TUYỂN CHỌN VÀ NGHIÊN CỨU CÁC ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ VI SINH VẬT NHẰM SẢN XUẤT PHÂN VI SINH

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Mai Thị Vân Khánh Tên đề tài: TUYỂN CHỌN VÀ NGHIÊN CỨU CÁC ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ VI SINH VẬT NHẰM SẢN XUẤT PHÂN VI SINH LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC THỰC NGHIỆM Hà Nội – 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Mai Thị Vân Khánh Tên đề tài: TUYỂN CHỌN VÀ NGHIÊN CỨU CÁC ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ VI SINH VẬT NHẰM SẢN XUẤT PHÂN VI SINH Chuyên ngành: Sinh học Thực nghiệm Lớp: BIO17-1 Khóa: K2017B Khoa: Cơng nghệ Sinh học LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC THỰC NGHIỆM HƯỚNG DẪN KHOA HỌC Hướng dẫn 1: TS Nguyễn Thành Đức Hướng dẫn 2: TS Lê Thị Nhi Công Hà Nội - 2019 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận văn kết nghiên cứu cá nhân hướng dẫn TS Nguyễn Thành Đức TS Lê Thị Nhi Công Các số liệu tài liệu trích dẫn luận văn trung thực Kết nghiên cứu không trùng với cơng trình cơng bố trước Tơi xin chịu trách nhiệm với lời cam đoan mình./ Hà Nội, tháng năm 2019 Tác giả Mai Thị Vân Khánh ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Học viện Khoa học Công nghệ, Viện Di truyền Nông nghiệp, thầy giáo, cô giáo tạo điều kiện thuận lợi cho tơi học tập hồn thành khóa học Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Nguyễn Thành Đức Viện Di truyền Nông nghiệp TS Lê Thị Nhi Công - Viện Công nghệ sinh học, tận tình giúp đỡ, hướng dẫn tơi hồn thành luận văn Tơi xin cảm ơn GS TS Đỗ Năng Vịnh tập thể cán Phòng Thí nghiệm trọng điểm cơng nghệ tế bào - Viện Di truyền Nông nghiệp động viên, giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi sở vật chất - trang thiết bị để tơi hồn thành luận văn Luận văn sử dụng phần số liệu kết thuộc chương trình Nghị định thư với Cộng hòa Liên bang Đức: “Nghiên cứu sản xuất ứng dụng số vật liệu (Chất hấp thụ, hạt cải tạo vải địa kỹ thuật) từ phế phụ phẩm mía đường lúa để nâng cao giá trị gia tăng phục vị nông nghiệp bền vững”, mã số: NĐT.22.GER/16 GS.TS Đỗ Năng Vịnh làm chủ nhiệm Tôi xin chân thành cám ơn Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn vơ sâu sắc tới gia đình, bạn bè, đồng nghiệp người ln bên cạnh, động viên, góp ý cho tơi suốt q trình học tập Hà Nội, tháng năm 2019 Tác giả Mai Thị Vân Khánh iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT STT Ký hiệu Giải thích ký hiệu VSV Vi sinh vật PL Phân lập (N) Phân đạm (P) Phân lân VSVPGL Vi sinh vật phân giải lân XK Xạ khuẩn KHC Ký hiệu chủng KL Khuẩn lạc TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam 10 NCBI Ngân hàng liệu trình tự gen 11 DNA Phân tử mang thông tin di truyền 12 PCR Phản ứng chuỗi polymerase 13 Gauze I Môi trường Gauze bổ sung thêm bột CMC 14 AT Mơi trường ni cấy thích hợp cho chủng vi khuẩn chi Azotobacter iv DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc chủng vi sinh vật phân giải xenlulo phân lập từ mẫu đất thu thập 24 Bảng 3.2 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc chủng VSV có khả cố định nitơ 26 Bảng 3.3 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc chủng vi sinh vật có khả phân giải lân từ mẫu đất thu thập 27 Bảng 3.4 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc chủng VSV ( phân lập môi trường King B) 28 Bảng 3.5 Đánh giá hoạt tính phân giải xenlulo chủng vi sinh vật 30 Bảng 3.6 Khả cố định nitơ chủng vi khuẩn phân lập 32 Bảng 3.7 