PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN SALMONELLA THỰC PHẨM BẰNG KỸ THUẬT PHẢN ỨNG TỔNG HỢP CHUỖI THỜI GIAN( REALTIME POLYMERASE CHAIN REACTION)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HCM - CHỦ ĐỀ TIỂU LUẬN PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN SALMONELLA THỰC PHẨM BẰNG KỸ THUẬT PHẢN ỨNG TỔNG HỢP CHUỖI THỜI GIAN( REAL-TIME POLYMERASE CHAIN REACTION) Cán hướng dẫn: TS NGUYỄN MINH XUÂN HỒNG TH.S LÊ THỊ PHƯỢNG LINH Học viên thực hiện: ĐẶNG BÁ LĨNH LÊ THỊ THANH HIỀN VÕ THỊ NGUYỆT MAI Khóa: 2019- đợt Chuyên ngành: CƠNG NGHỆ THỰC PHẨM TP Hồ Chí Minh – Tháng 5/2020 MỤC LỤ I ĐẶT VẤN ĐỀ II NỘI DUNG PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN SALMONELLA THỰC PHẨM BẰNG KỸ THUẬT PHẢN ỨNG TỔNG HỢP CHUỖI THỜI GIAN( REAL-TIME POLYMERASE CHAIN REACTION) Giới thiệu Phạm vi áp dụng 10 Nguyên tắc chung 10 Các bước tiến hành 11 4.1 Thiết bị dụng cụ 11 4.2 Mơi trường hóa chất 11 4.3 Mẫu 11 4.4 Các bước tiến hành 11 4.4.1 Tiền tăng sinh 11 4.4.2 Ly trích AND 12 4.4.3 Chuẩn bị phản ứng Real-time PCR 12 4.4.4 Cách đọc kết .12 III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 15 IV KẾT LUẬN .22 V TÀI LIỆU THAM KHẢO 23 I ĐẶT VẤN ĐỀ Salmonella xếp vào giới Bacteria, ngành Proteobacteria, họ Enterobacteriaceae, chi Salmonella Giống Salmonella chia thành lồi: Salmonella bongori (khơng gây bệnh) Salmonella enterica (gây bệnh) Ðến nay, 2.500 kiểu huyết thuộc chi Salmonella S enterica lại chia làm loài khác S enterica (S enterica I), S salamae (S enterica II), S arizonae (S enterica IIIa), S diarizonae (S enterica IIIb), S houtenae (S enterica IV) S indica (S enterica VI) Lồi S bongori cịn gọi Salmonella V (Popoff, 2001) Phần lớn, serotype thuộc S enterica I nguyên nhân gây 99,9 % bệnh nhiễm trùng người động vật Trong đó, số lồi Salmonella có tầm quan trọng chẩn đoán bệnh ngườivà động vật là: (1) S typhi: gây bệnh cho người Ở Việt Nam, bệnh thương hàn chủ yếu vi khuẩn gây (2) S paratyphy A: gây bệnh thương hàn cho người Ở Việt Nam, thường phát vi khuẩn sau vi khuẩn S typhi (3) S paratyphy B: gây bện thương hàn chủ yếu cho người, có súc vật, thương phát nước châu Âu (4) S paratyphy C: vừa có khả gây bệnh thương hàn vừa có khả gây bệnh viêm dày ruột nhiễm khuẩn huyết, thường xuất nước Đông Nam Á (5) S typhimurium S enteritidis gây bệnh cho người gia súc, nguyên nhân chủ yếu nhiễm khuẩn, nhiễm độc thức ăn vi khuẩn Salmonella (6) S choleraesuis: nguyên thường gặp nhiễm trùng huyết vi khuẩn Salmonella gây nước ta Về hình thái, Salmonella trực khuẩn Gram âm, hình que, ngắn, hai đầu trịn, kích thước trung bình khoảng 0,4–0,6 x 1–3 µm, di chuyển tiên mao trừ S gallimarum S pullorum, có khoảng đến 12 tiên mao bao quanh thân; phát triển tốt nhiệt độ 6°C- 42°C, thích hợp 37 °C, pH thích hợp 6,8–7,2 Đặc điểm nuôi cấy, Salmonella vi khuẩn kỵ khí tùy nghi, phát triển môi trường nuôi cấy thông thường, làm đục môi trường canh thang sau 18 h Trên môi trường thạch thường, khuẩn lạc Salmonella tròn, lồi, trắng xám, trong, bờ đều, đường kính khoảng1 – 1,5 mm Salmonella mọc mơi trường có chất ức chế chọn lọc HE (hektoen