tính ức chế enzym in vitro 27 1.3.1.1 Vai trò enzym lypase tụy trình chuyển hóa lipid đường tiêu hóa 27 1.3.1.2 Phương pháp đánh giá hoạt tính ức chế enzym lipase tụy in vitro 29 1.3.2 Vai trò enzym cholesterol esterase q trình chuyển hóa lipid đường tiêu hóa phương pháp đánh giá hoạt tính ức chế enzym in vitro 30 1.3.2.1 Vai trò enzym cholesterol esterase q trình chuyển hóa lipid 30 đường tiêu hóa 1.3.2.2 Phương pháp đánh giá hoạt tính ức chế enzym cholesterol esterase in vitro 30 1.4 VÀI NÉT VỀ PHƯƠNG PHÁP PHUN SẤY TẠO BỘT CAO KHÔ 31 1.4.1 Cấu tạo máy phun sấy 31 1.4.2 Các giai đoạn phun sấy 32 1.4.3 Ưu nhược điểm phương pháp phun sấy 34 Chương NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ TRANG THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 35 2.1.1 Nguyên liệu 35 2.1.2 Dược liệu chuẩn, hóa chất, dung mơi, tá dược 35 2.1.3 Trang thiết bị nghiên cứu 36 2.1.4 Động vật nghiên cứu 37 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 37 2.2.1 Phương pháp điều tra nguồn tài nguyên dược liệu 37 2.2.2 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học đánh giá tác dụng ức chế enzym chuyển hóa lipid in vitro hợp chất phân lập từ dược liệu nghiên cứu 37 2.2.2.1 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm thực vật 37 2.2.2.2 Phương pháp phân lập nhận dạng cấu trúc hợp chất 38 2.2.2.3 Phương pháp đánh giá tác dụng ức chế enzym chuyển hóa lipid in vitro hợp chất phân lập 39 2.2.3 Phương pháp nghiên cứu điều chế đánh giá tiêu chuẩn chất lượng bột cao khô 43 2.2.3.1 Phương pháp nghiên cứu điều chế đánh giá tiêu chuẩn chất lượng bột cao khô Táo mèo 43 2.2.3.2 Phương pháp nghiên cứu điều chế đánh giá tiêu chuẩn chất lượng bột cao khô Hà thủ ô đỏ 51 2.2.3.3 Phương pháp nghiên cứu điều chế đánh giá tiêu chuẩn chất lượng bột cao khơ Cốt khí củ 60 2.2.3.4 Phương pháp đánh giá độ ổn định loại bột cao khô bào chế 68 2.2.4 Phương pháp nghiên cứu xây dựng cơng thức quy trình bào chế viên nang cứng chứa loại bột cao khơ Táo mèo, Hà thủ đỏ Cốt khí củ 69 2.2.4.1 Phương pháp khảo sát tỷ lệ phối hợp loại bột cao khô 69 2.2.4.2 Phương pháp xây dựng công thức bào chế cho viên nang cứng 69 2.2.4.3 Phương pháp xây dựng kỹ thuật bào chế viên nang cứng 70 2.2.4.4 Phương pháp đánh giá tiêu chuẩn chất lượng viên nang cứng bào chế 71 2.2.4.5 Phương pháp đánh giá độ ổn định viên nang cứng bào chế 74 2.2.5 Phương pháp đánh giá tính an tồn tác dụng hạ lipid máu viên nang cứng bào chế 75 2.2.5.1 Phương pháp đánh giá độc tính cấp chế phẩm 75 2.2.5.2 Phương pháp đánh giá độc tính bán trường diễn chế phẩm 76 2.2.5.3 Phương pháp đánh giá tác dụng hạ lipid máu chế phẩm 76 2.3 XỬ LÝ KẾT QUẢ 77 2.4 ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 78 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 79 3.1 KẾT QUẢ ĐIỀU TRA THỰC TRẠNG NGUỒN TÀI NGUYÊN BA DƯỢC LIỆU TÁO MÈO, HÀ THỦ Ơ ĐỎ VÀ CỐT KHÍ CỦ Ở VÙNG TÂY BẮC 79 3.2 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG ỨC CHẾ ENZYM CHUYỂN HÓA LIPID IN VITRO CỦA BA DƯỢC LIỆU NGHIÊN CỨU 81 3.2.1 Kết nghiên cứu đặc điểm thực vật ba dược liệu nghiên cứu 81 3.2.1.1 Kết nghiên cứu đặc điểm thực vật Táo mèo 81 3.2.1.2 Kết nghiên cứu đặc điểm thực vật Hà thủ ô đỏ 85 3.2.1.3 Kết nghiên cứu đặc điểm thực vật Cốt khí củ 88 3.2.2 Kết nghiên cứu thành phần hóa học ba dược liệu nghiên cứu 92 3.2.2.1 Kết chiết xuất, phân lập nhận dạng hợp chất từ Táo mèo 92 3.2.2.2 Kết chiết xuất, phân lập nhận dạng hợp chất từ Hà thủ ô đỏ 96 3.2.2.3 Kết chiết xuất, phân lập nhận dạng hợp chất từ Cốt khí củ 100 3.2.3 Kết đánh giá tác dụng ức chế enzym chuyển hóa lipid in vitro hợp chất phân lập từ dược liệu nghiên cứu 104 3.3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐIỀU CHẾ BA LOẠI BỘT CAO KHƠ TÁO MÈO, HÀ THỦ Ơ ĐỎ VÀ CỐT KHÍ CỦ 106 3.3.1 Kết nghiên cứu xây dựng quy trình điều chế đánh giá tiêu chuẩn chất lượng bột cao khô Táo mèo 106 3.3.1.1 Kết xây dựng thẩm định phương pháp định lượng quercetin 107 Táo mèo 3.3.1.2 Kết u đánh giá s ch tiêu chất lượng dược liệu u Táo m o 109 3.3.1.3 Kết xây dựng quy trình điều chế cao lỏng Táo mèo 110 3.3.1.4 Kết xây dựng quy trình điều chế bột cao khơ Táo