Đánh giá hoạt tính phân giải lân chủng VSV phân lập 33 Bảng 3.8 Đánh giá hoạt tính sinh IAA sau 48 h chủng vi khuẩn phân lập 35 Bảng 3.9 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa chủng vi sinh vật phân giải xenlulo tuyển chọn 37 Bảng 3.10 Ảnh hưởng nguồn cacbon khác (glucose, sacharose, tinh bột, CMC) đến sinh trưởng, phát triển chủng VSV 37 Bảng 3.11 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc hoạt tính sinh học chủng X-VDT3 38 Bảng 3.12 Đặc điểm sinh học chủng N-VDT10 38 Bảng 3.13 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc hoạt tính sinh học chủng N-VDT10 39 Bảng 3.14 Điểm sinh học chủng vi sinh vật tuyển chọn 40 v DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình 3.1 Đánh giá hoạt tính phân giải xenlulo vsv phân lập (vòng tròn suốt bao quanh lỗ thạch) 31 Hình 3.2 Phản ứng màu chủng cố định N2 với thuốc thử Nessler 32 Hình 3.3 Vòng tròn suốt bao quanh khuẩn lạc vsv phân lập (trên môi trường chứa Ca3(PO4)2) 34 Hình 3.4 Khả sinh tổng hợp IAA thô chủng vi sinh vật 36 Hình 3.5 Cây phát sinh chủng loại hai chủng X-VDT3 X-VDT6 44 vi MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iii DANH MỤC CÁC BẢNG iv DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ v MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU, SẢN XUẤT PHÂN BÓN HỮU CƠ VI SINH 1.1.1 Tình hình nghiên cứu phân bón sản xuất nơng nghiệp 1.1.2 Tình hình sản xuất phân bón sản xuất nơng nghiệp 1.1.3 Tình hình nghiên cứu, ứng dụng phân bón hữu vi sinh giới 1.2 NHĨM VI SINH VẬT CĨ ÍCH PHỤC VỤ SẢN XUẤT PHÂN BÓN VI SINH 10 1.2.1 Vi sinh vật cố định đạm 10 1.2.2 Vi sinh vật phân giải lân 10 1.2.3 Vi sinh vật phân giải xenlulo 11 1.2.4 Vi sinh vật sinh hocmon sinh trưởng thực vật 13 1.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU, ĐỊNH DANH VI SINH VẬT 14 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 17 2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 17 2.2.1 Phân lập lưu giữ chủng vi sinh vật từ mẫu đất 17 2.2.2 Tuyển chọn đánh giá hoạt tính sinh học chủng vi sinh vật có ích 17 2.2.3 Định danh chủng vi sinh vật phân giải xenlulo 17 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.3.1 Phương pháp phân lập lưu trữ chủng vi sinh vật 17 vii 2.3.2 Phương pháp xác định định tính hoạt tính CMC- aza (Williams, 1983) 19 2.3.3 Phương pháp đánh giá hoạt tính cố định nitơ vi sinh vật 19 2.3.4 Phương pháp tuyển chọn vi sinh vật phân giải phốt 20 2.3.6 Phân loại vi sinh vật 23 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24 3.1 PHÂN LẬP VÀ LƯU GIỮ CÁC CHỦNG VI SINH VẬT TỪ MẪU ĐẤT 24 3.1.1 Vi sinh vật phân giải xenlulo 24 3.1.2 Vi sinh vật cố định nitơ 25 3.1.3 Vi sinh vật phân giải lân 27 3.1.4 Vi sinh vật kích thích sinh trưởng thực vật 28 3.2 ĐÁNH GIÁ CÁC HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC CHỦNG VI SINH VẬT CĨ ÍCH 29 3.2.1 Đánh giá hoạt tính phân giải xenlulo 29 3.2.2 Đánh giá hoạt tính cố định Nitơ 31 3.2.3 Đánh giá khả phân giải Phốt (lân) khó tiêu 33 3.2.4 Đánh giá khả sinh IAA chủng vi sinh vật 35 3.3 ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC CHỦNG VI SINH VẬT CĨ ÍCH PHỤC VỤ SẢN XUẤT PHÂN BÓN VI SINH 36 3.4 ĐỊNH DANH CHỦNG VSV PHÂN GIẢI XENLULO BẰNG PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ GENE RNA RIBOXOM ĐẶC TRƯNG CHO LOÀI 40 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45 4.1 KẾT LUẬN 45 4.2 KIẾN NGHỊ 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO 46 MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Với lợi đất