entericagar), XLD (xylose lysine deoxycholate) Trên mơi trường HE, khuẩn lạc Salmonella có màu thay đổi từ xanh dương đến xanh lục, có hay khơng có tâm đen, số dịng Salmonella có tâm đen bóng lớn chiếm gần hết khuẩn lạc Cịn môi trường XLD (xylose lysine deoxycholate), khẩn lạc đặc trưng Salmonella có màu hồng suốt,có hay khơng có tâm đen, số dịng Salmonella có tâm đen bóng lớn chiếm gần hết khuẩn lạc, môi trường xung quanh khuẩn lạc chuyển sang màu đỏ Đặc điểm sinh hóa, phần lớn, chủng Salmonella khơng lên men lactose, lên men glucose sinh Phản ứng oxidase âm tính, indol âm tính, VP âm tính, ure âm tính, H2S dương tính Tình trạng nhiễm Samonella Salmonella chủng vi khuẩn nguy hiểm Bất phẩm tươi có nguồn gốc từ động vật thịt gia súc, thịt gia cầm, sữa sản phẩm từ sữa, hải sản với số rau, nhiễm vi khuẩn Salmonella (Malonry ctv, 2004) Theo thống kê Tổ chức Y tế giới (WHO) hàng năm giới có 1,3 tỉ trường hợp bị nhiễm Salmonella xấp xỉ triệu trường hợp tử vong Do đâu thực phẩm, nước uống nhiễm vi khuẩn Salmonella? Nguồn tiết vi khuẩn Salmonella chủ yếu phân người bị bệnh thương hàn, ngồi cịn Salmonella cịn xuất theo đường nước tiểu, đờm, chất nôn người bệnh thương hàn Vi khuẩn thải qua phân tất giai đoạn bệnh, kể giai đoạn nung bệnh, thải nhiều vào tuần - bệnh Đặc điểm vi khuẩn thải theo phân thành đợt Bên cạnh đó, người lành mang vi khuẩn (một số người bị bệnh thương hàn khỏi bệnh mang vi khuẩn ruột) xuất vi khuẩn theo phân lần đại tiện (bệnh nhân khỏi lâm sàng có khoảng từ 5% tiếp tục mang vi khuẩn sau vài tháng vi khuẩn khu trú túi mật, đường dẫn mật ) Người lành mang vi khuẩn khơng có triệu chứng lâm sàng, đường lây quan trọng khó kiểm soát Cả hai loại nguồn bệnh đào thải mơi trường, từ Salmonella lây nhiễm cho thực phẩm (thịt, cá, rau…) nguồn nước vào người ăn, uống phải thực phẩm, nước uống chưa nấu chín bị bệnh thương hàn Người bị nhiễm Salmonella nào? Người bị nhiễm vi khuẩn Salmonella ăn thực phẩm (các loại thịt động vật, cá, tôm…), loại thực phẩm chế biến sẵn uống nước sữa bị nhiễm vi khuẩn Salmonella Thực phẩm bị nhiễm Salmonella thân thực phẩm dụng cụ dùng chế biến thực phẩm bị nhiễm Salmonella Tay người chế biến thực phẩm bị lây nhiễm từ thực phẩm nhiễm Salmonella chạm tay người chạm vào miệng sau chạm vào động vật bị nhiễm khuẩn Salmonella (gà, vịt, lợn, bò, động vật gặm nhấm lồi bị sát rắn, thằn lằn rùa) Sau Salmonella vào thể người chưa có miễn dịch, thời kỳ ủ bệnh trung bình từ 10 - 48 (đây điểm khác biệt với nhiễm độc thức ăn tụ cầu, thời gian ủ bệnh ngắn, vài, ba giờ) Bệnh thương hàn khởi phát đột ngột, sốt cao liên tục (39 400C), mệt mỏi kèm theo đau bụng, sôi bụng chướng bụng triệu chứng thường thấy Đau bụng thường xuất hố chậu phải, phân lỏng, sền sệt, màu vàng nâu, khắm, khoảng - lần/ngày Một số người lớn bị táo bón Sang tuần thứ hai có xuất phát ban nhỏ, phẳng ngực, bụng, mạn sườn Ban xuất khoảng từ - 12 ngày biến Đồng thời biểu nhiễm độc thần kinh độc tố vi khuẩn Salmonella (nhức đầu, ngủ, ác mộng, ù tai, nói ngọng) Nặng hơn, bệnh nhân tay run bắt chuồn chuồn nằm bất động, vẻ mặt thờ ơ, đờ dẫn, li bì, mê sảng, mê (thường gặp) Tuy nhiên, có số người dù bị nhiễm Salmonella thể có kháng thể, số lượng vi khuẩn độc lực vi khuẩn yếu bị rối loạn tiêu hóa vài ba ngày tự khỏi, số số trở thành người lành mang vi khuẩn, kéo dài nhiều tháng II NỘI DUNG PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN SALMONELLA THỰC PHẨM BẰNG KỸ THUẬT PHẢN ỨNG TỔNG HỢP CHUỖI THỜI GIAN( REAL-TIME POLYMERASE CHAIN REACTION) Giới thiệu Trong kỹ thuật PCR, sau hồn tất khuếch đại đoạn ADN đích, người làm thí nghiệm phải tiếp tục làm số bước thí nghiệm để đọc kết xác định có sản phẩm khuếch đại mong muốn ống phản ứng hay khơng, giai đoạn gọi giai đoạn thí nghiệm sau PCR Trong giai đoạn này, người làm thí nghiệm thực điện di sản phẩm PCR gel agarose để xem có vạch sản phẩm khuếch đại kích thước mong muốn hay khơng, thực thí nghiệm lai với đoạn dị đặc hiệu (trên màng, giếng hay phiến nhựa ) để xem sản phẩm khuếch đại có trình tự mong muốn hay khơng Kỹ thuật PCR mà cần phải có giai đoạn thí nghiệm để đọc phân tích sau hồn tất phản ứng khuếch đại, ngày hơm gọi PCR cổ điển (classical PCR) Real-time PCR kỹ thuật PCR mà kết khuếch đại ADN đích hiển thị sau chu kỳ nhiệt phản ứng, nên gọi real-time; đặc điểm nên với real-time PCR người làm thí nghiệm khơng cần thiết phải làm tiếp thí nghiệm để đọc phân tích kết để xác định có sản phẩm khuếch đại đích hay khơng kết cuối phản ứng khuếch đại hiển thị sau hoàn tất phản ứng khuếch đại Như vậy, nên nói real-time PCR kỹ thuật nhân ADN đích ống nghiệm thành hàng tỷ dựa vào chu kỳ nhiệt kết khuếch đại ống phản ứng hiển thị lúc với phản ứng khuếch đại xảy để người làm thí nghiệm thấy Nguyên tắc kỹ thuật real-time PCR dùng màu huỳnh quang chèn Nguyên tắc kỹ thuật khơng có diện sản phẩm khuếch đại PCR, chất huỳnh quang bị phân tán dung dịch PCR mix, mà tube phản ứng không bị phát huỳnh quang hay phát huỳnh quang không đáng kể bị chiếu nguồn sáng kích thích Nhưng có diện sản phẩm khuếch đại PCR màu huỳnh quang bị chèn vào tập trung sợi đôi DNA sản phẩm khuếch đại làm cho tube phản ứng bị phát huỳnh quang bị chiếu nguồn sáng kích thích Khởi thủy ethidium bromide sử dụng cho nguyên tắc real-time PCR này, sau nhà khoa học sử dụng SYBR I ưu điểm vượt trội màu huỳnh quang thấp, khả chèn vào sợi đôi cao không làm cho sợi đôi bị gắn chặt vào bị biến tính nhờ mà ảnh hưởng lên hiệu PCR Hình 1: Cơ chế hoạt động SYBR I (1) Khi chưa có sản phẩm khuếch đại ống thứ nghiệm khơng phát hùynh quang nhận ánh sáng kích thích, (2) Nhưng có diện sản phẩm khuếch đại SYBR I chèn vào tập trung phân tử DNA , làm cho ống phản ứng bị phát huỳnh quang nhân ánh sáng kích thích Với real-time PCR sử dụng SYBR I làm chất phát huỳnh quang; thiết bị real-time ghi nhận phát huỳnh quang tối đa từ ống phản ứng, nhận ánh sáng kích thích, cuối giai đoạn nhiệt độ kéo dài chu kỳ PCR Do chương trình luân nhiệt cho real-time PCR sử dụng SYBR là: chu kỳ: 40C/10’ (nếu PCR mix có dUTP UNG), chu kỳ: 95C/5’ (nếu dùng hot-start Taq polymerase1); 35-40 chu kỳ, chu kỳ luân nhiệt cho PCR gồm giai đoạn nhiệt độ: 94 C/15-30”, 55C - 65C/30-60”, 72C/30-60” Trong chu kỳ luân nhiệt PCR này, chọn lệnh