mèo phương pháp phun sấy 113 3.3.1.5 Kết u đánh giá độ ổn định uy trình điều chế xây dựng tiêu chuẩn sở bột cao khô Táo m o 3.3.1.6 Kết u đánh giá độ ổn định bột cao khô Táo m o 120 3.3.2 Kết nghiên cứu xây dựng quy trình điều chế đánh giá tiêu chuẩn 125 121 chất lượng bột cao khô Hà thủ ô đỏ 3.3.2.1 Kết xây dựng thẩm định phương pháp định lượng THSG rễ Hà thủ ô đỏ 125 3.3.2.2 Kết u đánh giá s ch tiêu chất lượng rễ Hà thủ ô đỏ 127 3.3.2.3 Kết xây dựng quy trình điều chế cao lỏng Hà thủ đỏ 128 3.3.2.4 Kết xây dựng quy trình điều chế bột cao khô Hà thủ ô đỏ phương pháp phun sấy 131 3.3.2.5 Kết u đánh giá độ ổn định uy trình điều chế xây dựng tiêu chuẩn sở bột cao khô Hà thủ ô đỏ 139 3.3.2.6 Kết đánh giá độ ổn định bột cao khô Hà thủ ô đỏ 140 3.3.3 Kết nghiên cứu xây dựng quy trình điều chế đánh giá tiêu chuẩn chất lượng bột cao khơ Cốt khí củ 144 3.3.3.1 Kết xây dựng thẩm định phương pháp định lượng resveratrol Cốt khí củ 144 3.3.3.2 Kết u đánh giá s ch tiêu chất lượng dược liệu C t khí củ 146 3.3.3.3 Kết xây dựng quy trình điều chế cao lỏng Cốt khí củ 147 3.3.3.4 Kết xây dựng quy trình điều chế bột cao khơ Cốt khí củ 150 3.3.3.5 Kết u đánh giá độ ổn định uy trình điều chế xây dựng tiêu chuẩn sở bột cao khơ C t khí củ 3.3.3.6 Kết u đánh giá độ ổn định bột cao khơ C t khí củ 156 3.4 KÊT QUẢ XÂY DỰNG QUY TRÌNH BÀO CHẾ VIÊN NANG CỨNG CHỨA BA LOẠI BỘT CAO KHÔ TÁO MÈO, HÀ THỦ Ô ĐỎ VÀ CỐT KHÍ CỦ 161 3.4.1 Kết khảo sát tỷ lệ phối hợp loại bột cao khô 161 3.4.1.1 Kết u kh o sát dựa tác dụng ức chế enzym chuyển hóa lipid in vitro 161 3.4.1.2 Kết sàng lọc tác dụng hạ lipid máu in vivo 162 3.4.2 Kết xác định thành phần công thức bào chế viên nang cứng 167 3.4.3 Kết xây dựng quy trình bào chế viên nang cứng 169 3.4.4 Kết xây dựng tiêu chuẩn sở viên nang cứng bào chế 171 3.4.5 Kết đánh giá độ ổn định viên nang cứng bào chế 172 3.4.5.1 Kết đánh giá độ ổn định phương pháp lão hóa cấp tốc 172 3.4.5.2 Kết đánh giá độ ổn định điều kiện thường 173 3.5 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ TÍNH AN TOÀN VÀ TÁC DỤNG HẠ LIPID MÁU IN VIVO CỦA VIÊN NANG CỨNG BÀO CHẾ ĐƯỢC 175 3.5.1 Kết đánh giá độc tính cấp chế phẩm 175 3.5.2 Kết đánh giá độc tính bán trường diễn chế phẩm 175 3.5.2.1 Ảnh hưởng thuốc nghiên cứu lên tình trạng chung thay đổi thể trọng chuột cống trắng dùng dài ngày 175 3.5.2.2 Ảnh hưởng thuốc nghiên cứu đến điện tim chuột 176 3.5.2.3 Ảnh hưởng thu c nghiên cứu đến s ch tiêu huyết học chuột 3.5.2.4 Ảnh hưởng thu c nghiên cứu đến s ch tiêu sinh hóa chuột 177 3.5.2.5 Kết mơ bệnh học tạng chuột thí nghiệm 183 3.5.3 Kết đánh giá tác dụng hạ lipid máu in vivo chế phẩm 187 Chương BÀN LUẬN 192 157 180 4.1 VỀ THỰC TRẠNG NGUỒN TÀI NGUYÊN BA DƯỢC LIỆU TÁO MÈO, HÀ THỦ Ơ ĐỎ VÀ CỐT KHÍ CỦ 192 4.1.1 Dược liệu Táo mèo 192 4.1.2 Dược liệu Hà thủ ô đỏ 193 4.1.3 Dược liệu cốt khí củ 194 4.2 VỀ KẾT QUẢ PHÂN LẬP VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG ỨC CHẾ ENZYM CHUYỂN HÓA LIPID IN VITRO 194 4.3 VỀ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG HẠ LIPID MÁU IN VITRO CỦA CHẾ PHẨM VIÊN NANG CỨNG 197 KẾT LUẬN 201 KIẾN NGHỊ 204 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ACN AE CHCl3 CKC CR CT DĐVN DMSO DNPB EtOAc EtOH HDL HL HPLC HTO IC50 IU IR LDL LD50 LOD LOQ MD MS NC NMR OD PL RES RLLPM RSD SD SKLM TC TD TLCT TG THSG TM TT Acetonitril Aerosil Cloroform Cốt khí củ Chất rắn Công thức Dược điển Việt Nam Dimethylsulfoxyd 2,4-dinitrophenyl butyrat Ethyl acetat Ethanol Lipoprotein tỷ trọng cao Hàm lượng Sắc ký lỏng hiệu cao Hà thủ ô đỏ Nồng độ ức chế 50% hoạt tính Đơn vị quốc tế Infrared (hồng ngoại) Lipoprotein tỷ trọng thấp Liều gây chế 50% số động vật nghiên cứu Giới hạn phát Giới hạn định lượng Maltodextrin Mass spectrum (phổ khối) Nghiên cứu Nuclear magnetic resonance (cộng hưởng từ hạt nhân) Mật độ quang Lipase tụy Resveratrol Rối loạn lipid máu Độ lệch chuẩn tương đối Độ lệch chuẩn Sắc ký lớp mỏng Cholesterol toàn phần Tá dược Trọng lượng thể Triglycerid 2,3,5,4’-tetrahydroxy stilben-2-O-β-D-glucopyranosid Táo mèo Thuốc thử VLDL XN X Lipoprotein tỷ trọng thấp Xét nghiệm Giá trị trung bình 198 hợp hỗn hợp lại có