nước nông nghiệp, Việt Nam có tiềm lớn nguồn phế phụ phẩm trồng trọt từ trồng chính( lúa, ngơ, mía, lạc, đậu tương ), riêng mía lượng bã bùn mía sau chế biến đường lớn, năm diện tích trồng mía khoảng 257.546 ha, sản lượng ép 15,76 triệu mía cây, sản xuất đường sinh lượng phế thải khổng lồ: 2,5 triệu bã mía, 500.000 bã bùn (sau lấy nước đường) 250.000 mật rỉ Trước 80% lượng bã mía dùng để đốt lò nhà máy sản xuất đường, sinh 50.000 tro 20% lại (khoảng 500.000 tấn) dùng làm ván ép, mật rỉ dùng sản xuất cồn, mỳ cơng nghệ vi sinh khác chế biến thành thức ăn chăn nuôi Riêng tro, đặc biệt bã bùn không sử dụng phải đổ bỏ gây ô nhiễm môi trường nghiêm trọng, bã bùn mía có chứa lượng dinh dưỡng cao đạm, lân, lưu huỳnh canxi, sử dụng làm nguồn phân hữu tốt cho trồng, đặc biệt mía Đứng trước tình hình đó, có nhiều giải pháp đặt sử dụng nguồn chất thải làm thức ăn chăn nuôi, sử dụng loại bã mía sạch, chất lượng tốt nên chưa giải bã bùn (ngun nhân gây thối đổ ngồi mơi trường) Một giải pháp coi khả quan xét mặt kinh tế mơi trường sử dụng bã bùn mía làm phân hữu vi sinh Vì giải pháp trả lại lượng hữu quan trọng cho đất trồng mía Theo tính tốn để trồng 250.000 mía, ngồi phân bón vơ (đạm - lân - kali) tối thiểu phải bón - phân chuồng cho ha, tức phải có triệu phân chuồng bón cho 250.000 Tuy nhiên, để sử dụng hiệu bã bùn mía việc xử lý nguyên liệu chủng vi sinh vật quan trọng Trong chất thải nhà máy mía đường thành phần bã thải bã bùn, váng bọt (chiếm - 4% so với mía), chất xơ, đường, protein, lipit,… thành phần tốt cho phân hữu vi sinh, việc nghiên cứu, tuyển chọn vi sinh vật phân giải bã bùn mía cần thiết Do vậy, đề tài “Tuyển chọn nghiên cứu đặc tính sinh học số vi sinh vật nhằm sản xuất phân vi sinh" đề xuất thực nhằm giải phần vấn đề có tính cấp thiết, mang tính khoa học thực tiễn cao Kết thu đề tài cung cấp số nhóm 35 truyền hoạt tính phân giải lân chủng ổn định Vì vậy, chủng P-VDT1, P-VDT2 lưu giữ để tiến hành nghiên cứu 3.2.4 Đánh giá khả sinh IAA chủng vi sinh vật Từ nguồn vi sinh vật phân lập trên, tiến hành xác định khả sinh IAA thô theo phương pháp Salkowski cải tiến, so màu bước sóng 530 nm Hàm lượng IAA tính tốn dựa theo đồ thị chuẩn Kết thể Bảng 3.8 Hình 3.4 Bảng 3.8 Đánh giá hoạt tính sinh IAA sau 48 h chủng vi khuẩn phân lập TT Ký hiệu chủng Mật độ tế bào Khả sinh (108 CFU/ml) IAA (g/ml) H-VDT1 3,2 182,0 H-VDT2 2,5 169,0 H-VDT3 1,1 125,3 H-VDT4 2,7 65,5 H-VDT5 1,9 82,6 H-VDT6 1,3 72,5 H-VDT7 2,2 150,3 H-VDT8 2,5 69,6 H-VDT9 1,4 54,2 10 H-VDT10 1,7 157,0 11 H-VDT11 2,1 112,4 12 H-VDT12 1,0 123,9 13 H-VDT13 1,5 136,1 14 H-VDT14 3,7 84,0 15 H-VDT15 2,8 97,3 36 Kết Bảng 3.8 cho thấy, sau 48 nuôi cấy, hàm lượng IAA sinh từ chủng vi sinh vật dao động mạnh từ 54,2 - 182,0 (g/ml) Trong lựa chọn chủng vi sinh vật có khả sinh IAA mạnh chủng vi khuẩn H-VDT1, H-VDT 2, H-VDT7, H-VDT10 có hàm lượng IAA đạt > 150 g/ml Hình 3.4 Khả sinh tổng hợp IAA thô chủng vi sinh vật 3.3 ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC CHỦNG VI SINH VẬT CĨ ÍCH PHỤC VỤ SẢN XUẤT PHÂN BÓN VI SINH i) Đặc điểm sinh lý, sinh hóa chủng xạ khuẩn phân giải xenlulo Kết thực nghiệm đánh giá số tiêu sinh lí, sinh hóa chủng vi sinh X-VDT3 thể bảng 3.10 Chúng thấy chủng xạ khuẩn lựa chọn có nhu cầu oxy, phát triển tốt điều kiện nhiệt độ từ 28 - 45 oC, vi khuẩn Gram dương, chịu pH khoảng từ 6,5 đến 7,5 phát triển tốt pH = Về môi trường nuôi cấy, chủng xạ khuẩn X-VDT3 có khả phát triển mơi trường đặc hiệu Gauze I Khi tiến hành nuôi cấy chủng vi khuẩn môi