CAMPYLOBACTER

Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4 CAMPYLOBACTER PHÂN LOẠI - Thuộc họ Campylobacteriaceae - Có 5 loài Campylobacter thường gặp. C. sputorum, biovar sputorum – là một phần của hệ VSV miệng ở người C. fetus, ssp. fetus C. fetus, ssp. venerealis C. jejuni C. coli Kích thước quá nhỏ nên có thể đi qua lọc vi khuẩn Là nguyên nhân phổ biến gây viêm dạ dày ruột do vi khuẩn ở các nước phát triển Riêng ở Mỹ:~2.5 million cas mắc/năm Các vụ ngộ độc thực phẩm thường liên quan với tiêu thụ gia cầm, thịt và sữa không thanh trùng • 1998–2002: 61 vụ với 1,440 người mắc • Vụ lớn nhất do nguồn nước ô nhiễm ~3,000 cas • Vụ lớn nhất do sữa ô nhiễm ~1,600 cas ở California 2006 ĐẶC ĐIỂM • Hình dấu phảy, chữ S hoặc hình cánh chim, Gram âm. • Di động bằng roi ở một đầu • Không có vỏ và bào tử • Phát triển trong điều kiện vi hiếu khí NƠI CƯ TRÚ • 3 loài Campylobacter C. jejuni, C. coli,và C. lari chiếm 99% nguyên nhân gây bênh ở người • Campylobacter thường cư trú ở đường ruột, ống mật của động vật nuôi, đặc biệt là gà, trâu bò, và lợn (nhiễm trùng không triệu chứng) ĐƯỜNG LÂY TRUYỀN • Phân • Thực phẩm nguy cơ cao: thịt, sữa NUÔI CẤY • Điều kiện vi hiếu khí (5% O 2 ) và (10% CO 2 ) • Nhiệt độ 42℃ • Trên các môi trường chọn lọc 1 1 Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4 • Hai dạng khuẩn lạc Ướt, lan Khô và lồi • Sau 48 giờ nuôi cấy có thể xuất hiện khuẩn lạc nhỏ, trong mờ ĐỘC TỐ - TRIỆU CHỨNG • Hai loại độc tố: - Enterotoxin - Endotoxin • Triệu chứng: - Viêm dạ dày ruột: C.jejuni, C.coli - Nhiễm trùng: C.fetus KHẢ NĂNG GÂY BỆNH Ở NGƯỜI • Thường gây tiêu chảy ở trẻ em • 90% do C.jejuni và C.coli • Liều gây bệnh thấp • Thời gian ủ bệnh: 2 – 5 ngày, đôi khi có thể tới 10 ngày KHẢ NĂNG PHÁT TRIỂN • Dễ chết ở điều kiện khô, lạnh và trên 48 o C • Phát triển được ở pH 4,9 • Phát triển tốt ở pH 5,5 – 8,0 • Phát triển tối ưu ở pH 6,5 – 7,5 PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CAMPYLOBACTER Nguyên lý phương pháp • Phân lập và xác định Campylobacter nuôi cấy trên môi trường chọn lọc trong khí trường vi hiếu khí ở 420C bằng các thử nghiệm sinh hoá học đặc trưng. Phạm vi áp dụng • Thực phẩm và các sản phẩm thực phẩm. Tài liệu viện dẫn 52 TCN – TQTP 0014 : 2005 2 2 Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4 THIẾT BỊ-DỤNG CỤ - Máy đồng nhất mẫu, 10.000 – 20.000 vòng/phút - Tủ sấy 180 – 200 o C - Nồi hấp áp lực - Tủ ấm 42 ±1 o C - Đĩa petri đường kính 90 – 100ml - Bình nuôi cấy kị khí và túi tạo khí trường vi hiếu khí - Bình thuỷ tinh vô trùng, dung tích 250 – 500ml - Ống nghiệm vô trùng 16 – 18 mm pH met hoặc giấy đo pH - Túi đồng nhất mẫu có rãnh lọc - Que cấy, đầu niken/crom hoặc platin. Que cấy thuỷ tinh HÓA CHẤT-MÔI TRƯỜNG - Canh thang Preston - Thạch Charcoal cefoperazone desoxycholate - Thạch 5%máu thỏ (hoặc bò) - Thành phần bổ sung vào môi trường cơ sở - Thạch dinh dưỡng - Dung dịch Oxy già (H 2 O 2 3%) - Dung dịch Natri hippurat 1% - Dung dịch Ninhydrin 3,5% - Dung dịch thử Oxydase - Bộ thuốc nhuộm Gram CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH * Tăng sinh trong canh thang Preston • Cân 25 g thực phẩm, cắt nhỏ, xay nhuyễn hoặc dập bằng máy dập mẫu ở điều kiện vô trùng trong canh thang tăng sinh Preston cho tới khi đươc thể đồng nhất. Sau đó cho vào bình kỵ khí và tạo khí trường vi hiếu khí bằng túi tạo khí (chuẩn bị theo hướng dẫn trên túi tạo khí), đậy chặt nắp bình và ủ ấm ở 42 o C từ 24 – 48 * Cấy chuyển lên môi trường thạch chọn lọc CCD 3 3 Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4 • Cấy lên hai đĩa thạch chọn lọc CCD, mỗi đĩa 1 ăng canh thang tăng sinh chọn lọc, ủ trong điều kiện vi hiếu khí như bước trên, ủ ấm 42 o C từ 24 – 48 giờ để nhận dạng khuẩn lạc nghi ngờ. • Khuẩn lạc nghi ngờ là Campylobacter dẹt, bóng, thường mọc lan, có màu từ xám kem nhạt đến xám xanh. * Cấy chuyển lên môi trường thạch máu • Từ khuẩn lạc nghi ngờ trên môi trường thạch CCD, dùng que cấy ria sang môi trường thạch 5% máu bò hoặc thỏ. Ủ ấm trong điều kiện vi hiếu khí ở 42 o C/24 giờ để thử khẳng định bằng các phản ứng sinh hoá. * T hử khẳng định: Bằng khuẩn lạc vi khuẩn nghi ngờ cấy trên môi trường thạch máu • Hình thể vi khuẩn - Nhuộm Gram và soi trên kính hiển vi xác định hình thể vi khuẩn. Campylobacter là vi khuẩn Gram âm (bắt màu đỏ), có hình lượn sóng hoặc hình cánh chim. Trường hợp vi khuẩn nuôi cấy để quá 48 h và có sự tiếp xúc với oxy không khí, Campylobacter chuyển sang dạng hình cầu. • Phản ứng Catalase - Nhỏ một giọt H 2 O 2 3% lên lam kính, dùng que cấy lấy một khuẩn lạc đặt vào giữa giọt H 2 O 2 . Nếu thấy sủi bọt là phản ứng dương tính. • Phản ứng Oxydase - Đặt một tờ giấy lọc nhỏ lên lam kính. Dùng que thuỷ tinh hoặc que gỗ vô trùng lấy một ít khuẩn lạc phết lên tờ giấy lọc. Nhỏ vài giọt thuốc thử Oxydase lên, đọc kết quả trong 10 giây đầu. - Phản ứng thuỷ phân Natri hippurat (phân biệt Campylobacter jejuni với các loài Campylobacter khác) - Dùng que cấy lấy một ít khuẩn lạc trên môi trường thạch máu cho vào ống nhựa 2 ml đã có sẵn dung dịch Natri hippurat 1% và nghiền đều cho đến khi dung dịch có màu sữa, đem ủ ấm ở 37 o C/2 giờ. Sau đó lấy ra cho từ từ 200µl dung dịch Ninhydrin 3,5% bằng cách chạm nhẹ pipet vào thành ống để lớp dung dịch này nổi ở bên trên. Ủ ấm lần nữa ở 37 o C trong 10 phút và lấy ra đọc kết quả. - Phản ứng dương tính: xuất hiện màu tím sẫm hoặc xanh. - Phản ứng âm tính: không màu hoặc màu xám. 4 4 Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4 TIÊU CHUẨN XÁC ĐỊNH • Gram âm, hình lượn sóng hoặc hình cánh chim • Catalase dương • Oxydase dương BÁO CÁO KẾT