Đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ trên mô hình gây sa sút trí nhớ bằng scobolamin của cao chiết giàu alcaloid từ cây thạch tùng răng cưa (HUPERZIA SERRATA (THUNB ) TREVIS )

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC NGUYỄN THỊ THÙY ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CẢI THIỆN TRÍ NHỚ TRÊN MƠ HÌNH GÂY SA SÚT TRÍ NHỚ BẰNG SCOPOLAMIN CỦA CAO CHIẾT GIÀU ALCALOID TỪ CÂY THẠCH TÙNG RĂNG CƯA (HUPERZIA SERRATA (THUNB.) TREVIS.) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Khóa: QH.2015.Y Hà Nội – 2020 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC Người thực hiện: NGUYỄN THỊ THÙY ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CẢI THIỆN TRÍ NHỚ TRÊN MƠ HÌNH GÂY SA SÚT TRÍ NHỚ BẰNG SCOPOLAMIN CỦA CAO CHIẾT GIÀU ALCALOID TỪ CÂY THẠCH TÙNG RĂNG CƯA (HUPERZIA SERRATA (THUNB.) TREVIS.) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC (NGÀNH DƯỢC HỌC) Khóa: QH.2015.Y Người hướng dẫn: ThS Đặng Kim Thu ThS Bùi Sơn Nhật Hà Nội – 2020 LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, tơi xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới hai giảng viên hướng dẫn ThS Đặng Kim Thu Th.S Bùi Sơn Nhật - giảng viên Bộ môn Dược lý Dược lâm sàng, Khoa Y – Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội đưa lời khun hữu ích, ln lắng nghe, động viên dẫn dắt bước chân đường thực đề tài Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS TS Bùi Thanh Tùng thầy cô thuộc môn Dược lý – Dược lâm sàng, Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội chia sẻ học kinh nghiệm quý báu, nhiệt tình giúp đỡ động viên Tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn tới DS Nguyễn Thị Thu Hoài – Học viên cao học khóa 22, đại học Dược Hà Nội bên nhiệt tình giúp đỡ tơi suốt thời gian làm đề tài Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới thầy cô Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội nhiệt tình bảo, quan tâm truyền dạy cho tơi kiến thức q báu suốt năm học tập khoa tạo điều kiện tốt cho thực trọn vẹn đề tài Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, người thân bạn bè động viên sát cánh bên tơi vượt qua khó khăn qng thời gian cịn ngồi ghế nhà trường Tơi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 21 tháng năm 2020 Sinh viên Nguyễn Thị Thùy DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT A Độ hấp thụ (Absorbance) A Amyloid beta ACh Acetylcholin AChE Enzym Acetylcholinesterase ACTI Acetylthiocholin iodid APP Protein tiền thân amyloid (Amyloid Precursor Protein) DL-30 Cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng cưa liều 30 mg/kg cân nặng DL-60 Cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng cưa liều 60 mg/kg cân nặng FDA Cục quản lý Thực phẩm Dược phẩm Hoa Kỳ (Food and Drug Administration) HFD Chế độ ăn giàu chất béo (High fat diet) Hup A Huperzin A IC50 Nồng độ ức chế 50% (Inhibitory Concentration 50%) IU Đơn vị quốc tế (International Unit) MDA Malondialdehyd NMDA Thụ thể N-methyl-D-aspartat LD50 Liều dùng gây chết 50% số động vật thử nghiệm OBX Chuột vùng khứu giác (Olfactory bulbectomized) SAM Chuột tăng tốc lão hóa SAMP Chuột tăng tốc lão hóa nhạy cảm SE Sai số chuẩn (Standard errror) UV-Vis Quang phổ tử ngoại khả kiến DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.2.1 Các hợp chất alcaloid Thạch tùng cưa Bảng 2.4.1 Thành phần hỗn hợp phản ứng 28 Bảng 3.1.1 Kết đánh giá khả ức chế enzym AChE in vitro cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng cưa chất chuẩn donepezil 29 Bảng 3.1.2 Giá trị IC50 cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng cưa chất chuẩn quercetin 30 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.2.1 Cấu trúc hóa học Hup A Hình 2.1.1 Cây Thạch tùng cưa Huperzia serrata (Thunb.) Trevis .17 Hình 2.1.2 Phương