trường Gauze thay CMC glucoza, sacharoza, tinh bột, khả phát triển chủng vi sinh vật khác Kết thể Bảng 3.9 sau 37 Bảng 3.9 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa chủng vi sinh vật phân giải xenlulo tuyển chọn Ký hiệu chủng Nhu cầu oxy X-VDT3 + Gam pH thích hợp Mơi trường ni cấy Nhiệt độ thích hợp (0C) + 6,5 – 7,5 Gauze I 37 Khả chịu nhiệt (0C) Khả chịu mặn (% NaCl) 45-55 2-3 Chú thích: Gauze I: Mơi trường Gauze bổ sung thêm bột CMC Chủng xạ khuẩn X-VDT3 phát triển tốt mơi trường Gauze, nhiệt độ thích hợp để chủng sinh trưởng phát triển đạt mật độ CFU > 10 sau 48h 37 oC Đồng thời khả chịu NaCl đạt 2- 3% Ảnh hưởng nguồn cacbon khác nhau: Bảng 3.10 Ảnh hưởng nguồn cacbon khác (glucose, sacharose, tinh bột, CMC) đến sinh trưởng, phát triển chủng VSV Ký hiệu chủng X-VDT3 Mức độ sinh trưởng Glucoz a sacha roza tinh bột ++++ ++ ++++ Khả phân giải xenlulo (kích thước vòng phân giải: D-d, mm) CMC glucoza ++ 3,2 sacha roza tinh bột CMC 2,7 3,2 2,5 ++++: sinh trưởng tốt ++: sinh trưởng trung bình +++: sinh trưởng +: sinh trưởng yếu Kết bảng 3.10 cho thấy chủng nghiên cứu có khả đồng hóa tốt nguồn bon khác Tuy nhiên đồng hóa tốt nguồn bon glucoza tinh bột, đồng hóa trung nguồn bon CMC sacharoza Đặc điểm hình thái khuẩn lạc: 38 Bảng 3.11 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc hoạt tính sinh học chủng X-VDT3 Ký hiệu chủng Nguồn phân lập Đặc điểm khuẩn lạc Khả phân giải xenlulo(D-d, mm) X-VDT3 Đất Thanh Hố Tròn, dẹt, nhăn mép cưa, kích thước 1- mm, trắng bông, khuẩn ty chất 30 Kết Bảng 3.9, 3.10 3.11 cho thấy, chủng xạ khuẩn phân giải xenlulo lựa chọn X-VDT3 thuộc nhóm Gram dương, hình thành bào tử, thuộc nhóm hiếu khí, chịu muối thuộc loại trung bình, sinh trưởng phát triển tốt nồng độ muối 0,05 – 0,6 %, chịu pH khoảng từ 6,5 đến 7,5 phát triển tốt pH = 7, khả chịu nhiệt độ nuôi cấy cao có khả đồng hóa tốt nguồn bon khác (glucoza, tinh bột CMC) Qua kết đặc điểm sinh học chủng xạ khuẩn X-VDT3, đối chiếu với tài liệu theo khóa phân loại Bergey (1994) Waksman, S A (1961) phân loại sơ chủng xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces ii) Đặc điểm sinh lý, sinh hóa chủng vi khuẩn cố định nitơ tự Chúng tiến hành nghiên cứu xác định đặc điểm sinh lý, sinh hóa chủng vi khuẩn N-VDT10 có khả cố định nitơ tự Kết thu thể Bảng 3.12, 3.13 Bảng 3.12 Đặc điểm sinh học chủng N-VDT10 Sinh Sinh Sinh Kýhiệuch Oxy Gram trưởng trưởng bào ủng dase hiếu khí kị khí tử N-VDT10 - + - + + pH thích hợp 6,5-7,0 Mơi Nhiệt độ trường thích ni hợp (oC) cấy AT 28-30 39 *AT: mơi trường ni cấy thích hợp cho chủng vi khuẩn chi Azotobacter Bảng 3.13 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc hoạt tính sinh học chủng N-VDT10 Ký hiệu chủng Nguồn phân lập Đặc điểm khuẩn lạc Hoạt tính sinh học N-VDT10 Đất Nghệ An Tròn, lồi, nhày, trắng đục, kích thước 1- mm Cố định nitơ tự Chủng vi khuẩn N-VDT10 có khả cố định nitơ tự vi khuẩn gram âm, hiếu khí, phát triển tốt pH trung tính, tế bào hình trứng lớn, có khả tạo thành dạng nang tế bào (cyst), sinh trưởng, phát triển tốt môi trường vô đạm Dựa vào đặc điểm sinh lý sinh hóa nghiên cứu kết tra cứu theo đặc điểm sinh lý, sinh hóa Nguyễn Lân Dũng (1984), thấy chủng vi khuẩn N-VDT10 thuộc chi Azotobacter Các loài thuộc chi Azotobacter, loài vi sinh vật cố định nitơ tự hoạt động mạnh Nhiều loài biết đến Az chroococum; Az agilis; Az beijerinck; Az vinelandii… Các loài khác đặc điểm sinh trưởng môi trường đặc, kích thước, hình thái tế bào số đặc điểm sinh lý khác Cho nên dựa vào