tác dụng mạnh hỗn hợp Kết tác dụng hạ lipid máu hỗn hợp loại bột cao khô không tác động đến q trình chuyển hóa lipid đường tiêu hóa (liên quan đến tác dụng ức chế enzym chuyển hóa lipid lipase tụy cholesterol esterase) mà hỗn hợp cịn tác động vào số q trình chuyển hóa lipid khác ví dụ như: tăng q trình oxy hóa lipid gan, ức chế q trình sinh tổng hợp cholesterol gan, làm tăng hoạt tính lipoprotein lipase… Thực tế, kết sàng lọc tác dụng hạ lipid máu động vật thực nghiệm ln có độ xác tính tin cậy cao so với kết sàng lọc tác dụng ức chế enzym chuyển hóa lipid in vitro Lý thử thuốc in vitro đánh giá tác dụng thuốc cách đưa thuốc tiếp cận trực tiếp với đích phân tử Tuy nhiên, thử thuốc động vật để thuốc tiếp cận đích phân tử trước hết phải có sinh khả dụng tốt, phải bị chuyển hóa chậm gan có khả phân bố với nồng độ đủ để gây tác dụng đích phân tử Hơn nữa, kết thử nghiệm tác dụng dược lý động vật phản ánh hiệu theo chế khác có thuốc Vì vậy, tỷ lệ hỗn hợp lựa chọn cho trình nghiên cứu đề tài * Về xây dựng tiêu chuẩn chất lượng viên nang cứng Các tiêu chất lượng cho viên nang cứng Tabalix xây dựng dựa theo hướng dẫn Dược điển Việt Nam IV dựa tiêu chuẩn chất lượng sản phẩm viên nang cứng tương tự lưu hành thị trường thuốc Việt Nam Trong đó, tiêu chuẩn thường quy gồm có: tính chất, khối lượng làm khơ, độ đồng khối lượng, tro tồn phần, giới hạn nhiễm khuẩn khơng có khác biệt nhiều sản phẩm Với tiêu định tính, việc định tính phương pháp sắc ký lớp mỏng sử dụng dược liệu chuẩn để đối chiếu cần thiết để chứng minh có mặt dược liệu công bố chế phẩm Riêng tiêu định lượng, đa phần sản phẩm lưu hành thị trường không xây dựng tiêu Tuy nhiên, để hướng tới việc kiểm soát chất lượng chế phẩm chặt chẽ hơn, xây dựng tiêu định lượng thành phần hoạt chất cho chế phẩm Tabalix đề tài 199 Mặc dù, có loại bột cao khơ thành phần chế phẩm Tabalix, tương ứng với hoạt chất chọn làm chất đánh dấu cho loại bột cao khô Tuy nhiên, việc đưa tiêu định lượng đồng thời hoạt chất chế phẩm không phù hợp với thực tế phát triển sản phẩm sau Vì thế, chúng tơi lựa chọn kiểm soát hàm lượng 01 hoạt chất chế phẩm Trong số 03 hợp chất lựa chọn làm chất đánh dấu chất lượng viên nang cứng quercetin chọn, lý vì: - Qua khảo sát, tỷ lệ bột cao khơ Táo mèo thành phần chế phẩm nhiều - Xuất phát từ ý tưởng nhóm tác giả muốn lựa chọn Táo mèo làm thành phần để tạo nên đặc biệt chế phẩm Táo mèo trồng đặc trưng có vùng Tây Bắc đề tài lại thuộc Chương trình Tây Bắc * Về liều lượng dược liệu quy đổi từ liều chế phẩm dự kiến sử dụng Quá trình đánh giá tác dụng hạ lipid máu in vitro chế phẩm viên nang cứng, chúng tơi tính liều trung bình cho người nặng khoảng 50kg viên/ngày từ tính liều thử chuột 0,48g/kg TLCT/ngày liều thử gấp liều dự kiến sử dụng 0,96g/kg TLCT/ngày Theo tính tốn, lượng dược liệu sử dụng ngày quy đổi theo lượng bột cao khô sử dụng là: Táo mèo 2,0g; rễ Hà thủ ô đỏ 3,3g rễ Cốt khí củ 3,5g Nếu đánh giá dựa số lượng lượng dược liệu sử dụng (quy đổi từ dạng viên nang cứng) thấp so với lượng thường dùng hàng ngày trung bình dược liệu 6-12g Tuy nhiên, đánh giá dựa hàm lượng hoạt chất sử dụng cho kết ngược lại bởi: - Thứ nhất, hàm lượng hoạt chất bột cao khơ theo tính tốn gấp từ 2-5 lần so với hàm lượng chúng dược liệu tính theo đơn vị khối lượng - Thứ hai, cách sử dụng dược liệu theo kinh nghiệm dân gian chủ yếu sắc với nước Thực tế, theo kết khảo sát chúng tơi lượng hoạt chất chiết cách thấp đa phần hoạt chất dược liệu chất có độ phân cực trung bình đến yếu nên tan dung mơi nước 200 Vì vậy, với dạng sử dụng bột cao khơ lượng dược liệu quy đổi sử dụng thấp so với cách sử dụng dân gian thực tế lượng hoạt chất sử dụng lại nhiều * Về lựa chọn mơ hình đánh giá tác dụng hạ lipid máu in vivo Hiện nay, nghiên cứu tác dụng hạ lipid máu thường thực theo mơ hình gây tăng lipid máu nội sinh ngoại sinh Trong khuôn khổ đề tài, lựa chọn đánh giá tác dụng hạ lipid máu chế phẩm bào chế theo mơ hình gây tăng lipid máu ngoại sinh lý sau: Thứ nhất, nguyên nhân gây bệnh rối loạn lipid máu chế độ ăn uống không hợp lý Trong bữa ăn, tỷ lệ chất béo không hợp lý thường cao Điều dẫn tới lượng đưa vào thường