pháp chiết alcaloid dung môi hữu môi trường kiềm 18 Hình 2.3.1 Sơ đồ nội dung nghiên cứu 20 Hình 2.4.1 Phản ứng chất hỗn hợp phản ứng Ellman 21 Hình 2.4.2 Sơ đồ triển khai mơ hình gây sa sút trí nhớ scopolamin in vivo 24 Hình 3.2.1 Ảnh hưởng cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng cưa đến tỷ lệ chuyển tiếp cánh 31 Hình 3.2.2 Ảnh hưởng cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng cưa đến thời gian tìm thấy bến đỗ tập có bến đỗ 32 Hình 3.2.3 Ảnh hưởng cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng cưa tới thời gian lưu góc phần tư có bến đỗ tập khơng có bến đỗ .34 Hình 3.2.4 Ảnh hưởng cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng cưa đến hoạt độ AChE thể đồng não chuột 35 Hình 3.2.5 Ảnh hưởng cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng cưa đến hàm lượng malondialdehyd (MDA) mô não 36 MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chương - TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan bệnh 1.1.1 Khái niệm bệnh sa sút trí nhớ 1.1.2 Các thể sa sút trí nhớ chế bệnh sinh 1.1.3 Các thuốc điều trị bệnh sa sút trí nhớ 1.2 Tổng quan Thạch tùng cưa 1.2.1 Đặc điểm thực vật 1.2.2 Phân bố 1.2.3 Thành phần hóa học 1.2.4 Tác dụng dược lý .9 1.2.5 Các nghiên cứu tác dụng cải thiện trí nhớ Thạch tùng cưa 1.3 1.3.1 1.3.2 1.3.3 1.3.4 Một số mơ hình nghiên cứu tác dụng tăng cường trí nhớ 11 Các mơ hình động gây sa sút trí nhớ động vật thử nghiệm .11 Một số thử nghiệm hành vi đánh giá tác dụng tăng cường trí nhớ in vivo 13 Một số phương pháp đánh giá tác dụng ức chế AChE .14 Một số phương pháp đánh giá khả chống oxy hóa 15 Chương - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 Đối tượng nghiên cứu 17 2.1.1 Dược liệu nghiên cứu 17 2.1.2 Mẫu nghiên cứu 17 2.2 Phương tiện nghiên cứu 18 2.2.1 Động vật thí nghiệm 18 1.2.2 Hóa chất, dung mơi 18 1.2.3 Thiết bị, dụng cụ 19 2.3 2.4 Nội dung nghiên cứu 19 Phương pháp nghiên cứu 20 2.4.1 Phương pháp đánh giá tác dụng ức chế AChE chống oxy hóa in vitro 20 2.4.2 Phương pháp đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng cưa mơ hình gây sa sút trí nhớ scopolamin 23 2.5 Phương pháp xử lý số liệu 28 Chương – KẾT QUẢ 29 3.1 Kết đánh giá tác dụng ức chế AChE khả dọn gốc tự in vitro cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng cưa 29 3.1.1 Kết đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE in vitro 29 3.1.2 Kết đánh giá khả dọn gốc tự DPPH in vitro 30 3.2 Kết đánh giá tác dụng tăng cường trí nhớ cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng cưa mơ hình gây sa sút trí nhớ scopolamin 31 3.2.1 Kết đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ in vivo thơng qua thử nghiệm mê lộ Y 31 3.2.2 Kết đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ in vivo thông qua thử nghiệm mê lộ nước Morris 32 3.2.3 Ảnh hưởng cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng cưa đến hoạt độ AChE não 34 3.2.4 Ảnh hưởng cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng cưa đến hàm lượng malondialdehyd (MDA) mô não 36 Chương – BÀN LUẬN 38 4.1 Về kết đánh giá tác dụng ức chế enzym AchE chống oxy hóa in vitro cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng cưa 38 4.1.1 Về kết đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE in vitro .38 4.1.2 Về kết đánh giá khả dọn gốc tự in vitro 39 4.2 Về kết đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ mơ hình gây sa sút trí nhớ scopolamin cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng cưa 40 4.2.1 Về kết thử nghiệm hành vi 40 4.2.2 Về kết định lượng marker sinh học 42 Chương – KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC MỞ ĐẦU Xã hội ngày phát triển, áp lực sống ngày tăng cao Con người bị ảnh hưởng môi trường xuất vấn đề sức khỏe Ngồi nhóm bệnh phổ biến bệnh tim mạch ung thư, sa