đặc điểm để phân biệt đến loài chủng Azotobacter tuyển chọn iii) Đặc điểm sinh lý, sinh hóa chủng vi khuẩn phân giải lân, kích thích sinh trưởng Tiến hành xác định đặc điểm sinh lý, sinh hoá chủng vi sinh vật P-VDT1 - phân giải lân chủng H-VDT1 – kích thích sinh trưởng thực vật Kết tổng hợp Bảng 3.14 40 Bảng 3.14 Điểm sinh học chủng vi sinh vật tuyển chọn Sinh trưởng Ký hiệu Gam chủng hiếu khí Khuẩn lạc Sinh có màu trưởng vàng kị khí vàng cam YDC Phátqu Sinh ang trưởng Oxy Sinhb trên dase tử KB D1M P-VDT1 + + - - - - + + H-VDT1 + + - - - - + + Chú thích: “+”: dương tính, “-“: âm tính Chủng vi sinh vật PVDT1 - phân giải lân; H-VDT1- kích thích sinh trưởng thực vật, chủng vi khuẩn gram dương, hình thành bào tử, hiếu khí, phát triển tốt pH trung tính, tế bào hình que, sinh trưởng, phát triển tốt môi trường King B Dựa vào kết đặc điểm sinh lý, sinh hóa nghiên cứu kết tra cứu theo khóa phân loại chi phổ biến N W Schaad 2002 thấy rằng, chủng PVDT1 H-VDT1 thuộc chi Bacillus Như vậy, thông qua đặc điểm sinh lý sinh hóa, bước đầu xác định chủng xạ khuẩn phân giải xenlulo X-VDT1 thuộc chi Streptomyces; N-VDT1 có khả cố định nitơ tự thuộc chi Azotobacter; P-VDT1 - phân giải lân H-VDT1- kích thích sinh trưởng thuộc chi Bacillus 3.4 ĐỊNH DANH CHỦNG VSV PHÂN GIẢI XENLULO BẰNG PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ GENE RNA RIBOXOM ĐẶC TRƯNG CHO LỒI Do tính cấp thiết đề tài để xử lý phụ phế phẩm nông nghiệp bã mía rơm rạ chất thải chăn nuôi gia súc, gia cầm không xử lý gây nhiễm mơi trường chúng tơi tiến hành định danh trước chủng vi sinh vật có khả phân hủy xelulo trước để phục vụ sản xuất phân bón 41 Để định danh hai chủng vi sinh vật có hoạt tính phân giải xenlulo mạnh X-VDT3 X-VDT6, áp dụng phương pháp giải mã trình tự đoạn gen 16S rRNA hai chủng vi sinh vật Sử dụng cặp mồi 27F (GAG AGT TTG ATC CTG GCT CAG) 1495R (CTA CGG CTA CCT TGT TAC GA) để nhân đoạn trình tự 16S rRNA có kích thước khoảng 1,5kb Sản phẩm PCR sau gửi giải mã trình tự, kết giải mã trình tự thể bảng bên dưới: X-VDT3: ACATGCAAGTCGAACGATGAACCACTTCGGTGGGGA TTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCC TTCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCG GATAACACTCCCTCTCTCATGGGTGGGGGTTAAAAGCTCC GGCGGTGAAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGT GAGGTAATGGCTCAACAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCT GAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCC AGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAAT GGGCGTAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGAC GGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCG AAGCTGACCGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACG TGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTC CGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCGTGTCA CGTCGGGTGTGAAAGCCCGGGGCTTAACCCCGGGTCTGCA TTCGATACGGGCTAGCTAGAGTGTGGTAGGGGAGATCGGA ATTCCTGGTGTAGCTGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGA ACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCATTACTGACG CTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATA CCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGAACTAGGTGTT AGCGACATTCCACGTCGTCGGTGCCGCAGCTAACGCATTA AGTTCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTC 42 GAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCAGCGGAGCATG TGGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCT TGACATACACCGGAAAGCATCTGAGAGGGTGCCCCCCTTG TGGTCGGTGTACAGGTGGTGCATTGCTGTCGTCAGCTCGTG TCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCACGCAACGAGCGCAACCC TTGTTCTGTGTTGCCAGCATGCCCTTCGGGGTGATGGGGAC TGACAGGAGACCGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGG GACGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCAGC ACACGTGCTACAATGGCCGGTACAATGAGCTGCGATACCG TGAGGAGGAGCGAATCTCAAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGA TTGGGGTCTGCAACTCGCCCCCATGAAGTCGGAGTCGCTA GTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTTAATACGTTCCCG GGCCTCGTACACACCGCTCTTCACGTCACGAAAGTCGGTA ACACCCGAAGCCGGTGGCCCAACCCCTTGTGGGAGGGAGC TGTCGAAGGTGGGACTGGCGATTGGGACGAAGTCGTAACA AGGTAGCCGTACCGGAAGGTGCGGCTGGA Sử dụng ứng dụng so sánh trình tự (Nucleotid Blast) với ngân hàng liệu trình tự NCBI, chúng tơi nhận thấy trình tự gen 16S rRNA chủng X-VDT3 tương đồng 98,43% với trình tự 16S rRNA với mã số NR_042097.1 Do vậy, xác định chủng X-VDT3 chủng xạ khuẩn Streptomyces phaeoluteigriseus 43 Tương tự chủngX-VDT6 có trình tự sau: X-VDT6 GCAAGTCGAACGATGAACCACTTCGGTGGGGATTAGTGGC GAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTGCACTCT GAGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATACTGA TCNTCTTNGGCATCNNRGNTGNTCGAAAGCTCCGGCGGTG CAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTAGTTGGTGAGGTAA TGGCTCACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGG GCGACCGGCCACACTGGGAC TGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGG GAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCC GCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGATTGTAAACCTCTTTCA GCAGGGAAATAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAG CGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAG GGCGCGAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTC GTAGGCGGCTGGTCACGTCGGTTGTGAAAGCCCGGGGCTT AA CCCCGGGTCTGCAGTAGATACGGGCAGGCTAGAGTTCGGT AGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCA GATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGG GCCGATACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGA ACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTG GGCACTAGGTGTGGGCGACATTCCACGTCGTCCGTGCCGC AGCTAACGAATTAAGTGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGC A AGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAG CGGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAAC CTTACCAAGGCTTGACATACACCGGAAAGCATCAGAGATG GTGCCCCCCTTGTGGTCGGTGTACAGGTGGTGCATGGCTGT CGTCAGCTCGTGTCATGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAA CAAGCGCAACCCTGGTGCCGTGTTGCCAGCAGGCCATTGT GGTGCTGGGGACTCACGGGAGACCGCCGGGGTCAACTCGG AGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATG TCTTGGGCTGCACACGTGCTACAATGGCCGGTACAGTGAG CTGCGATACCGCGAGGTGGAGCGAGTCTCAAAAAGCCGGT CTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGT CGGAGTCGCTAGTAATCTCAGATCAGCATTGCTGCGGTGA ATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACG AAAGTCGGTAATACCAGAAGCCGGTGACCCAACCCCTTG TGGGAGGGAGCTGGCGAAGGTGGGACTGGCGATTGGGAC GAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTA 44 Kết so sánh trình tự 16S rRNA nhận từ chủng vi sinh vật X-VDT6 ngân hàng liệu trình tự thu có độ tương đồng cao 98,61% với trình tự 16S rRNA với mã số NR_041088.1 Do vậy, xác định chủng X-VDT6 chủng xạ khuẩn Streptomyces matensis Như ứng dụng so sánh trình tự (Nucleotid Blast) với ngân hàng liệu trình tự NCBI, chúng tơi nhận thấy trình tự gen 16S rRNA chủng X-VDT3 tương đồng 98,43% với trình tự 16S rRNA với mã số NR_042097.1 (Hình 3.5) Do vậy, xác định chủng X-VDT3 chủng xạ khuẩn Streptomyces phaeoluteigriseus X-VDT3 Hình 3.5 Cây phát sinh chủng loại hai chủng X-VDT3 