Nghiên cứu quá trình tách chiết và tinh sạch protein trong rong bún enteromorpha spp ​

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP.HCM KHOA MÔI TRƯỜNG & CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH TÁCH CHIẾT VÀ TINH SẠCH PROTEIN TRONG RONG BÚN ENTEROMORPHA SPP NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC GVHD: PGS.TS NGUYỄN TIẾN THẮNG CN ĐỖ THỊ TUYẾN SVTH: TRẦN LƯƠNG HỒNG YẾN MSSV: 0851110311 Tp Hồ Chí Minh, năm 2012 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Protein hợp chất hữu có ý nghĩa quan trọng bậc thể sống, mặt số lượng, protein chiếm không 50 % trọng lượng khô tế bào, thành phần cấu trúc, protein tạo thành chủ yếu từ amino acid vốn nối với liên kết peptide Đối với động vật thủy sản nhu cầu protein cao so với động vật cạn Hàm lượng protein thức ăn thuỷ sản khoảng từ 18 - 20 % tôm biển, 28 - 32 % cho cá da trơn, 22 - 30 % cá rô phi, 38 - 40 % cá hồi vân Protein chất dinh dưỡng thiết yếu việc trì hoạt động sống, trao đổi chất thể, tăng trưởng chứa quan trọng khác Tuy nhiên 20 loại acid amin có 10 loại acid amin khơng thay mà động vật thủy sản (ĐVTS) khơng có khả tự tổng hợp Bên cạnh protein nguồn dinh dưỡng có giá thành cao phần thức ăn thủy sản Nước ta phải nhập 20 % nguyên liệu giàu lượng, 80 % loại thức ăn bổ sung, 80 - 90 % thức ăn giàu đạm 90 % chất phụ gia Vì cần tìm nguồn nguyên liệu vừa rẽ tiền vừa đáp ứng nhu cầu protein đặc biệt thành phần acid amin (AA) không thay Việt Nam nằm khu vực khí hậu nhiệt đới cận nhiệt đới, với chiều dài bờ biển 3.260 km có nhiều nhánh sơng, vùng triều, vùng vịnh, đậm phá…đây điều kiện thuận lợi cho phát triển đa dạng sinh vật biển Một lồi góp phần vào đa dạng rong biển Có đến 800 lồi rong biển xác định Việt Nam Trong nhiều chi có sản lượng tự nhiên lớn Sargassum, Hormophysa, Hydroclathrus (Rong Nâu); Gracilaria, Hydropuntia, Hypnea (Rong Đỏ); Ulva, Chaetomorpha, Cladophora (Rong Lục) số lồi khác ni trồng ao đìa, vịnh, bãi triều ven biển Ước tính diện tích mặt nước có tiềm ni trồng khai thác rong biển thời kỳ 2010 - 2015 900.000 với sản lượng 600 – 700.000 khô / năm Nhiều lồi có giá trị kinh tế cao, khoảng 121 loài người dân ven biển khai thác Trong có 65 Trang ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP loài dùng làm thực phẩm 56 loài dùng công nghiệp chế biến sản xuất chất như: agar, carrageenan, alginat… Ngành rong lục (Chlorophyta) xem ngành lớn, có nhiều lồi, đến toàn giới biết khoảng 500 chi 8.000 loài Phần lớn chúng sống nước gần 90 %, lại biển đại dương khoảng 10 % Trong biển đại dương giới biết 948 loài thuộc 112 chi, 18 họ Ở nước ta, hầu hết loài thuộc Ulvales, Siphonales, sống biển, hải đảo, vùng cửa sông đầm, phá nước lợ ven biển Trong nước giới có nhiều cơng trình nghiên cứu rong biển công bố, sản phẩm cơng trình tạo đường lên men (ethanol n - butanol phụ gia nguyên liệu cao cấp) Bên cạnh việc phục vụ cho mục tiêu sản xuất ethanol butanol, rong biển dùng để tách protein từ sinh khối có khả sử dụng làm thức ăn thương mại cho tơm cá Trong Enteromorpha spp có chứa khoảng 15 - 20 % protein thành phần với tỷ lệ AA thiết yếu giống với nhu cầu AA tôm sú Việc sản xuất thành công sản phẩm protein thực vật từ rong Enteromorpha spp để sử dụng thức ăn gia súc góp phần đa dạng hóa sản phẩm nơng nghiệp, giảm phụ thuộc vào nhập khẩu, giảm chi phí chăn ni cho nơng dân tăng tính cạnh