để thiết bị real-time phát nguồn sáng kích thích ghi nhận ánh sáng huỳnh quang phát từ ống phản ứng giai đoạn nhiệt độ bắt cặp 55C - 65C, máy tự động thực hai chức quang học quan trọng giai đoạn cuối bước nhiệt độ bắt cặp Real-time PCR sử dụng probe làm chất phát huỳnh quang Probe dịch “đoạn dò” hay “dị”, đoạn oligonucletides sợi đơn có trình tự bắt cặp bổ sung với trình tự đặc hiệu DNA đích (trong PCR, sản phẩm khuếch đại đặc hiệu từ DNA đích) Sử dụng probe làm chất phát huỳnh quang dựa nguyên tắc có mặt sản phẩm khuếch đại đặc hiệu ống phản ứng có bắt cặp probe lên trình tự đặc hiệu sản phẩm khuếch đại, có bắt cặp có phát huỳnh quang từ ống phản ứng nhận nguồn sáng kích thích Có nhiều loại probe, chí primers sử dụng làm chất phát huỳnh quang cho real-time PCR Trong phạm vi này, chúng tơi xin trình bày kỹ số thường sử dụng Nguyên tắc kỹ thuật real-time PCR sử dụng Taqman probe Trong kỹ thuật này, realtime PCR mix thành phần PCR mix, chứa hai thành phần quan trọng để probe phát huỳnh quang có diện sản phẩm khuếch đại đặc hiệu từ DNA đích, là: (1) Taqman probe, oligonucleotides có trình tự bổ sung với trình tự đặc hiệu DNA đích, trình tự dài khoảng 24 đến 30 bases với đầu 5’ có gắn chất phát huỳnh quang (gọi reporter) đầu 3’ có gắn chất hấp phụ tương ứng (gọi quencher) để hấp phụ ánh sáng huỳnh quang phát từ reporter (2) Enzyme Taq polymerase có hoạt tính 5’-3’ exonuclease để có khả thủy giải cắt bỏ probe probe bắt cặp lên sợi khuôn cản đầu 3’ mồi enzyme kéo dài mồi tổng hợp sợi bổ sung Có thể tóm tắt sau: (1) Khi chưa có xuất sản phẩm khuếch đại đặc hiệu từ DNA đích Taqman probe cịn ngun vẹn mà huỳnh quang phát từ reporter đầu 5’ bị quencher đầu 3’ probe hấp phụ, ống thử nghiệm không phát huỳnh quang nhận nguồn sáng kích thích (2) Khi bắt đầu có xuất sản phẩm khuếch đại đặc hiệu Taqman probe bắt cặp vào sợi khn sản phẩm giai đoạn nhiệt độ bắt cặp bị enzyme Taq polymerase cắt bỏ để kéo dài mồi tổng hợp nên sợi bổ sung, mà reporter Taqman probe bị cắt rời xa quencher phát huỳnh quang nhận nguồn sáng kích thích Càng nhiều sản phẩm khuếch đại xuất số lượng reporter tự nhiều, đến lúc cường độ huỳnh quang phát từ reporter đủ mạnh máy ghi nhận tín hiệu huỳnh quang phát từ ống phản ứng nhận nguồn sáng kích thích Hình 2: Tóm tắt chế hoạt động Taqman probe real-time PCR Reporter chất gắn vào đầu 5’ Taqman probe, có khả phát huỳnh quang nhận nguồn sáng kích thích Có nhiều loại hóa chất sử dụng làm reporter Trình bày bảng hóa chất với chi tiết cần thiết độ dài sóng nguồn sáng kích thích, độ dài sóng huỳnh quang phát ra, quencher tương ứng Quencher chất có khả hấp phụ ánh sáng huỳnh quang phát từ reporter reporter nhận ánh sáng kích thích Có hai loại quencher, quencher phát huỳnh quang quencher phát nhiệt Quencher phát huỳnh quang quencher hấp phụ ánh sáng huỳnh quang từ reporter chuyển lượng hấp phụ thành ánh sáng, quencher phát huỳnh quang khơng đến CCD hay cảm biến quang bị cản lại kính lọc dành cho ánh sáng huỳnh quang phát từ reporter Chương trình luân nhiệt real-time PCR dùng Taqman probe thường có hai giai đoạn nhiệt độ là: biến tính 94 – 