vượt so với nhu cầu lượng thể hậu dẫn tới bệnh rối loạn lipid máu bệnh béo phì Vì vậy, chế phẩm có tác dụng ức chế enzym chuyển hóa lipid đường tiêu hóa góp phần làm giảm lượng chất béo hấp thu vào thể qua làm giảm nguồn cung lượng cho thể Thứ hai, hướng nghiên cứu tìm kiếm dược liệu hợp chất tự nhiên có tác dụng ức chế enzym chuyển hóa lipid lipase tụy cholesterol esterase đạng thu hút quan tâm nghiên cứu nhiều nhà khoa học giới Hơn nữa, hướng nghiên cứu thu kết đáng khích lệ góp phần đưa chứng giải thích tác dụng dược liệu sử dụng theo kinh nghiệm dân gian Nhiều hợp chất thuộc nhóm flavonoid, saponin, polyphenol… nghiên cứu thể hoạt tính ức chế enzym mạnh 201 KẾT LUẬN Từ kết nghiên cứu rút số kết luận sau: Về thực trạng nguồn dược liệu Táo mèo, Hà thủ ô đỏ Cốt khí củ vùng Tây Bắc Nguồn cung dược liệu Táo mèo tương đối dồi Đa số diện tích trơng Táo mèo mọc tự nhiên số trồng Cây Táo mèo phát triển tốt vùng đất cao, khí hậu lạnh, phân bố nhiều hai tỉnh Yên Bái Sơn La Cây Hà thủ ô đỏ chủ yếu khai thác từ rừng tự nhiên với trữ lượng ngày sụt giảm khai thác không kèm với bảo tồn phát triển Loài phân bố nhiều tỉnh Lai Châu Cây Cốt khí củ chủ yếu mọc bờ ruộng, nương, ven sông suối, vùng đất ẩm Cây tương đối dễ mọc chưa thấy có nơi trồng nhiều dược liệu vùng Tây Bắc Dược liệu mọc hoang nhiều hai tỉnh Yên Bái Lào Cai Về đặc điểm thực vật, thành phần hóa học đánh giá tác dụng ức chế enzym chuyển hóa lipid in vitro hợp chất phân lập - Đã mô tả chi tiết đặc điểm thực vật thẩm định tên khoa học nghiên cứu Táo mèo, Hà thủ ô đỏ Cốt khí củ - Đã phân lập hợp chất từ Táo mèo, 10 hợp chất từ rễ Hà thủ ô đỏ hợp chất từ rễ Cốt khí củ Trong đó, 03 hợp chất Docynicasid A-C phân lập từ Táo mèo hợp chất lần phân lập từ tự nhiên - 27 hợp chất phân lập từ dược liệu đánh giá hoạt tính ức chế enzym chuyển hóa lipid in vitro Kết cho thấy hợp chất thuộc nhóm flavonoid gồm quercetin, hyperosid hợp chất thuộc nhóm anthranoid gồm emodin, chrysophanol sở hữu hoạt tính ức chế enzym lipase tụy mạnh chất đối chứng dương Orlistat điều kiện thử nghiệm Trong đó, ba hợp chất quercitrin, quercetin-3--L-arabinofuranosid docynicasid A thể hoạt tính ức chế enzym cholesterol esterase in vitro mạnh hoạt tính chất đối chứng dương Simvastatin điều kiện thử nghiệm 202 Về xây dựng quy trình điều chế, xây dựng tiêu chuẩn sở đánh giá độ ổn định loại bột cao khô Táo mèo, Hà thủ đỏ Cốt khí củ - Đã đánh giá chất lượng xây dựng tiêu chuẩn sở cho dược liệu Táo mèo, rễ Hà thủ đỏ rễ Cốt khí củ Trong đó, tiêu chuẩn cho dược liệu Táo mèo xây dựng tiêu chuẩn cho dược liệu Hà thủ đỏ Cốt khí củ nâng cấp tiêu chuẩn dược liệu DĐVN IV - Đã khảo sát ảnh hưởng số yếu tố gồm: loại dung môi, tỷ lệ dung môi/dược liệu, thời gian chiết số lần chiết đến trình chiết xuất cao lỏng từ dược liệu nghiên cứu từ xác định điều kiện chiết xuất thích hợp - Đã khảo sát ảnh hưởng số yếu tố gồm: loại tá dược, tỷ lệ tá dược, nhiệt độ phun sấy tỷ lệ chất rắn dịch phun đến trình điều chế bột cao khô từ cao lỏng chiết xuất từ dược liệu nghiên cứu Kết quả, xác định thơng số thích hợp để tiến hành điều chế loại bột cao khô - Đã xây dựng quy trình điều chế loại bột cao khơ từ Táo mèo, rễ Hà thủ đỏ rễ Cốt khí củ quy trình điều chế thẩm định có độ lặp lại cao - Đã đánh giá chất lượng loại bột cao khô Táo mèo, Hà thủ đỏ Cốt khí củ điều chế từ xây dựng tiêu chuẩn sở loại bột cao khô - Đã xác định độ ổn định loại bột cao khơ điều kiện lão hóa cấp tốc tháng điều kiện thử nghiệm dài hạn tháng Về xây dựng công thức, quy trình bào chế, tiêu chuẩn sở đánh giá độ ổn định viên nang cứng chứa loại bột cao khô điều chế - Trên sở sàng lọc tác dụng ức chế enzym chuyển hóa lipid in vitro tác dụng hạ lipid máu in vivo xác định tỷ lệ phối hợp loại cao khô Táo mèo/Hà thủ ô đỏ/Cốt khí củ 2,2/1,0/1,0 - Đã khảo sát lựa chọn thành phần tá dược từ xây dựng cơng thức quy trình bào chế viên nang cứng - Đã xây dựng quy trình bào chế viên nang cứng chứa loại bột cao khô Táo mèo, Hà thủ đỏ Cốt khí củ Quy trình bào chế thẩm định có độ lặp lại cao - Đã đánh giá chất lượng chế phẩm viên nang cứng bào chế từ đưa tiêu chuẩn sở chế phẩm 203 - Đã xác định