tranh cho doanh nghiệp Việc sử dụng rong biển làm thức ăn gia súc giải phần khó khăn ngun liệu đầu vào ngành chăn ni mà cịn làm giảm thiểu nguy ô nhiễm môi trường đặc tính sinh học rong biển Với lý trên, nước ta việc thu nhận nguồn lợi từ rong biển có ý nghĩa to lớn khoa học thực tiễn, đặc biệt protein từ rong biển Enteromorpha spp Do cần nghiên cứu để tiến tới sản xuất protein quy mô công nghiệp phù hợp với kinh tế quốc dân 1.2 Tình hình nghiên cứu rong biển 1.2.1 Tình hình nghiên cứu rong biển giới Trang ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Nhiều cơng trình nghiên cứu rong biển thực khía cạnh đa dạng sinh học, nguồn lợi chế biến, nuôi trồng tạo giống rong biển Các nghiên cứu cho kết tốt việc khai thác sử dụng tiềm loài thực vật thủy sinh quan trọng Các tác giả Brzeski (1997), Chopin et al (2001) Neori et al (2004) cho xu hướng tiến tới quản lý nuôi thủy sản tốt hơn, việc kết hợp ni lồi thủy sản có cho ăn (tơm, cá) với ni lồi thủy sản hấp thụ dinh dưỡng hữu vô (rong biển, động vật hai vỏ), cách tiếp cận hệ sinh thái quan trọng giúp tái sử dụng dinh dưỡng, có lợi chung cho đối tượng ni trồng, đa dạng hóa nguồn thu nhập từ nhiều đối tượng Nghiên cứu Amir Neori (2007) xác nhận việc nuôi rong biển hệ thống ao nuôi kết hợp với thủy sản mơ hình quan trọng cho phát triển bền vững vùng ven bờ [20] Theo Elizabeth (2008), nuôi kết hợp rong tôm làm tăng suất chất lượng tôm nuôi Theo Akiko Isa et al., 2009 “Rong biển nghiên cứu sử dụng thực phẩm, công nghiệp dược phẩm nhiều nước giới Các thành phần chiết xuất từ rong có giá trị sinh học beta caroten, chất chống oxy hóa nhiều nhà khoa học quan tâm Rong biển giàu protein khống chất, tận dụng để sử dụng thực phẩm thức ăn gia súc” 1.2.2 Tình hình nghiên cứu nước Đối với loài rong Bún (Enteromorpha spp.và Ulva) nghiên cứu sinh hóa tiềm ứng dụng chúng thực nhóm nghiên cứu Viện Sinh Học Nhiệt Đới khuôn khổ dự án FSPS II/SUDA 3.3.4 năm 2009 (do DANIDA tài trợ) Các loài rong mọc tự nhiên nhiều ao nuôi tôm nước lợ quãng canh, người nuôi tôm thích diện rong ao ni tơm so với lồi rong khác cho rong xuất nhiều giúp cải thiện môi trường ao nuôi, làm thức ăn cho tôm cải thiện suất tơm.[4] 1.3 Mục đích nghiên cứu Trang ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Nghiên cứu trình tách chiết tinh protein từ rong Enteromorpha spp để bổ sung vào thành phần thức ăn cho tôm cá 1.4 Nội dung nghiên cứu - Xác định tiêu sinh hóa rong Enteromorpha spp - Khảo sát yếu tố ảnh hưởng lên trình tách chiết protein rong Enteromorpha spp + Xác định tỷ lệ nước cần ngâm rong (w/v) + Xác định thời gian cần nghiền rong + Xác định thời gian, nhiệt độ, % NaOH ủ rong - Thu nhận protein thông qua dịch chiết thu từ rong Bún Enteromorpha spp + Xác định tỷ lệ cồn tối ưu để tủa protein dịch chiết + Xác định % TCA tối ưu để tủa protein dịch chiết + Xác định pH HCl tối ưu để tủa protein dịch chiết - Tinh protein qua sắc ký lọc gel Biogel P - 100 - Xác định thành phần AA protein rong 1.5 Phương pháp nghiên cứu - Nghiên cứu lý thuyết + Thu thập tài liệu ngồi nước có liên quan đến nội dung nghiên cứu +Tổng hợp phân tích, so sánh đánh giá lựa chọn hướng nghiên cứu phù hợp +Phân tích đánh giá điều kiện thực tế kỹ thuật, kinh tế, xã hội để xác định giới hạn nghiên cứu phương án thực nghiệm - Nghiên cứu thực nghiệm Trang ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP + Lập kế hoạch thực thí nghiệm Xử lý kết Excel phần mềm Stapraphics 1.6 Giới hạn đề tài Vì lý giới hạn thời gian đề tài thực nghiên cứu tình tách chiết, tinh protein gel Biogel P - 100, xác định thành phần AA protein rong 1.7 Tính cấp thiết đề tài Đề tài phần nghiên cứu nằm “dự án phát triển nhiên liệu sinh học từ rong biển Việt Nam” (Hợp tác Viện Sinh Học Nhiệt Đới (ITB) SenterNovem với Algen Sustainables ) nhằm mục đích sử dụng nguồn sinh khối rong biển bền vững tách protein sử dụng làm thức ăn thương mại cho tôm cá Công nghiệp thức ăn gia súc chật vật với việc đưa protein vào thành phần thức ăn với giá thành hợp lý Việc sản xuất thành công sản phẩm protein thực vật từ rong để sử dụng thức ăn gia súc góp phần đa dạng hóa sản phẩm nơng nghiệp, giảm phụ thuộc vào nhập khẩu, giảm chí phí chăn ni cho nơng dân tăng tính cạnh tranh cho doanh nghiệp Phù hợp với kinh tế quốc dân Đồng thời giảm ô nhiễm môi trường nước (hiện tượng phú dưỡng hóa) phát triển ạt khơng kiểm soát rong Trang ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu rong bún Enteromorpha spp Enteromorpha spp chi thuộc họ Ulvaceae phân bố toàn giới, nhiều loại môi trường khác Trên biển giới thống kê 35 lồi Việt Nam có 11 lồi thứ Chi phổ biến rộng rãi phía tây bắc Châu Âu, Enteromorpha spp biết đến loài chiếm ưu vùng đất ngập nước mặn ven biển Tất loài Enteromorpha spp "di chuyển" lơ lửng Enteromorpha spp phát triển nhiều loại chất nền, cát, bùn, đá, chí bê tơng, gỗ kim loại Enteromorpha spp phát triển mà không cần đến giá thể Ở nước ta loại rong tìm thấy nhiều ao hồ ni tôm huyện Cần Giờ, Bạc Liêu, chúng phân bố vùng nước cạn có đáy mềm (cát, cát bùn, bùn cát ) đầm, phá, vịnh ao ni tơm bỏ hoang, có tốc độ phát triển nhanh nơi vùng biển ấm vùng nước lợ ĐBSCl 1.1.1 Đặc điểm sinh học rong Enteromorpha spp 1.1.1.1 Hệ thống phân loại rong Enteromorpha spp Rong Bún Enteromorpha spp nằm ngành rong lục (Chlorophyta), tên thường gọi Gutweed Giới: Plantae Ngành: Chlorophyta Lớp: Ulvophycea Bộ: Ulvales Họ: Ulvaceae Hình 1.1:Rong Bún Enteromorpha spp Chi: Enteromorpha spp (Nguồn: Beachwatchers.wsu.edu) 1.1.1.2 Đặc điểm hình thái, cấu tạo Trang ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình thái Thân có dạng trụ trịn hình ống, dạng túi hay phiến dẹp, có xoan từ gốc đến hai bên hay phần gốc, bàn bám dạng đĩa, chia nhiều nhánh không phân nhánh có hay nhiều hàng tế bào Nhìn từ bề mặt, tế bào hình chữ nhật hay hình vng, xếp thành hàng dọc khơng có quy luật, hạt, thể sắc tố dạng bản, nhiều hạt tạo bột Chiều dài thân từ 10 cm lên đến 70 cm tùy thuộc vào lồi chi đường kính thân đạt tới 25 mm Màu xanh hay màu nâu nhạt Cấu tạo tế bào Vỏ tế bào nguyên sinh chất phân hóa tạo ra, gồm có cellulose phía pectin phía ngồi Chất nguyên sinh tạo thành lớp mỏng sát thành vỏ tế bào : tế bào không bào lớn chứa đầy dịch tế bào Thể sắc tố có dạng phiến , đai vành móng ngựa, hình nhiều cạnh, hình xoắn lị xo, mắt lưới dạng hạt nhỏ… Sắc tố chủ yếu chlorophyll a, chlorophyll b làm cho rong có màu xanh Trong thể sắc tố cịn có hạt tạo bột hình trịn nhỏ giàu protit Hạt tế bào thường nằm khoang túi dịch bào hay sát thành lớp nguyên sinh Thể nhiễm sắt hình que ngắn hay hạt nhỏ, số lượng Sản phẩm đồng hóa tinh bột đơi chất bơ Trong dịch bào, sản phẩm trình trao đổi chất chủ yếu đường, tannin, canxi sunfat chất có màu antocyan Trang ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 1.2: Cấu tạo tế bào rong Enteromorpha spp Bắt đầu phát triển, tế bào chúng tạo thành hàng nhất, cấu trúc monosiphonous Ngay sau sợi monosiphonous hình thành, sau sợi phân chia dọc theo tế bào tạo sợi hai lớp Cuối cùng, sau qua trình phân chia tế bào nhiều hai lớp tế bào riêng biệt tạo nên hình ống, hình thái học chúng trưởng thành Các tế bào bên Enteromorpha spp khác kích thước hình dạng từ lồi sang loại khác Mỗi tế bào chứa lục lạp, lục lạp có kích cỡ khác tùy thuộc vào kích thước tế bào 1.1.1.3 Hình thức sinh sản dạng sống Sinh sản Giống nhiều loại rong khác, Enteromorpha spp có ln phiên giai đoạn sống vơ tính sinh sản Cả hai giai đoạn sống tương tự hình thái Tuy nhiên, thể bào tử có hai nhiễm sắc thể, ký hiệu (2N), thể giao tử có nhiễm sắc thể (1N) Sinh sản vơ tính bào tử động, có - roi; tế bào dinh dưỡng có - - 16 bào tử động Sinh sản hữu tính giao tử đẳng hình hay dị hình, roi hình thành giống bào tử động Giao tử nảy mầm đơn tính khơng có giao phối Giao tử bào tử động phát sinh thành dạng sợi hàng tế bào, sợi chia cắt thành chồi hình ống thẳng đứng hình thành bàn bám Trang ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP lớp tế bào, bàn bám xuất chồi thẳng đứng hàng tế bào, sau tế bào chia cắt ngang dọc tạo nhiều hàng tế bào Trong sơ đồ sau đây, thông qua trình nguyên phân, giao tử sản xuất thể giao tử, sau chúng tham gia phát triển thành thể bào tử Các thể bào tử sau trải qua q trình giảm phân, sản suất bào tử động (sinh sản vơ tính tế bào), bào tử phát triển thành thể giao tử Thể giao tử sau sản xuất nhiều giao tử chu kỳ tiếp tục Hình 1.3 : Sơ đồ vòng đời rong Enteromorpha spp Dạng sống Chúng phát sinh, nảy mầm từ bào tử lúc non bám vào vật bám, phát triển đến giai đoạn tự rời vật bám sống tự tạo thành bè mảng Mặc khác loài sinh sản dinh dưỡng hình thức nảy mầm tái sinh đoạn thân đứt gãy tạo nên dạng sống tự 1.1.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển rong Enteromorpha spp Nghiên cứu Anna I Sousa (2007) [21] cho kết nồng độ muối, ánh sáng dinh dưỡng có tác động lớn đến nảy mầm sinh trưởng bào tử Enteromorpha spp Trang ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP % protein cao (7,68 %) so với tỷ lệ dịch chiết : cồn = : (6,72 %) Vì thêm cồn lạnh vào dịch chiết rong, phân tử protein bị nước bền dung dịch, cồn 96 o dung môi háo nước, chúng lấy nước protein khả hịa tan protein giảm, tạo kết tủa Tuy nhiên, cồn lại có lực với bề mặt kỵ nước phân tử protein Kết chúng làm biến tính protein suốt q trình tủa Do đó, tỷ lệ cồn cao (1:5) hay thấp (1:1; 1:2; 1:3) ảnh hưởng trình tủa Vậy trình khảo sát tỷ lệ cồn 96 tủa protein, ta tìm thấy tỷ lệ cồn 96o (1:4 ) đạt giá trị tối ưu để làm sở nghiên cứu 3.4.3 pH tối ưu tủa protein dung dịch chiết rong Bún Enteromorpha spp Khi ta chọn dịch chiết tốt có chứa hàm lượng protein cao nhất, dựa vào ta khảo sát q trình tủa theo HCl pH ảnh hưởng hàm lượng protein Bảng 3.18: Kết khảo sát pH tủa protein ml dung dịch chiết rong Bún Enteromorpha spp HCl pH % protein (%) pH2 pH3 pH4 pH5 pH6 7,06 7,15 7,99 7,44 6,85 Trang 73 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Đồ thị 3.8: HCl tủa protein Nhận xét: Từ kết bảng 3.18 đồ thị 3.8, ta nhận thấy pH tối ưu tủa protein ml dung dịch chiết rong pH4 ta thu % protein cao (7,99 %) so với pH6 (6,85 %) Vì thêm HCl vào dịch chiết rong, HCl