QUẢ • Nêu rõ phương pháp đã dùng và có hay không có Campylobacter trong 25 gam sản phẩm kiểm nghiệm, các thông tin về mẫu thử cũng như các điều kiện khác với tiêu chuẩn này. 5 5 Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4 TỔNG KẾT VI SINH THỰC PHẨM II PHƯƠNG PHÁP NGUYÊN LÝ TIẾN HÀNH CÁC TÍNHCHẤT ĐIỂN HÌNH TRÊN MTCL NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ TÍNH KẾT QỦA TỔNG SỐ VKHK -KT đổ đĩa -Ủ hiếu khí 37±1 0 C - 48-72h Kết quả tính theo số KL Pha loãng bằng các dung dịch pha loãng thông thường 48 h đếm sơ bộ 72h đếm chính thức Có hay không các đĩa thỏa mãn yêu cầu Chọn đĩa 150 – 300 KL của hai đậm độ liên tiếp để tính KQ theo công thức: N = 10g(10ml) + 90 ml dung dịch pha loãng Mỗi đậm độ cấy 2 đĩa Mỗi đĩa 1 ml Tất cả các khuẩn lạc mọc hiếu khí(kể cả men, mốc) Chọn đĩa 15 – 300 KL Giá trị cao/giá trị thấp >2 lấy đậm độ thấp hơn để tính kết quả theo trung bình cộng Nuôi cấy ít nhất 3 đậm độ Không có dạng khuẩn lạc điển hình nhất định Chọn hai đậm độ liên tiếp để tính kết quả Tổng KL ở đậm độ nguyên hoặc 10 -1 <15: lấy KQ trung bình cộng các đĩa ở hai đậm độ được chọn Lật ngược đĩa Tất cả các đĩa không có KL mọc: < 1VSVHK/ml SP lỏng <1x1/d VSVHK/g SP dạng khác 6 dxnn C )1,0( 21 + ∑ 6 Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4 7 7 Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4 PHƯƠNG PHÁP NGUYÊN LÝ TIẾN HÀNH CÁC TÍNHCHẤT ĐIỂN HÌNH TRÊN MTCL NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ TÍNH KẾT QỦA TỔNG SỐ BT MEN MỐC -KT đổ đĩa -Ủ hiếu khí 28±1 0 C 5 – 7 ngày Kết quả tính theo số khóm nấm -Nấm men; pha loãng bằng các dung dịch pha loãng thông thường -TSBT NM-NM hoặc tổng số nấm mốc: sử dụng nước pha loãng có thạch Phát triển hiếu khí 3 ngày đọc kết quả sơ bộ (72h) 5 ngày đọc chính thức (120h) Có hay không các đĩa thỏa mãn yêu cầu Giá trị cao/giá trị thấp ≤ 2 tính theo công thức: N = 10g(10ml) + 90 ml dung dịch pha loãng Mỗi đậm độ cấy 2 đĩa Mỗi đĩa 1 ml Nuôi cấy ít nhất 3 đậm độ Khóm nấm mốc có bông khí sinh, màu sắc và đường kính khác nhau, viền mép không đều, tâm thường có màu đậm Chọn đĩa có từ 15-150 KL nấm men Chọn đĩa có 5 – 50 KL nấm mốc Giá trị cao/giá trị thấp >2 lấy đậm độ thấp hơn để tính kết quả theo trung bình cộng Không lât ngược đĩa Khuẩn lạc nấm men thường bóng, lối, viền mép đều. Dạng bơ Màu săc đồng đều, không phân biệt tâm, có thể kem, hồng hoặc đỏ Chọn hai đậm độ liên tiếp để tính kết quả Tổng KL ở đậm độ nguyên hoặc 10 -1 <15: lấy KQ trung bình cộng các đĩa ở hai đậm độ được chọn Tất cả các đĩa không có KL mọc: < 1 BTNM NM/ml SP lỏng <1x1/d BTNM NM/g SP dạng khác 8 dxnn C )1,0( 21 + ∑ 8 Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4 9 9 Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4 PHƯƠNG PHÁP NGUYÊN LÝ TIẾN HÀNH CÁC TÍNHCHẤT ĐIỂN HÌNH TRÊN