độ ổn định chế phẩm điều kiện lão hóa cấp tốc tháng điều kiện thử nghiệm dài hạn tháng Dự kiến tuổi thọ chế phẩm 18 tháng Về độc tính tác dụng hạ lipid máu chế phẩm bào chế động vật thực nghiệm - Về độc tính cấp: với mức liều cao cho chuột uống 24h 36,0g/kg TLCT, khơng có chuột chết 72 sau uống thuốc lần cuối suốt ngày sau uống thuốc Các chuột khỏe mạnh, lông mượt, mắt trong, ăn uống hoạt động bình thường Do vậy, khơng xác định LD50 chế phẩm chứng tỏ chế phẩm có tính an tồn cao - Về độc tính bán trường diễn: chế phẩm dùng liều 0,48g/kg TLCT 1,44g/kg TLCT liên tục 60 ngày khơng làm ảnh hưởng đến sóng điện tim số huyết học (hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu, hàm lượng hemoglobin) chuột cống trắng Các số sinh hóa đánh giá chức gan (AST, ALT) thận (ure, creatinin) giới hạn bình thường Hình ảnh đại thể mơ bệnh học gan, thận lách chuột cống trắng bình thường Các chuột dùng thuốc nghiên cứu có tăng trọng lượng mức độ tăng so với lơ chứng sinh lý Chỉ số cholesterol máu toàn phần lô dùng thuốc giảm so với lô chứng sinh lý so với trước dùng thuốc Như vậy, chế phẩm nghiên cứu với mức liều thời gian sử dụng nghiên cứu thực nghiệm chuột cống trắng có độc tính thấp Ngồi ra, chế phẩm cịn có tác dụng làm giảm cholesterol máu hạn chế tăng cân chuột cống trắng bình thường (chuột không gây rối loạn lipid máu) - Về tác dụng hạ lipid máu: chế phẩm mức liều 0,48g/kg TLCT 0,96g/kg TLCT có tác dụng tốt điều trị rối loạn lipid máu mơ hình gây rối loạn lipid máu thực nghiệm chuột cống trắng làm giảm cholesterol TG máu, tăng HDL-Cholesterol, giảm LDL-Cholesterol, VLDLCholesterol số AI Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê so sánh số lô dùng thuốc với lô chứng bệnh lý Tác dụng hạ lipid máu viên nang cứng Tabalix mức liều 0,48g/kg TLCT 0,96g/kg TLCT tương đương với tác dụng thuốc tham chiếu Atorvastatin mức liều 10mg/kg TLCT 204 KIẾN NGHỊ Để đưa chế phẩm thị trường, chúng tơi có số kiến nghị sau: - Tiếp tục nghiên cứu hồn thiện quy trình sản xuất quy mô lớn - Đánh giá độ ổn định điều kiện thường khoảng thời gian dài - Tiến hành đánh giá tác dụng hạ lipid chế phẩm viên nang cứng theo mơ hình gây tăng lipid nội sinh TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Nguyễn Thị Mai Anh, Đào Văn Phan Phạm Thị Vân Anh (2005), “Bước đầu nghiên cứu tác dụng nấm Linh chi Việt Nam (Ganoderma lucidum) qua số số lipid máu chuột cống”, Tạp chí nghiên cứu y học, tập 38 (5), trang 42 - 45 Bộ Y tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, Nhà xuất Y học, tr.726-727 Võ Văn Chi (2012), Từ điển thuốc Việt Nam, Nxb Y học, Hà Nội, tập 1, tr 619-620, 1058 Lê Xuân Duy, Nguyễn Thị Hà Ly, Nguyễn Minh Khởi, Phương Thiện Thương “Thành phần hóa học rễ hà thủ đỏ thu hái Việt Nam”, Tạp chí dược liệu số 2-2014 Đỗ Trung Đàm (2014), Phương pháp xác định độc tính thuốc, Nhà xuất Y học Trần Thị Lệ Hằng (2013), Nghiên cứu thành phần hóa học đánh giá tác dụng dung nạp glucose tế bào vân Táo mèo (Docynia indica (Wall.) Decne), Luận văn Thạc sĩ dược học, Học Viện Quân Y, Hà Nội Vũ Việt Hằng, Phạm Thúc Hạnh CS (2006), “Nghiên cứu tác dụng điều trị hội chứng rối loạn lipid máu thuốc cốm GCL”, Y học thực hành, số 4, trang 13 - 16 Đặng Thị Bích Huệ (2001), Nghiên cứu ảnh hưởng phương pháp chế biến đến thành phần hóa học tác dụng sinh học vị thuốc Cốt khí củ (Radix Polygoni cuspidati), Luận văn thạc sỹ Dược học, Trường Đại học Dược Hà Nội Nguyễn Thị Ngọc Loan (2012), Chiết xuất phân lập số hợp chất từ phân đoạn n-hexan táo mèo Sơn La, Khóa luận tốt nghiệp., Trường Đại học Dược Hà Nội 10 Nguyễn Thị Thanh Loan cộng (2011), "Tác dụng chống béo phì giảm trọng lượng dịch chiết Táo mèo (Docynia indica (Wall.) Decne.) mơ hình chuột béo phì thực nghiệm", Tạp chí Quốc gia Hà Nội 27, tr 125 – 133 hoa học ại học 11 Đỗ Tất Lợi (2004), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, NXB Y học,, tr.355-357, 506-507 12 Phan Hải Nam (2005), “Nghiên cứu ảnh hưởng thuốc hạ huyết áp Ngưu tất, Hòe hoa, Linh chi (NHL) số cholesterol triglycerid máu bệnh nhân tăng huyết áp có rối loạn lipid máu”, Y học Việt Nam, số 5, trang 17 - 21 13 Đỗ Viết Phương (2006), “Tác