axit vơ mạnh, axit có tính háo nước, lấy nước dung dịch protein , protein bị khử nước Đồng thời pH môi trường giảm xuống, pH2 pH3 protein tích điện dương tính tan protein tăng hàm lượng protein pH thấp (7,06 %) , (7,15 %) Ở pH4 dịch chiết đạt giá trị đẳng điện, protein khơng tích điện Điều làm giảm tính tan protein protein khơng cịn khả tương tác với mơi trường, đó, phân tử protein tách khỏi môi trường dẫn đến hàm lượng protein pH cao (7,99 %) Protein tạo tủa lớp áo nước trung hòa điện tích Cịn pH5 pH6 mơi trường acid lỗng gần trung tính nên tính tan protein tăng khơng cịn tủa pH4 Vậy trình khảo sát pH tủa protein, ta tìm thấy pH4 đạt giá trị tối ưu để làm sở nghiên cứu 3.5 So sánh tủa protein cồn 96o, TCA HCl Trang 74 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Khi ta chọn nồng độ TCA 25 %, tỷ lệ cồn 1:4, HCl pH4 kết tối ưu để tủa protein, dựa vào bảng 3.19 ta so sánh tác nhân tủa để tìm tác nhân tủa tốt Bảng 3.19: Kết tủa protein với tác nhân tủa cồn, TCA, HCl Tác nhân tủa pH ( nồng độ tỷ lệ) Hiệu suất thu Thời gian tủa % protein (%) hồi protein (%) TCA 25% 30 phút 8,21 48,69% HCl pH4 30 phút 7,83 46,44% Cồn 96o 1:4 30 phút 7,55 44,78% Đồ thị 3.9: Các dung dịch tối ưu tủa protein Nhận xét: Từ kết bảng 3.19 đồ thị 3.9, hàm lượng protein thu tủa TCA cao 8,21 %, phải nồng độ 25 % so với tủa cồn Trang 75 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP HCl tỷ lệ 1:4 pH4 Đối với phương pháp tủa protein cồn HCl cho hàm lượng protein thấp tủa TCA Từ suy luận trên, nhận thấy rằng, phương pháp tủa TCA tốt 3.6 Tinh hoạt chất protein qua lọc gel Sau tiến hành chiết xuất tủa protein tác nhân: cồn lạnh, TCA HCl, tiến hành chạy sắc ký sản phẩm tủa tỷ lệ, nồng độ pH tối ưu Đối với sản phẩm tủa cồn lạnh, TCA HCl, trình tinh thực qua lọc gel Biogel P - 100 3.6.1 Tinh protein qua lọc gel Biogel P - 100 sau tủa protein TCA Lấy ml dịch protein từ ml dịch tủa pha NaOH 0,1 N, cho chạy qua hệ sắc ký cột Biogel P - 100 Trang 76 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 3.1: Sắc ký đồ qua tinh protein sắc ký lọc gel sau tủa protein TCA Kết tinh protein qua lọc gel sau tủa protein TCA thu peak với thứ tự sau Peak 1:Từ ống 19 đến ống 32 thu 28 ml Peak 2:Từ ống 33 đến ống 69 thu 74 ml Xác định hàm lượng cho peak Tuy nhiên hàm lượng protein peak cao nên dự đốn peak có chứa protein quan tâm Bảng 3.20: Kết xác định hàm lượng protein trước sau tinh qua tác nhân tủa protein TCA ∑Hàm lượng (mg) Hiệu suất tinh (%) Trước sắc ký 9.125 100% Sau sắc ký 8,17 90% Nhận xét: Từ kết bảng 3.20, ta nhận thấy sau tinh protein qua sắc ký lọc gel ta nhận thấy hàm lượng protein sau tinh thấp hàm lượng protein trước tinh Vì số protein tạp loại bỏ sau chạy sắc ký lọc gel Biogel P - 100 3.6.2 Tinh hoạt chất protein qua lọc gel Biogel P - 100 sau tủa protein HCl Lấy ml dịch protein từ 4ml dịch tủa pha NaOH 0,1 N, cho chạy qua hệ sắc ký cột Biogel P - 100 Trang 77 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 3.2: Sắc ký đồ qua tinh protein sắc ký lọc gel sau tủa protein HCl Kết tinh protein qua lọc gel sau tủa protein HCl thu peak với thứ tự sau Peak 1:Từ ống 16 đến ống 31 thu 32 ml Peak 2:Từ ống 32 đến ống 60 thu 58 ml Xác định hàm lượng cho peak Tuy nhiên hàm lượng protein peak cao nên dự đốn peak có chứa protein quan tâm Bảng 3.21: Kết xác định hàm lượng protein trước sau tinh qua tác nhân tủa