MTCL NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ TÍNH KẾT QỦA ĐỊNH LƯỢNG COLIFORM Kỹ thuật tính số có xác suất lớn nhất(MPN) Định lượng VSV lên men Lactose sinh khí trong MT tăng sinh chọn lọc ở 30 0 C và phú hợp trong phép thử khẳng định Pha loãng: Đệm pep ton, pepton muối LST: các ống đục có sinh khí Độ pha loãng cuối cùng phải cho kết quả âm tính Chọn tổ hợp 3 ống theo các trường hợp để tính kêt quả Từ tổ hợp được chọn, tra bảng để ra chỉ số MPN Đậm độ kép: chia chỉ số MPN cho 10 Đậm độ đơn: nhân chỉ số MPN với số đảo của độ pha loãng 10g(10ml) + 90 ml dung dịch pha loãng BGBL: các ống đục có sinh khí Trường hợp 1: có ít nhất một đậm độ cho KQ 3 ống dương tính Chọn độ pha loãng cao nhất cho kết quả 3 ống (+) và hai đậm độ cao hơn liền kề 3 3 2 1 0 LST kép: 3 ống : 10 ml MT; 10 ml mẫu Trường hợp 2: không đậm độ nào cho KQ 3 ống dương tính Chọn 3 đậm độ cao nhất trong dãy pha loãng trong đó ít nhất có 1 kết quả (+) 2 2 1 1 0 LST đơn: 3 đậm độ 3 ống 1 đậmđộ 1ml/ống Trường hợp đặc biệt : Trong dãy được chọn theo (1) có hai đậm độ không cho kết quả (+) Chọn độ pha loãng thấp nhất cho KQ (+) và hai độ pha loãng cao hơn kế tiếp 3 3 0 0 0 Ủ 30 0 C/24 - 48± 2h Trường hợp đặc biệt : Trong dãy được chọn theo (2) có hai đậm độ không cho kết quả (+) Chọn độ pha loãng thấp nhất cho KQ (+) và hai độ pha loãng cao hơn kế tiếp 2 2 0 1 0 Từ các ống (+) cấy sang BGBL, 1 ăng/ống Ủ 30 0 C/24 - 48± 2h Trường hợp đặc biệt : các ống (+) chỉ thấy ở đậm độ pha loãng đầu Chọn ba độ pha loãng đầu tiên để tính kết quả 1 0 0 0 2 0 0 0 3 0 0 0 10 10 [...]... tính chất SVHH 23 -VK Gram(-) -Hình lượn sóng, cánh chim… -Catalase (+) -Oxydase(+) - Thủy phân Hippurate (+): C.jejuni 23 NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ TÍNH KẾT QỦA Trả lời KQ Có hay không có Campylobacter Có mặt hay không có mặt Campylobacter /25g (25ml) mẫu thử Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4 BẢNG CHỈ SỐ MPN CHO DÃY 3 ỐNG Số ống dương tính MPN cho 1g hoặc 1ml 1 : 10 1 : 100 1 : 1000... tích Vi sinh – nấm thực phẩm II PHƯƠNG PHÁP NGUYÊN LÝ ATTP 4 TIẾN HÀNH Sử dụng canh thang Preston để tăng sinh CÁC TÍNHCHẤT ĐIỂN HÌNH TRÊN MTCL Phát triển trong điều kiện vi hiếu khí PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CAMPYLOBACTER Phương pháp định tính 25g +225ml Preston Ủ vi hiếu khí/420C/24 – 48h KLĐH dẹt, bóng, xám kem nhạt đến xám xanh, thường lan Cấy chuyển lên thạch chọn lọc CCD Ủ vi hiếu khí/420C/24 – 48h Cấy . phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4 CAMPYLOBACTER PHÂN LOẠI - Thuộc họ Campylobacteriaceae - Có 5 loài Campylobacter thường gặp. C. sputorum, biovar. kiện vi hiếu khí NƠI CƯ TRÚ • 3 loài Campylobacter C. jejuni, C. coli,và C. lari chiếm 99% nguyên nhân gây bênh ở người • Campylobacter thường cư trú ở đường