95C 15 – 30 giây, kế giai đoạn vừa bắt cặp vừa kéo dài 60C 30-60 giây thiết bị real-time hoạt động giai đoạn Ở giai đoạn nhiệt độ 60C Taqman probe bắt cặp vào sợi đích trước nhiệt độ bắt cặp tối hảo Taqman probe (thấp Tm Taqman probe 65 – 70C, hay cao Tm mồi 55C- 60C sau mồi bắt cặp vào Chính nhờ mà Taq polymerase tổng hợp sợi bổ sung, enzyme có hội thủy giải Taqman probe cản đầu Nếu mồi bắt cặp trước vào sợi đích khơng có hội để Taqman probe bắt cặp vào sợi đích Taqman probe bị thủy giải enzyme Taq polymerase tổng hợp sợi bổ sung Đây lý giải thích phải thiết kế mồi có Tm khoảng 55-60C thấp Tm Taqman probe 5C - 10C Phạm vi áp dụng Phương pháp áp dụng để phát vi sinh vật gây bệnh từ thực phẩm mẫu môi trường mẫu thức ăn chăn nuôi Nguyên tắc chung Việc kiểm tra bao gồm bước liên tiếp sau đây: 1) Làm giàu vi sinh vật ban đầu vi sinh vật gây bệnh từ mẫu thử; 2) Tách chiết axit nucleic tinh sạch; 3) Khuếch đại trình tự axit nucleic real-time PCR sử dụng mồi đặc hiệu; 4) Phát sản phẩm real-time PCR đặc hiệu Các bước tiến hình 4.1 Thiết bị dụng cụ 10 - Cân điện tử - Máy dập mẫu - Tủ ủ - Máy ly tâm - Máy lắc - Thiết bị Real-time PCR - Micro-pippet 1000, 200, 20 µL - Tip micro-pippet - Ống ly tâm mL, 100 µL - Túi dập mẫu - Ống nghiệm - Kéo, kẹp 4.2 Môi trường hóa chất -Canh Peptone water - Nước cất - Nước muối sinh lý (NaCl 0.9%) - KIT Realtime PCR định danh Salmonella – One cup Salmonella 4.3 Mẫu - Tơm mua ngồi chợ loại bỏ vỏ đầu đuôi 4.4 Các bước tiến hành 4.4.1 Tiền tăng sinh - Cân 10 gram mẫu (thịt tôm) đồng hóa với 90 mL pepton water phút - Ủ mẫu (thịt tơm) đồng hóa 372 C vịng 18-24 4.4.2 Ly trích AND - Bước 1: Lấy mL dịch mẫu tiền tăng sinh vào ống ly tâm mL - Bước 2: Ly tâm ống dịch mẫu tốc độ 12,000 rpm phút 25 C - Bước 3: Loại bỏ phần dịch, giữ lại phần lắng ống ly tâm - Bước 4: Hút mL NaCl 0.85% vào ống ly tâm, lắc để rửa tế bào vi khuẩn - Bước 5: Ly tâm ống mẫu tốc độ 12,000 rpm phút 25 C - Bước 6: Loại bỏ phần dịch, giữ lại phần lắng ống ly tâm - Bước 7: Hịa tan phần lắng với 100 µL nước cất tiệt trùng - Bước 8: Ủ ống mẫu 100 C 15 phút - Bước 9: Ly tâm ống mẫu tốc độ 12,000 rpm phút C - Bước 10: Hút phần dịch sang ống ly tâm (Dịch ADN) 4.4.3 Chuẩn bị phản ứng Real-time PCR - Bước 1: Hút 20 µL Master Mix vào ống ly tâm 100 µL - Bước 2: Lần lượt hút µL Chứng dương, Chứng âm ADN trích ly vào ống có chứa Master Mix - Bước 3: Thiết lập chương trình chạy phản ứng Real-time PCR 11 - Bước 4: Bắt đầu chương trình quan sát kết 4.4.4 Cách đọc kết Biểu đồ khuếch đại real-time PCR Trong real-time PCR, hiển thị để người làm thí nghiệm quan sát trình nhân ADN ống phản ứng biểu đồ khuếch đại (amplification graph) Biểu đồ có trục tung (Y) cường độ huỳnh quang phát từ ống phản ứng nhận ánh sáng kích thích, cịn trục hồnh (X) chu kỳ nhiệt Trên biểu đồ khuếch đại (Hình 2), người làm thí nghiệm thấy ống phản ứng Cường độ huỳnh quang mà máy ghi nhận chu kỳ đầu thấp không thay đổi, hiển thị đường thẳng nằm ngang, gọi “giai đoạn ủ” hay “giai đoạn tiềm phục”, giai đoạn dù ADN đích nhân thành số lượng chưa đủ để giúp cho chất phát huỳnh quang nhận ánh sáng kích