protein HCl ∑Hàm lượng (mg) Hiệu suất tinh (%) Trước sắc ký 7,125 100% Sau sắc ký 4,17 59% Trang 78 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Nhận xét: Từ kết bảng 3.21, ta nhận thấy sau tinh protein qua sắc ký lọc gel ta nhận thấy hàm lượng protein sau tinh thấp hàm lượng protein trước tinh Vì số protein tạp loại bỏ sau chạy sắc ký lọc gel Biogel P - 100 3.6.3 Tinh hoạt chất protein qua lọc gel Biogel P - 100 sau tủa protein cồn 96o Lấy ml dịch protein từ ml dịch tủa pha NaOH 0,1 N, cho chạy qua hệ sắc ký cột Biogel P - 100 Hình 3.3: Sắc ký đồ tinh protein sắc ký lọc gel sau tủa protein cồn 96o Kết tinh protein qua lọc gel sau tủa protein cồn 96 o thu peak với thứ tự sau Peak 1:Từ ống 16 đến ống 26 thu 22 ml Peak 2:Từ ống 33 đến ống 69 thu 74 ml Trang 79 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Xác định hàm lượng cho peak Tuy nhiên hàm lượng protein peak cao nên dự đốn peak có chứa protein quan tâm Bảng 3.22: Kết xác định hàm lượng protein trước sau tinh qua tác nhân tủa protein cồn 96 o ∑hàm lượng (mg) Hiệu suất tinh (%) Trước sắc ký 3,225 100% Sau sắc ký 2,35 73% Nhận xét: Từ kết bảng 3.22, ta nhận thấy sau tinh protein qua sắc ký lọc gel ta nhận thấy hàm lượng protein sau tinh thấp hàm lượng protein trước tinh Vì số protein tạp loại bỏ sau chạy sắc ký lọc gel Biogel P – 100 3.6.4 So sánh kết tinh protein với tác nhân tủa cồn 96o, TCA, HCl Bảng 3.23: Kết tinh protein với tác nhân tủa cồn 96o, TCA, HCl qua sắc ký lọc gel Hàm lượng protein (mg) Hiệu suất (%) 8,17 90 % 2,35 73 % 4,17 59 % Dịch thu sau chạy sắc ký, tủa protein TCA Dịch thu sau chạy sắc ký, tủa protein cồn 96o Dịch thu sau chạy sắc ký, tủa Trang 80 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP protein HCl Đồ thị 3.10: Hàm lượng protein TSK SSK dung dịch tủa Nhận xét:Vậy sau tinh protein sắc ký cột Biogel P - 100 thu hàm lượng cao trình tinh sạch, số protein tạp loại bỏ Ta dựa vào bảng 3.14 độ tinh hiệu suất thu nhận tủa TCA tốt qua gel Biogel P - 100 tủa HCl thấp Trang 81 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Từ kết thu qua khảo sát thí nghiệm, từ rút kết luận: - Tách chiết protein với tỷ lệ bột rong : nước ngâm 1:30 ml (w/v) thời gian nghiền phút tối ưu để tách chiết protein từ rong Bún Enteromorpha spp - Ngâm bã rong với NaOH 1%, nhiệt độ ủ 50 oC thời gian ủ 90 phút tối ưu để tách chiết protein từ bã rong Bún Enteromorpha spp - Tủa protein dịch chiết lần sử dụng tỷ lệ dịch chiết : cồn = 1: (v/v) - Tủa protein dịch chiết lần sử dụng nồng độ TCA 25 % tối ưu - Tủa protein dịch chiết lần sử dụng HCl pH tối ưu - Phương pháp tủa TCA cho hiệu suất thu nhận protein cao (90 %) so với tủa HCl (59 %) tủa cồn (73 %) Vậy ta kết luận hiệu suất thu nhận protein tủa TCA cồn tốt qua sắc ký lọc gel Biogel P - 100 4.2 Kiến nghị Với kết thu hiểu số vấn đề protein bước tiến hành tách chiết, thu nhận Tuy nhiên, điều kiện thời gian có giới hạn nên nghiên cứu phạm vi giới hạn nêu Nếu có điều kiện chúng tơi thực tiếp đề tài theo hướng bổ sung protein từ rong vào thành phần thức ăn ĐVTS Trang 82 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt [1] Trần Thị Ân, Đái Duy Ban, Nguyễn Hữu Chấn, Đỗ Đình Hồ, Lê Đức Trình 1980 Hố sinh học NXB Y học, Hà Nội [2] Báo cáo dự án FSPS II/SUDA 3.3.4 (2009) Identify potential for use of recirculation technology for employment generration in aquaculture [3] Phạm Thị Trân Châu, Trần Thị Áng 1999 Hoá sinh học NXB Giáo dục, Hà Nội [4] DANIDA (2002), Seaweed farming and production in Vietnam, present situation and possibilities Báo cáo dự án [5] Nguyễn Hữu Dinh, Huỳnh Quang Năng, Trần Ngọc Bút, Nguyễn Văn Tiến Rong biển Việt Nam (phần phía Bắc), NXB KH & KT, HCM, 364 tr., (1993) [6] Nguyễn Hữu Đại (1999), Thực vật thủy sinh Nhà xuất Nơng Nghiệp Thành Phố Hồ Chí Minh [7] Trần Thị Hà (2000) Giáo trình kỹ thuật ni trồng rong biển NXB nơng nghiệp [8] Nguyễn Xn Hịa, Nguyễn Hữu Đại, Nguyễn Xuân Vy (2001), Sự hấp thụ, tích lụy Nitrate, Phosphate khả xử lý môi trường ưu dưỡng rong xà lách Ulva (Chlorophyta, Ulvales) Tuyển tập nghiên cứu biển, Tập XI: 105 – 114 [9] Phạm Hồng Hộ “Rong biển Việt Nam (phía Nam)” NXB Sài Gòn, 560 tr , 1969 [10] Le Dinh Hung, Huynh Quang Nang, Bui Minh Ly, Ngo Quoc Buu and Tran Thi Thanh Van (2004), The chemical composition of some commercial species of Red algae (Rhodophyta) along the coast of the Southern of Vietnam (in Vietnamese) Journal of Chemistry, Vol 42, Number 2, 159 - 162 Trang 83 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP [11]Nguyễn Đức Lượng Thí nghiệm hóa sinh học, nhà xuất Đại học Quốc gia Tp HCM, Tp HCM [12] Nguyễn Văn Mùi Thực hành hóa sinh học, trường Đại học Khoa học tự nhiên, nhà xuất Đại học Quốc gia Hà Nội, trang 46 [13] Huynh Quang Nang, Nguyen Huu Dinh and Tran Kha (1999), Some results of study on the species Gracilaria heteroclada Zhang et Xia in the Southern Vietnam seawaters (in Vietnamese) Proceedings of the fourth National Conference on Marine Science and Technology Ha Noi, Vol II, pp 1005 – 1009 [14] PGS TS Nguyễn Tiến Thắng (2010) Giáo trình cơng nghệ enzyme, trường Đại học Kỹ Thuật Công nghệ Tp HCM, Tp HCM [15] PGS TS Nguyễn Tiến Thắng (2009) Thực hành môn : Công nghệ enzyme protein, Viện Sinh học Nhiệt đới, Tp HCM [16] Đồng Thị Thanh Thu (1995) Hóa sinh ứng dụng, tủ sách đại học tổng hợp Tp HCM [17] Nguyễn Văn Tiến “Nguồn lợi Rong biển” Chuyên khảo biển Việt Nam, IV (nguồn lợi Sinh vật hệ sinh thái biển), Hà Nội Tr 236-280 (1994) [18] Nguyễn Thanh Tùng (1999) Tài nguyên sinh thái rong Tủ sách đại học Khoa Học Tự Nhiên TP Hồ Chí Minh [19] Viện Ni trồng thủy sản II, “Quy hoạch phát triển nuôi tôm nước lợ Việt Nam đến năm 2015 định hướng đến năm 2020” Báo cáo Bộ NN & PTNT 2007-2009,147 tr (2009) Tài liệu nước [20] Amir Neori (2007), Essential role of seaweed cultivation in integrated multitrophic aquaculture farms for globar expansion of mariculture: an analysis J Appl Phycol Trang 84 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP [21] Anna I Sousa et al (2007), Influence of salinity and nutrients and light on the germination and growth of Enteromorpha sp spores Journal of Experimental Marine Biology and Ecology 341:142-150 [22] Aguilera-Morales, M., Casas-Valdez, M., Carrillo-Dominguez, S., Gonzalez-Acosta, B and Perez-Gil, F (2005), Chemical composition and microbiological assays of marine algae Enteromorpha spp as a potential food source Journal of Food Composition and Analysis 18, 79-88 [23] Bimalendu Ray et al (2006), Polysaccharidas from Enteromorpha compressa: Isolation, purification and structural features, Carbohydrate Polymers, Volume 66, Issue 3, Pages 408-416 [24] Chattopadhyay et al (2007), Sulphated polysaccharides from Indian sample of Enteromorpha