X-VDT6 45 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 KẾT LUẬN  Từ mẫu đất thu thập ruộng lúa mía Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh chúng tơi phân lập được: 15 chủng có khả phân giải xenlulo; 10 chủng có khả cố định Nitơ; 10 chủng có khả phân giải lân khó tiêu 15 chủng có tiềm sinh IAA thơ  Đã xác định được: 02 chúng có hoạt tính phân giải xenlulo mạnh X-VDT3 X-VDT6 với đường kính phân giải xenlulo tương ứng 29 30mm; 02 chủng vi sinh vật N-VDT2 N-VDT10 có khả cố định Nitơ mạnh đạt tương ứng 4,8 5,2 gN/ml sau ngày ni cấy; 02 chủng P-VDT1, P-VDT2 có đường kính vòng phân giải Ca3(PO4)2 mơi trường thạch từ đạt 18 - 20 mm; 04 chủng vi sinh H-VDT1, H-VDT 2, H-VDT7, H-VDT10 có hàm lượng IAA đạt > 150 g/ml  Các chủng phân lập nằm nhóm vi sinh vật an tồn người Các tiêu sinh lí sinh hóa chủng vi sinh vật xác định  02 chủng vi sinh vật phân giải xenlulo mạnh định danh phương pháp giải mã trình tự gen 16S rRNA: X-VDT3 chủng xạ khuẩn Streptomyces phaeoluteigriseusX-VDT3 X-VDT6 Streptomyces matensis X-.VDT6 4.2 KIẾN NGHỊ  Tiếp tục định danh chủng vi sinh vật thuộc nhóm lại nghiên cứu  Nghiên cứu chất mang ứng dụng chủng sản xuất phân bón hữu vi sinh 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO Bell L.C and Edwards D.G., 1989 The role of aluminum in acid soil infertility, Soil management under humid conditions in Asia and Pacific, IBSRAM proceedings, No5 Van Dillewijn, 1952 Rainy tropic climates: physical potential present and improvedfarming system International congress of soil science Alberta, Edmonton, Canada.) Erangelista P.P., Urriza G.I.P ect ,1999 Effeect of organic matter, lime and phosphorus fertilizer on acis upland soil ACIAR project 9414 annual report, Philippines Đinh Thị Ngọ, 1996 Nghiên cứu ảnh hưởng phân xanh, phân khoáng đến sinh trưởng, phát triển, suất chất lượng chè đất đỏ vàng Phú Hộ, Luận án phó tiến sỹ khoa học nơng nghiệp Diekow, 2005 Tea somaclones with high yield and quality potential‖, International symposium on innovation in tea science and sustainable development in tea industry, pp 317- haisit, T., et al (2005) - Effect soil moisture and temperature on decomposition rates of some waste materials from agriculture and agro-industry Heman And Singh G, 1992 The role of integrated plant nutrition systems in sustainable and environmentally sound agriculturl development in India Report of the expert consultation of the ASIA network on bio-organic fertilizers Taton T.W (2005)― Environmental factors affecting the yield of tea‖ Experimental agriculture, pp 53 – 63 Kellogg, W K Foundation, 1997 The compost connection for Washington Agriculture Washington State University Cooperative Extension No Christian Bruns and Christian Schüler, 2000 Suppressive effects of yard waste compost amended growing media on soilborne plant pathogens in organic horticulture University of Kassel, International Rural Development and Environmental Protection 47 10 Hubbe, M.A., et al (2012) Cellulosic substrates for removal of pollutants from aqueous systems: A review Dyes BioResources 7, 2592-2687 11 Hubbe, M.A., et al (2013) Cellulosic substrates for removal of pollutants from aqueous systems: A Review Spilled oil and emulsified organic liquids BioResources 8, 3038-3097 12 Falter, C., et al (2015) Glucanocellulosic ethanol: the undiscovered biofuel potential in energy crops and marine biomass Scientific reports 13 Wang, A., et al (2011) Integrated hydrogen production process from cellulose