thích phát ánh sáng huỳnh quang đủ cường độ để máy ghi nhận Nhưng số lượng ADN đích đạt đến ngưỡng định ánh sáng huỳnh quang phát đủ cường độ để máy ghi nhận lúc thấy đường biểu diễn khuếch đại bắt đầu ngóc lên Cường độ huỳnh quang ống phản ứng từ lúc trở tăng gấp đôi sau chu kỳ nhiệt số lượng ADN đích tăng gấp đôi sau chu kỳ Chúng ta gọi giai đoạn “giai đoạn lũy thừa” cường độ huỳnh quang, giai đoạn tăng trưởng lũy thừa số lượng ADN đích Cường độ huỳnh quang ống phản ứng tăng trưởng đến mức độ tăng trưởng chậm dần đạt đến bình nguyên ADN đích, phản ứng cạn dần dNTP enzyme Taq polymerase không hoạt động hiệu nữa, nên khơng cịn gia tăng số lượng theo cấp số Chúng ta gọi giai đoạn “giai đoạn bình nguyên” 12 Hình 2: Biểu đồ đường biểu diễn khuếch đại ghi nhận cường độ huỳnh quang phát từ ống phản ứng nhận ánh sánh kích thích vào chu kỳ nhiệt Phân tích đường biểu diễn khuếch đại (amplification curve) ống phản ứng sau hoàn tất chu kỳ nhiệt, thấy thông số quan trọng ln kèm với nó, chu kỳ ngưỡng (Ct, threshold cycle) Chu kỳ ngưỡng hay Ct chu kỳ nhiệt mà thời điểm thiết bị real-time ghi nhận tín hiệu huỳnh quang phát từ ống phản ứng bắt đầu vượt qua cường độ huỳnh quang Để xác định cường độ huỳnh quang nền, thiết bị real-time thường ghi nhận cường độ tín hiệu huỳnh quang xuất ống phản ứng số chu kỳ đầu, gọi chu kỳ (basal cycle), lấy trung bình cộng cường độ huỳnh quang làm cường độ huỳnh quang Đường cắt ngang qua cường độ huỳnh quang gọi đường (base line) Chu kỳ ngưỡng trị số xác định số chu kỳ mà đường cắt đường biển diễn khuếch đại Do 13 tính tốn nên chu kỳ ngưỡng thường số lẻ (ví dụ: Ct = 28.35) số chẵn Có ống phản ứng có Ct sớm có ống phản ứng có Ct xuất muộn hơn, số lượng DNA đích ban đầu (starting quantity, Sq) có ống phản ứng nhiều hay Nếu ống phản ứng số lượng DNA đích nhiều cần chu kỳ nhiệt để đạt đến số lượng đủ để ống phản ứng cho tín hiệu huỳnh quang mà máy ghi nhận được, cịn số lượng DNA đích cần nhiều chu kỳ nhiệt hơn, Ct xuất muộn III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Kết Từ thực nghiệm phân tích phát Salmonella mẫu tôm kỹ thuật phản ứng tổng hợp chuỗi thời gian cho kết sau: 14 Hình 1: Biểu đồ mẫu đối chứng dương khuếch đại ghi nhận cường độ huỳnh quang phát từ ống phản ứng nhận ánh sánh kích thích vào chu kỳ nhiệt 15 Hình 2: Biểu đồ mẫu đối chứng âm khuếch đại ghi nhận cường độ huỳnh quang phát từ ống phản ứng nhận ánh sánh kích thích vào chu kỳ nhiệt 16 Hình 3: Biểu đồ mẫu thực phẩm Tơm khuếch đại ghi nhận cường độ huỳnh quang phát từ ống phản ứng nhận ánh sánh kích thích vào chu kỳ nhiệt Từ hình 3: ta thấy Sau 06 phút thực phản ứng RT PCR, đường biểu khuếch đại tương đương mẫu chứng (-) nên mẫu xác định âm tính với Salmonella Kết luận: a) Mẫu TP3 không phát vi khuẩn Salmonella - Có thể mẫu khơng có vi khuẩn Salmonella 17 b) Mẫu TP3 có vi khuẩn Salmonella số nguyên nhân nên cho kết âm tính giả: - Một số thao tác chưa chưa chuẩn trình chuẩn bị thực phản ứng RT PCR - Do trình hút DNA trích ly thao tác sai lượng hút nhỏ dẫn đến DNA - Trong ống phản ứng có tồn chất ức chế (nguyên nhân ngồi DNA tách chiết,trong