dụng điều trị rối loạn lipid máu bệnh nhân thiểu tuần hồn não mạn tính thuốc ST 99”, Nghiên cứu y dược học cổ truyền Việt Nam, số 17, trang - 12 14 Hoàng Thị Minh Tân (2009), Nghiên cứu tách chiết số hợp chất tự nhiên từ Táo mèo có tác dụng chống rối loạn trao đổi gluxit, lipid, Luận văn Thạc sỹ sinh học, Trường ĐHKHTN-ĐHQGHN 15 Vũ Thị Ngọc Thanh (2007), “Nghiên cứu thực nghiệm tác dụng điều trị rối loạn lipid máu flavonoid chiết xuất từ hoa Kim ngân”, Tạp chí nghiên cứu y học, tập 50 (4), trang 115 - 120 16 Nguyễn Trọng Thông, Vũ Thị Ngọc Thanh, Nguyễn Phương Thanh, Đàm Đình Tranh (2014), “Xây dựng mơ hình gây rối loạn lipid máu hỗn hợp dầu cholesterol chứa lượng thấp acid cholic chuột cống trắng”, Tạp chí Nghiên cứu dược & Thơng tin thuốc, số 5, tr 179-182 17 Nguyễn Thị Minh Thư (2012), Nghiên cứu tác dụng chống lại số vi khuẩn kháng kháng sinh (Moraxella catarrhalis) gây nhiểm đường hô hấp người dịch lên men Táo mèo (Docynia indica), Luận văn thạc sỹ Ngành Vi sinh vật học, Trường ĐHKHTN-ĐHQGHN 18 Viện Dược liệu (2004), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, tập 1, Nxb Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội, tr 529-531 19 Viện khoa học công nghệ Việt Nam (2007), Thực vật chí Việt Nam, Nhà xuất khoa học Kỹ thuật, tr.121-127, 209-211 Tài liệu tiếng Anh 20 Ashok Kumar, Subhash Dhawan, Bharat B Aggarwal (1998), “Emodin (3methyl-1,6,8-trihydroxyanthraquynone) inhibits TNF-induced NF-kB activation, IkB degradation, and expression of cell surface adhesion proteins in human vascular endothelial cells”, Oncogene, (17), pp 913 – 918 21 Boran Ni, Changhai Qu, Hongmei Lin et al (2014), “Traditional usages botany, phytochemistry, pharmacology and toxicology of Polygonum multiflorum Thunb.: A review”, pp.7-21 22 Birari R B et all (2007), "Pancreatic lipase inhibitors from natural sources: unexplored potential", Drug Discov Today 12(19-20), pp 879-89 23 Bose, S.; Maji, S.; Chakraborty, P (2003), “Quercitrin from Ixora coccinea leaves and its antioxidant activity”, Journal of Phamascitech, 2, 72–74 24 Bustanji Y et all (2010), "Inhibition of hormone sensitive lipase and pancreatic lipase by Rosmarinus officinalis extract and selected phenolic constituents", Journal of Medicinal Plants Research 4(21), pp 2235-2242 25 Bustanji Y et all (2011), "Screening of some medicinal plants for their pancreatic lipase inhibitory potential", Jordan Journal of Pharmaceuticaln Sciences 4, pp 81-88 26 Cheol-Soo Park, Young-Choon Lee, Jong-Dae Kim et al (2004) “Inhibitory effects of Polygonum cuspidatum water extract (PCWE) and its component resveratrol on acyl-coenzyme A–cholesterol acyltransferase activity for cholesteryl ester synthesis in HepG2 cells”, Vascular Pharmacology, 40 ,pp 279 - 284 27 Chih-Chen Lee, Yen-Ting Chen, Chien-Chih Chiu et al (2014), “Polygonum cuspidatum extracts as bioactive antioxidaion, anti-tyrosinase, immune stimulation and anticancer agents”, Journal of Bioscience and Bioengineering, pp 1-6 28 Choi S Z., Lee S O., Jang K U (2005), “Antidiabetic stilbene and anthraquinone derivatives from Rheum undulatum”, Arch Pharm Res., 28, 1027–1030 29 C David Raj, V Jayanthi, V S Manaswini et al (2012), “Effect of polyherbal formulation (OB-6) on high fat diet induced hyperlipidemia in rats”, International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, vol (2), pp 31 - 35 30 Dadhania Sagar S, Shah Nirzarini N, Sachdeva Punam D, Patel Nikunj B, Jani Dilip K (2011), A Study of Anti-Hyperlipidemic Activity of Polyherbal Formulation Using Various Experimental Animal Models, Ethnopharmacology, Vol 2, Issue 31 Davis, A L.; Cai, Y.; Davies, A P et al (1996), “1H and 13C NMR assignments of some green tea polyphenols”, Magnetic Resonance in Chemistry, 34, 887890 32 Dekic, S.; Milosavljevic, S.; Vajs, V et al (2008), “Trans- and cis-resveratrol concentration in wines produced in Serbia”, Journal of the Serbian Chemical Society, 73, 1027–1037 33 E D Rodrigues, D B da Silva, D C R de Oliveira, G V J da Silva DOSY NMR applied to analysis of flavonoid glycosides from Bidens sulphurea Magnetic Resonance in Chemistry, 47, 1095-1100 (2009) 34 Flora of China (2003), 9, pp 171 35 Guo, S.; eng, B.; Zhu, R.; Ma, J et al (2011), “Preparative isolation of three anthraquinones from Rumex japonicus by high-speed counter-current chromatography”, Molecules, 16, 1201‒ 1210 36 Hideka Arichi et al (1980), “Effects Stilbene Components of the Roots of Plygonum cuspidatum Sieb et Zucc on Lipid Metabolism”, Chem Pharm Bull, 30 (5), pp 1766-1770 37 Hitoshi Masaki, Sachiko Sakaki, Takamasa Atsumi et al (1995), “ActiveOxygen Sacavenging Activity of plant Extracts”, Biol.pharm.Bull, 18(1), pp 162-166 38 H Ito, E Kobayashi, S.