by combining dark fermentation, microbial fuel cells, and a microbial electrolysis cell Bioresource Technology 102, 41374143 14 Oyeleke, S and Okusanmi, T (2008) Isolation and characterization of cellulose hydrolyzing microorganism from the rumen of ruminants African Journal of Biotechnology 15 Hu, X., et al (2014) Cellulolytic bacteria associated with the gut of Dendroctonus armandi Larvae (Coleoptera: Curculionidae: Scolytinae) Forests 5, 455-465 16 Huang, S., et al (2012) Isolation and identification of cellulolytic bacteria from the gut of Holotrichia parallela larvae (Coleoptera: Scarabaeidae) International journal of molecular sciences 13, 25632577 17 Bayer, E.A., et al (2004) The cellulosomes: multienzyme machines for degradation of plant cell wall polysaccharides Annu Rev Microbiol 58, 521-554 18 Milala, M., et al (2005) Studies on the use of agricultural wastes for cellulase enzyme production by Aspergillus niger Res J Agric Biol Sci 1, 325-328 19 Schwarz, W (2001) The cellulosome and cellulose degradation by anaerobic bacteria Applied microbiology and biotechnology 56, 634649 20 Rastogi, G., et al (2009) Isolation and characterization of cellulosedegrading bacteria from the deep subsurface of the Homestake gold mine, Lead, South Dakota, USA Journal of industrial microbiology & biotechnology 36, 585-598 48 21 Lo, C., et al (2002) Actinomycetes isolated from soil samples from the Crocker Range Sabah ASEAN Review on Biodiversity and Environmental Conservation 22 Jeffrey, L (2008) Isolation, characterization and identification of actinomycetes from agriculture soils at Semongok, Sarawak African Journal of biotechnology 23 Kluepfel, D., et al (1986) Characterization of cellulase and xylanase activities of Streptomyces lividans Applied microbiology and biotechnology 24, 230-234 24 Veiga, M., et al (1983) Isolation of cellulolytic actinomycetes from marine sediments Applied and environmental microbiology 46, 286 25 Yang, B., et al (2011) Enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass Biofuels 2, 421-449 26 Shahriarinour, M., et al (2011) Screening, isolation and selection of cellulolytic fungi from oil palm empty fruit bunch fibre Biotechnology 10, 108-113 27 Williams and Wilkins Co (1986) Bergey- Manual of sustematic bacteriology 28 Cục Bảo vệ Mơi trường (2003) – An tồn sinh học mơi trường: Tài liệu giới thiệu nghị định thư Cartagena An tồn sinh học Chương trình Mơi trường Liên hợp quốc 29.Nguyễn Ngọc Dũng (2003), “Phân loại chủng vi khuẩn chọn lọc có ý nghĩa nơng nghiệp dựa trình tự nucleotít gen 16S-ADN ribosome”, Báo cáo đề tài cấp sở, Viện Công nghệ Sinh học 30 Hồ Huỳnh Thuỳ Dương (1998), Phương pháp PCR Sinh học phân tử, tr 122, 190 -197 31 Nguyễn Văn Mùi (2008) – An toàn sinh học Nhà xuất Giáo dục, Hà Nội 32.Nguyễn Thị Thu Thủy, Nguyễn Tiến Long (2018) Vi sinh vật phân giải cellulose mạnh sản xuất phân hữu từ phế phụ phẩm nông nghiệp ảnh hưởng chúng giống lạc l14 Hương Trà, Thừa Thiên Huế Tạp chí Khoa học Đại học Huế: Nông nghiệp Phát triển nông thôn; ISSN 2588–1191 Tập 127, Số 3B, 2018, Tr 5–19; DOI: 10.26459/hueuni-jard.v127i3B.4483 49 33 Thực trạng giáp pháp phát triển phân bón hữu Báo cáo Hội nghị “Phát triển phân bón hữu cơ” ngày 09/03/2018 34 Nguyễn Anh Huy Nguyễn Hữu Hiệp (2018) Phân lập nhận diện dòng vi khuẩn chịu mặn có khả cố định đạm tổng hợp iaa từ đất sản xuất lúa - tơm Bạc Liêu, Sóc Trăng Kiên Giang Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ Tập 54, Số 1B (2018): 7-12