compressa (Ulvales, Chlorophyta); Isolation and structural features, Food Chemistry, Volume 104, Issue 3, Pages 928-935 [25] Dodson J.R., Aronson J.M., 1978, Cell wall composition of Enteromorpha intestinalis, Bot Mar., 21, 241–246 [26] Haroon A.M., Szaniawska A., 1995, Variations in energy values and lipid content in Enteromorpha spp from the Gulf of Gdańsk, Oceanologia, 37 (2), 171–180 [27] Hoppe H.A., 1966, Nahrungsmittel aus Meeresalgen, Bot Mar., (Suppl.), 18–40 Jones A L., Harwood J L., 1993, Lipids and lipid metabolism in the marine alga Enteromorpha intestinalis, Phytochemistry, 34 (4), 969–972 [28] Jones A L., Harwood J L., 1993, Lipids and lipid metabolism in the marine alga Enteromorpha intestinalis, Phytochemistry, 34 (4), 969–972 [29] Lowry O.H., Farr A L., Randall R J., Rosebrough N J., 1951, Protein measurement with Folin phenol reagent, J Biol Chem., 193, 265–275 [30] Moss, B & MARSLAND, A., 1976 Regeneration of Enteromorpha Br phyeol J., 11: 309-313 SCAGEL, R F., 1960 The life history studies of the Trang 85 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Pacific Coast marine alga Collinsiella tuberculata Setchell and Gardner Can J Bot., 38: 969-983 [31] Munda I.M., Gubensek F., 1976, The amino acid composition of some common marine algae from Iceland, Bot Mar., 19, 85–92 [32] Munda I.M., Gubensek F., 1986, The amino acid composition of some benthic marine algae from the Northern Adriatic, Bot Mar., 29, 367–372 [33] Owens N J.P., Stewart W.D., 1983, Enteromorpha and the cycling of nitrogen in asmallestuary, Estuar Coast Shelf Sci., 17 (3), 287–296 [34] Pliński M., Florczyk I., Galińska M., 1988, The taxonomy of the genus Enteromorpha Link in the Gulf of Gdańsk A numerical approach, Kieler Meeresforsch Sonderh., 6, 265–271 [35] Robic A et al , Determination of the chemical composition of ulvan, a cell wall polysaccharide from Ulva spp (Ulvales, Chlorophyta) by FT-IR and chemometrics, J Appl Phycol (2009) 21:451-456 [36]Tkachenko F.P., Koval V.T., 1990, Biochemical composition of abundant benthicseaweeds of the Black Sea, Hydrobiol J., 26 (6), 39–43 Các website: [37].http://www.ehow.com/info_8497598_description-enteromorpha-typegreen-algae.html [38].http://baigiang.violet.vn/present/show?entry_id=4451122 [39].http://fishviet.com/fishviet/index.php?page=news&content=8&article=90 [40].http://fishviet.com/fishviet/index.php?page=news&content=8&article=90 [41].http://tailieu.vn/xem-tai-lieu/protein-va-acid-amin-trong-thuc-an-thuysan.1006246.html Trang 86 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP [42] http://www.mbari.org/staff/conn/botany/greens/ram/classification.htm [43].http://www.theseashore.org.uk/theseashore/SpeciesPages/Gutweed.jpg.ht ml Trang 87 ... Phương pháp nghiên cứu thu nhận protein từ rong bún Enteromorpha spp 2.3.2.1 Tách chiết protein rong Bún Enteromorpha spp Mẫu rong khô Ngâm 12h Khảo sát thời gian nghiền mẫu Khảo sát tỷ lệ rong/ nước... từ rong Enteromorpha spp để bổ sung vào thành phần thức ăn cho tôm cá 1.4 Nội dung nghiên cứu - Xác định tiêu sinh hóa rong Enteromorpha spp - Khảo sát yếu tố ảnh hưởng lên trình tách chiết protein. .. từ rong Bún Enteromorpha spp + Xác định tỷ lệ cồn tối ưu để tủa protein dịch chiết + Xác định % TCA tối ưu để tủa protein dịch chiết + Xác định pH HCl tối ưu để tủa protein dịch chiết - Tinh protein