-H Li, T Hatano, D Sugita, N Kubo, S Shimura, Y Itoh, T Yoshida Megastigmane Glycosides and an Acylated Triterpenoid from Eriobotrya japonica Journal of Natural Products, 64, 737-740 (2001) 39 Ikuo Ikeda, Ryosuke Matsuoka, Tadateru Hamada et al (2002), “Cholesterol esterase accelerates intestinal cholesterol absorption”, Biochimica et Biophysica Acta, vol 1571, pp 34 – 44 40 Jamuna Devi and Johanna Rajkumar (2013), “Antihyperlipidemic effect of ambrex a polyherbal formulation against experimentally induced hypercholesterolemia in rats”, African Journal of Pharmacy and Pharmacology, vol (25), pp 1737 - 1743 41 Jian Du et al (2009), “Lipid-lowering effects of polydatin fromPolygonum cuspidatum in hyperlipidemic hamsters”, Phytomedicine, (16), pp 652–658 42 Jonathan K Embleton, Colin W Pouton (1997), “Structure and function of gastro-intestinal lipases”, Advanced Drug Delivery Reviews, vol 25, pp 15-32 43 Joseph A Baur and David A Sinclair (2006), Therapeutic potential of resveratrol: the in vivoevidence, Nature reviews Drug discovery, 5, pp 293-306 44 Kai Xiao, Lijiang Xuan, Yaming Xu et al (2000), “Stilbene Glycoside Sulfates fromPolygonum cuspidatum”, J Nat Prod, (63), pp 1373-1376 45 Kim Y S et all (2012), "Inhibitory activities of Cudrania tricuspidata leaves on pancreatic lipase in vitro and lipolysis in vivo" Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine 2012 46 Krzysztof Cal et al (2010), "Spray drying technique I: Hardware and process parameters", Journal of pharmaceutical sciences, 99(2), pp 575- 585 47 K Shimoda, N Kubota, K Taniuchi, D Sato, N Nakajima, H Hamada, H Hamada Biotransformation of naringin and naringenin by cultured Eucalyptus perriniana cells Phytochemistry, 71, 201-205 (2010) 48 Lallemand, J Y.; Duteil, M (1977), “13C N.M.R spectra of quercetin and rutin”, Magnetic Resonance in Chemistry, 9, 179180 49 Liao shu, Li Anjen (Li An-ren), Alisa E Grabovskaya-Borodina et al (2003), Flora of China 5, Polygonum Linnaeus, pp 278-315 50 Loo, P V.; Bruyn, A D.; Buděšínský, M (1986), “Reinvestigation of the structural assignment of signals in the 1H and 13C NMR spectra of the flavone apigenin”, Magnetic Resonance in Chemistry, 24, 879–882 51 Moreno-Labanda, J F.; Mallavia, R.; Perez-Fons, L et al (2004), “Determination of peceid and resveratrol in Spanish wines deriving from Monastrell (Vitis vinifera L.) grape variety”, Journal of Agriculture and Food Chemistry, 52, 53965403 52 Mudit Dixit et al ( 2010), "Spray drying : a crystallization technique: a review", International Journal of Drug Formulation & Research, 1(2), pp.1-29 53 Nguyen, P H.; Zhao, B T.; Lee, J H et al (2014), “Antithrombotic phenolics from the stems of Parthenocissus tricuspidata possess antiinflammatory effect Bulletin of the Korean Chemical Society, 35, 1763‒ 1768 54 OECD (2002), Drug Safety Evaluation I: Acute and subchronic toxicity assessement, USA Academy Press 55 Owen, R W.; Haubner, R.; Mier, W et al (2003), “Isolation, structure elucidation and antioxidant potential of the major phenolic and flavonoid compounds in brined olive drupes”, Food and Chemical Toxicology, 41, 703717 56 Qiu, Y K.; Yoshikawa, M.; Li, Y H et al (2000), “A study on chemical constituents of the stems of Opuntia dillenii (Ker-Gaw.) Haw”, Journal of Shenyang Pharmacy University, 17, 267268 57 Ramalingam Saravanan and Leelavinothan Pari (2005), “Antihyperlipidemic and antiperoxidative effect of Diasulin, a polyherbal formulation in alloxan induced hyperglycemic rats”, BMC