dung dịch DNA cịn có lẫn số thành phần canh thang tế bào thực phẩm) - Hiệu suất hồi DNA thấp dung dịch lẫn protein, acid amin, xác tế bào trình hút rửa dịch DNA - Do nồng độ AND nên chu kì ngưỡng phải dài cần nhiều thời gian phản ứng dương tính, cho chu kì lắp lại nhiều khoảng chu kì dễ dàng quan sát kết rỏ để 45 chu kì 18 Hình 4: Biểu đồ mẫu vi khuẩn khuếch đại ghi nhận cường độ huỳnh quang phát từ ống phản ứng nhận ánh sánh kích thích vào chu kỳ nhiệt Từ hình 4: ta thấy Sau 06 phút thực phản ứng RT PCR, đường biểu khuếch đại tương đương mẫu chứng (-) nên mẫu xác định âm tính với Salmonella Kết luận: a) Mẫu VK3 vi khuẩn Salmonella (khả cao) b) Mẫu VK3 vi khuẩn Salmonella số nguyên nhân nên cho kết âm tính giả: 19 - Hiệu suất thu hồi DNA thấp Nhận xét chung: từ kết hình 3, hình cho thấy chu kì đầu thấp không thay đổi, hiển thị đường thẳng nằm ngang giai đoạn ADN đích nhân thành số lượng chưa đủ giúp cho chất phát huỳnh quang nhận Chu kì ngưỡng mẫu thực phẩm tơm vi khuẩn Salmonella nhiều so với chu kì chứng dương nồng độ ADN chứng dương nhiều so với nồng độ ADN mẫu thực phẩm vi khuẩn Thảo luận Salmonella nhiễm vào tơm thơng qua q trình sau: Trong tự nhiên: Salmonella nhiễm vào tơm thơng qua q trình ni tơm từ nguồn nước, thức ăn cho tôm Nhiễm thu hoạch tôm thông qua dụng cụ lưới, đựng chứa, vận chuyển, bảo quản Nhiễm q trình thao tác thơng qua việc sử dụng dụng cụ chế biến sai quy tắc, điều kiện mơi trường bn bán tơm Trong phân tích: Có thể nhiễm từ nhiều nguồn dụng cụ trước sử dụng lúc thao tác thí nghiệm (ống nghiệm, kéo, kẹp, pippet, enpendod), môi trường điều kiện thực thí nghiệm, thao tác thực hành (đóng- mở enpedod, hút dịch mẫu, đèn cồn), pippet bị nhiễm từ trước sử dụng lúc thao tác Salmonella nhiễm mẫu Trong lúc thao tác để dụng cụ ống nghiệm, kéo, kẹp, xa đèn cồn quên hơ qua cồn Nước peptone đệm (BPW) nước giúp làm giàu loài Salmonella bị tổn thương từ thực phẩm trước chọn lọc phân lập Thành phần pepton water chứa Peptone 10g/l, Sodium chloride 5g/l, Final pH (at 25°C) 7.2±0.2g/l (nguồn internet https://himedialabs.com/TD/M614.pdf) Thành phần buffered pepton water gồm proteose peptone 10g/l, Sodium chloride 5g/l, Disodium phosphate anhydrous 3.5g/l, Potassium hydrogen phosphate 1.5g/l, Final pH (at 25°C) 7.2±0.2g/l Công thức điều chỉnh, chuẩn hóa cho phù hợp với thông số hiệu suất (nguồn internet https://himedialabs.com/TD/M028.pdf) 20 Sử dụng pepton water thay cho buffered pepton water khả phục hồi tăng trưởng số lượng Salmonella bị thương pepton water cao hơn, peptone water tạo độ pH hệ thống tăng trưởng chống lại thay đổi pH tăng trưởng chuyển hóa vi sinh vật q trình làm giàu vi sinh vật ban đầu áp dụng cho mẫu thực phẩm Peptone water cung cấp hợp chất nitơ carbonat, axit amin chuỗi dài, vitamin cung cấp chất dinh dưỡng thiết yếu Natri clorua trì cân thẩm thấu mơi trường (nguồn https://himedialabs.com/TD/M028.pdf) Tạo nguồn DNA Salmonella nhiều hơn, giúp cho q trình trích ly DNA ban đầu tốt hơn, rút ngắn chu kì phản ứng, cho kết tối ưu Trong ống PCR có nhiều thành phần khác nhau, thành phần có chức định phản ứng, gồm có