sút trí nhớ bệnh lý mà nhiều người mắc phải Sa sút trí nhớ nhóm rối loạn đặc trưng suy giảm trí nhớ nhận thức, có ảnh hưởng đến hoạt động sống hàng ngày hoạt động xã hội người bệnh Trên giới, số lượng người mắc sa sút trí nhớ ngày tăng cao với khoảng 50 triệu người mắc có gần 10 triệu ca mắc năm [47] Sa sút trí nhớ bệnh có tác động lớn đến kinh tế Chi phí dành cho chăm sóc điều trị cho bệnh nhân sa sút trí nhớ hàng năm giới ước tính khoảng 800 tỷ USD (tương đương 1% GDP toàn cầu) đạt tới 2000 tỷ USD vào năm 2030 [47] Sa sút trí nhớ bệnh lý phổ biến thường gặp người cao tuổi Bệnh diễn biến từ từ tăng dần, suy giảm dần khả nhận thức, trí tuệ, dẫn đến dần khả sinh hoạt độc lập thường tử vong mắc phải bệnh nhiễm trùng, tiết niệu Mặc dù sa sút trí nhớ có tác động lớn đến sức khỏe người cao tuổi có xu hướng ngày gia tăng việc điều trị lại gặp nhiều khó khăn hiểu biết bệnh cịn hạn chế việc lựa chọn thuốc điều trị bị giới hạn Những thuốc dùng điều trị sa sút trí nhớ gồm nhóm thuốc ức chế cholinesterase thuốc đối kháng thụ thể N-methyl-D-aspartat (NMDA) Các thuốc kể cho thấy tác dụng kiểm sốt triệu chứng tốt khơng làm thay đổi diễn tiến bệnh Ngoài ra, giá thành tương đối cao tác dụng phụ không mong muốn nhược điểm thuốc Do đó, việc tiếp tục nghiên cứu tìm loại thuốc hiệu an toàn điều trị sa sút trí nhớ Alzheimer cần thiết Thạch tùng cưa (Huperzia serrata (Thunb.) Trevis.) dược liệu dùng để điều trị bệnh sa sút trí nhớ Trung Quốc Trong dược liệu, Huperzin A (Hup A) hợp chất alcaloid bật có tác dụng cải thiện trí nhớ [50,61] Tuy nhiên, nước ta có số nghiên cứu dược lý cao chiết cồn Thạch tùng cưa chưa có nghiên cứu thực đối tượng nghiên cứu cao chiết alcaloid Vì vậy, nghiên cứu tiến hành nhằm mục đích đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng cưa theo mục tiêu sau: chưa có nghiên cứu đánh giá khả dọn gốc tự DPPH in vitro cao chiết toàn phần, phân đoạn chiết hay cao chiết giàu alcaloid Thạch tùng cưa nên bàn luận thêm Từ kết thử nghiệm đánh giá tác dụng ức chế AChE khả dọn gốc tự DPPH in vitro, đánh giá cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng cưa có tiềm cải thiện trí nhớ động vật thử nghiệm 4.2 Về kết đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ mơ hình gây sa sút trí nhớ scopolamin cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng cưa Gỉa thuyết cholinergic cho giảm sút chất dẫn truyền thần kinh hệ cholinergic suy yếu thụ thể nicotinic muscarinic gây suy giảm khả nhớ nhận thức [17] Các mơ hình sa sút trí nhớ sử dụng chất đối kháng hệ cholinergic để làm giảm lượng chất dẫn truyền thần kinh Một số chất scopolamin Scopolamin chất đối kháng với chất dẫn truyền thần kinh acetylcholin, gây giảm trí nhớ nhận thức chuột [65] Đề tài sử dụng mơ hình gây sa sút trí nhớ scopolamin khơng địi hỏi khắt khe điều kiện vật chất kỹ thuật, đồng thời có độ lặp lại tỷ lệ sống sót cao nên lựa chọn để thực thử nghiệm Chuột tiêm scopolamin liều mg/kg thử nghiệm mê lộ chữ Y tiêm scopolamin liều mg/kg thử nghiệm mê lộ nước Morris Trong thời gian tiến hành thử nghiệm đánh giá trí nhớ khả nhận thức chuột, yếu tố ánh sáng, nhiệt độ, tiếng ồn, kiểm sốt để đảm bảo khơng gây ảnh hưởng đến kết thực nghiệm Tất thử nghiệm thực pha tối động vật thử nghiệm để phù hợp với đặc tính hoạt động vào ban đêm loài gặm nhấm 4.2.1 Về kết thử nghiệm hành vi 4.2.1.1 Về kết thử nghiệm mê lộ chữ Y Thử nghiệm mê lộ chữ Y thử nghiệm đơn giản ứng dụng để đánh giá trí nhớ khơng gian ngắn hạn dựa vào hành vi thích khám phá chuột Thử nghiệm có ưu điểm bật thực dễ dàng, yêu cầu trang thiết bị tiết kiệm Thông số đánh giá tỷ lệ chuyển tiếp Chuột coi có trí nhớ tốt tăng tỷ lệ chuyển tiếp ngược lại Kết thử nghiệm cho thấy chuột thuộc nhóm chứng bệnh có tỷ lệ thay đổi chuyển tiếp giảm 21,78% so với nhóm chứng sinh lý (p