Complementary and Alternative Medicine, vol (14), pp - 58 R P Patel et al (2009) , "Spray drying technology: an overview", Indian journal of Science and Technology, 2(10), pp 44-47 59 Seiva F R F., Chuffa L G A., Braga C P., et al (2012), “Quercetin ameliorates glucose and lipid metabolism and omproves antioxidant status in postnatally monosodium glutamate-induced metaboli alterations”, Food and Chemical Toxicology, vol 50, pp 3556-3561 60 Sirichai Adisakwattana, Julnaryn Intrawangso, Araya Hemrid et al (2012), “Extracts of Edible Plants Inhibit Pancreatic Lipase, Cholesterol Esterase and Cholesterol Micellization, and Bind Bile Acids”, Food Technol Biotechnol., vol 50, pp 11–16 61 Sivakuma, B.; Murugan, R.; Baskaran, A (2013), “Identification and characterization of process-related impurity of trans-resveratrol”, Scientia Pharmaceutica, 81, 683‒ 695 62 Shin Duk Kim (2010), “Isolation, Structure and Cholesterol Esterase Inhibitory Activity of a Polysaccharide, PS-A, from Cordyceps sinensis”, J Korean Soc Appl Biol Chem., vol 53(6), pp 784-789 63 Sharma P B., Handique P.J et all (2015), "Antioxidant properties, physicochemical characteristics and proximate composition of five wild fruits of Manipur, India", Journal of Food Science and Technology 52(2), pp 894-902 64 Song, M X., Guo, W J (2002), Xin Bian Guo Jia Zhong Cheng Yao, People’s Medical Publishing house 65 Sivakuma, B.; Murugan, R.; Baskaran, A.; Khadangale, B P et al (2013), “Identification and characterization of process-related impurity of transresveratrol”, Scientia Pharmaceutica, 81, 683‒ 695 66 Sukito, A.; Tachibana, S (2014), “Isolation of Hyperoside and Isoquercitrin from Camellia sasanqua as Antioxidant Agents”, Pakistan Journal of Biological Sciences, 17, 9991006 67 Suksamrarn, A.; Eiamong, S.; Piyachaturawat, P (1997), “A phloracetophenone glucoside with choleretic activity from Curcuma comosa”, Phytochemistry, 45, 103105 68 S Lee, D.-S Shin, K.-B Oh, K Shin Antibacterial compounds from the leaves of Acanthopanax senticosus Archives of Pharmacal Research, 26, 40-42 (2003) 69 T Fukunaga, K Nishiya, I Kajikawa, Y Watanabe, N Suzuki, K Takeya, H Itokawa Chemical studies on the constituents of Hyphear Tanakae HOSOKAWA from different host trees Chemical & pharmaceutical bulletin, 36, 1180-1184 (1988) 70 Vrchotová N., Šerá B., and Tříska J (2007), “The stilbene and catechin content of the spring sprouts of Reynoutria species”, Acta Chromatographica, 19, pp 21-28 71 Weidong Xie, Yunan Zhao, Lijun Du (2012), “Emerging aprroaches of traditional chinese medicine formulas for the treatment of hyperlipidemia”, Journal of Ethnopharmacology, vol 140, pp 345-367 72 Wei Peng, Rongxin Qin, Xiaoli Li et al (2013), “Botany, phytochemistry, pharmacology, and potential application of Polygonum cuspidatumSieb et Zucc.: A review”, Journal of Ethnopharmacology, 148, pp 729–745 73 Wen, P.; Han, H Y.; Wang, R W et al (2007), “C-glycosylfavones and aromatic glycosides from Campylotropis hirtella”, Asian Journal of Traditional Medicines, 2, 149153 74 WHO (1993), Research Guidelines For Evaluating the Safety and Efficacy of Herbal Medicines, ROWP, Manila, Philippines 75 WHO (2000), General Guidelines for Methodologies on Research and Evaluation of Traditional Medicine, EDM/TRM, Geneva, Switzerland 76 WHO (2006), 40th Report of WHO Expert Committee on Specifications for Pharmaceutical Preparations, pp 12 77 WHO (2006), “Stability: global challenges to harmonization”, 12th international conference of drug regulatory authorities proceedings, pp 61-63 78 Yamini B Tripathi (2009), “BHUx: A patented polyherbal formulation to prevent hyperlipidemia and atherosclerosis”, Recent Patents on Inflammation & Allergy Drug Discovery, vol 3, pp 49 - 57 79 Zheng C D., Duan Y Q., Gao J M., et al (2010), “Screening for Antilipase Properties of 37 traditional Chinese Medical Herbs”, Original article, vol 73(6), pp 319-324 80 Zhou X., Song B., Jin L., Hu D et al (2006), “Isolation and inhibitory activity against ERK Phosphorylation of hydroxyanthraquinones from rhubarb”, Bioorg Med Chem Lett., 16 (3), 563–568