DNA mẫu, cặp primer, enzyme taq polymerase, dNTP, nước cất, Mg2+ , real-time PCR có thêm probe (mồi nhữ huỳnh quang) Taq polymerase enzyme xúc tác cho tổng hợp phân tử DNA từ deoxy ribonucleotide cách sử dụng chuỗi DNA bù mồi DNA mẫu, đoạn DNA mục tiêu cần khuếch đại, đặc trưng cho loài vi sinh vật mục tiêu gen quy định việc tổng hợp loại độc tố chuyên biệt vi sinh vật Mg2+ tạo phức với dNTP để gắn dNTP với enzyme, kích thích hoạt tính enzyme polymerase, tăng Tm DNA tương hỗ primer/template Primer đoạn mồi hỗ trợ trình khuếch đại DNA dNTP gắn vào enzyme Probe đoạn oligonucleotides sợi đơn có trình tự bắt cặp bổ sung với trình tự đặc hiệu DNA đích Nước dùng thí nghiệm: Nước cất lần nước khử ion DI Water Nước khử ion (DI Water): loại nước điều chế phương pháp chưng cất, trao đổi ion, thẩm thấu ngược hay EDI, thành phần nước cất không chứa tạp, loại bỏ tất khống chất muối ion hóa (cả hữu vô cơ) khỏi dung dịch thông qua trình trao đổi ion Bởi hầu hết tạp chất nước muối hòa tan, khử ion tạora loại nước có độ tinh khiết cao Nước Cất: loại nước loại bỏ tạp chất bẩn thơng qua q trình cất nước Nước thu ngưng tụ nước từ nước sôi làm lạnh 21 Tuy nhiên, chất bẩn nước mà có nồng độ thấp có nhiệt độ sơi tương tự nước bị lẫn với nước tinh khiết Do đó, điều quan trọng phải có nguồn nước tinh khiết tốt hơn, đáng tin cậy nước cất Trong q trình thí nghiệm sử dụng nước cất lần làm kết thí nghiệm bị sai lệch nguồn nước sử dụng để pha chế, chuẩn hóa nồng độ dung dịch, tráng rửa dụng cụ thí nghiệm phải nguồn nước cất chất lượng, siêu đạt tiêu chuẩn cho loại thí nghiệm Đối với máy PCR real time nguồn nước dùng cho phản ứng thí nghiệm phải dùng nước DI water cần độ tinh khiết cao (pH=6,0-8,0), độ dẫn điện thấp (5µs/cm), hàm lượng kim loại nặng thấp khơng ảnh hưởng đến nồng độ thành phần kết mẫu, hàm lượng kim loại nặng nước thấp tránh hư hỏng thiết bị Ly tâm nhiệt độ 25oC, nhiệt độ giúp vi khuẩn tiếp tục phát triển Ly tâm nhiệt độ 4oC, giúp kéo dài thời gian bảo quản DNA (Phương, L Q (2006) KẾT LUẬN Mẫu tơm cho kết dương tính có diện Salmonella, mẫu vi khuẩn cho kết âm tính khơng phải Salmonella, nồng độ ADN mẫu cao làm ức chế phản ứng cho kết âm tính TÀI LIỆU THAM KHẢO Phương, L Q (2006) Sản xuất kit tách chiết DNA kit PCR phát gen halothan heo (Doctoral dissertation, Luận văn Kỹ sư Công nghệ sinh học, Trường Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh) https://himedialabs.com/TD/M028.pdf https://himedialabs.com/TD/M614.pdf 22 ... tháng II NỘI DUNG PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN SALMONELLA THỰC PHẨM BẰNG KỸ THUẬT PHẢN ỨNG TỔNG HỢP CHUỖI THỜI GIAN( REAL-TIME POLYMERASE CHAIN REACTION) Giới thiệu Trong kỹ thuật PCR, sau hoàn tất khuếch... ĐẶT VẤN ĐỀ II NỘI DUNG PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN SALMONELLA THỰC PHẨM BẰNG KỸ THUẬT PHẢN ỨNG TỔNG HỢP CHUỖI THỜI GIAN( REAL-TIME POLYMERASE CHAIN REACTION) Giới thiệu ... Salmonella mẫu tôm kỹ thuật phản ứng tổng hợp chuỗi thời gian cho kết sau: 14 Hình 1: Biểu đồ mẫu đối chứng dương khuếch đại ghi nhận cường độ huỳnh quang phát từ ống phản ứng nhận ánh sánh kích