分 类 号：R195.1 学校代码：1 0 密 学 级： 学位类别： 科学学位□ √ 专业学位 号：2015602941 学科门类：医学 硕 士 学 位 论 文 MASTER’S DISSERTATION 论文题目：天津地区慢性乙型肝炎病毒感染者核苷酸 类似物耐药位点突变横断面分析 TITLE A cross-sectional study on the profile of drug-resistant mutations in nucleos(t)ide analogue-experienced chronic hepatitis B patients in Tianjin 一级学科：临床医学 二级学科：内科学 传染病学 论文作者：TRIEUCONGDOANH 指导教师：侯 伟 教授 天 津 医 科 大 学 研 究 生 院 二〇一八年五月 Edited by Foxit Reader Copyright(C) by Foxit Corporation,2005-2009 For Evaluation Only 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是我个人在导师指导下独立进行研究工作取 得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容和致谢的地方外，论文中不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名： 日期： 年 月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解天津医科大学有关保留、使用学位论文的规定， 即：学校有权将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有 关部门或机构送交论文，并编入有关数据库。 保密 ，在 年解密后适用本授权书。 本论文属于 不保密 √。 （请在相对应的方框内打“√” ） 学位论文作者签名： 导 师 签 名： 日期： 年 月 日 日期： 年 月 日 Tianjin Medical University 中文摘要 目的：乙型肝炎病毒（HBV）感染是全世界最严重和最普遍的健康问题之一。 HBV 感染呈世界性流行，但不同地区 HBV 感染的流行强度差异很大。据世界卫 生组织（ WHO）报道，全球约 20 亿人曾感染 HBV，其中 2.4 亿人为慢性 HBV 感 染者，每年约有 65 万人死于 HBV 感染所致的肝功能衰竭、肝硬化（LC）和肝 细胞癌（HCC）。HBV 属嗜肝 DNA 病毒科（ hepadnaviridae），基因组长约 3.2 kb，为部分双链环状 DNA, 含有多个开放阅读框（ORF）,其基因组编码 HBsAg、 HBeAg、HBcAg、病毒 DNA 多聚酶和 HBx 蛋白。P 区编码ＤＮＡ聚合酶，此 酶既具有反转录酶活性，又有催化合成 DNA 的多聚酶功能。P 区包括四个编码区 域，其中逆转录酶区（RT 区）包含五个功能保守区域：A 区、B 区、C 区、D 区、E 区，其中 A、C、D 区为酶与三磷酸核苷结合的区域，B、E 区为 RNA 模 板和引物定位域。HBV 至少有 A-J 这几个基因型，我国以 B 型和 C 型为主。 目前使用核苷(酸)类似物（NAs）对乙型肝炎病毒（HBV）感染者行直接抗病毒 药物治疗。口服药物方面，在拉米夫定(LAM)、阿德福韦酯(ADV) 、恩替卡韦 (ETV)、替比夫定(LDT) 、替诺福韦酯(TDF)的基础上，新增替诺福韦艾拉酚胺 富马酸(TAF)这一新药。NAs 其进入机体后，形成三磷酸活性成分与机体天然的 脱氧三磷酸核苷（dNTP） 竞争结合到 HBV 聚合酶上，使 HBV 的 DNA 链合 成终止，这是核苷（酸）类似物抑制 HBV 复制的机制。NAs 使用核苷(酸)类似 物能导致在 HBV 聚合酶逆转录酶(RT)结构域位点的保守区发生突变。HBV 常见的 耐药突变位点多位于 HBV 逆转录酶区的 B、C、D 结构域内。不同抗病毒药物 所致的耐药突变位点不同：如①拉米夫定(LAM)耐药：在 HBV 基因组中反转录 酶区的 C 结构域内有一个高度保守的 YMDD 基序，即酪氨酸-甲硫氨酸-天门冬 氨酸-天门冬氨酸。拉米夫定能够与其特异性结合，通过抑制前基因组 RNA 反转 录为负链 DNA 并终止 DNA 链延伸而有效抑制 HBV DNA 复制。②阿德福韦酯 (ADV)耐药：阿德福韦酯同样也能抑制逆转录酶活性，但其耐药突变概率比拉米 夫定低，阿德福韦酯耐药与逆转录酶 B 区或 D 区位点有关，从而降低阿德福韦 酯对 HBV DNA 的抑制作用。③恩替卡韦(ETV)具有高耐药基因屏障，至少需要 三个位点发生突变才可构成耐药。在接受抗病毒药物治疗的患者体内，HBV 突 变株和野生株的比例不断发生变化，而这种变化反过来会影响核苷酸类药物的抗 I Tianjin Medical University 病毒疗效，进而发生基因型耐药（genotypic resistance）、表型耐药（phenotypic resistance）及临床耐药。检测到与 NAs 相关的 HBV 耐药基因突变，称为基因型 耐药（genotypic resistance）。体外实验结果显示抗病毒药物敏感性降低，且与基 因型耐药相关，称为表型耐药（phenotypic resistance）。针对一种抗病毒药物出 现的耐药突变对另一种或几种抗病毒药物也出现耐药，称为交叉耐药（cross resistance ）。 至 少 对 两 种 不 同 类 别 的 NAs 耐 药 ， 称 为 多 药 耐 药 （ multidrug resistance）。耐药变异的产生一方面是在分子结构上产生了影响 HBV 聚合酶表达 的基因变异； 另一方面耐药变异株和野生株的共生生态的变化， 耐药变异株要 能够持续的复制增殖达到一定的数量水平成为所谓的优势株，并表现出耐药的临 床表现。HBV 逆转录酶区耐药基因变异的检测方法:运用 DNA 测序原理的检测 方法如(1)直接测序法,该方法对 HBV 全基因组测序，既可对已知的耐药变异位 点进行检测，也可对未知的耐药变异进行检测研究。临床上以检测常见耐药变异 位点为主。在直接测序基础上发展克隆测序法。(2) 焦磷酸测序法,该方法的检 测通量高，可以对 HBV 基因组上的任意片段进行测序，在同时检测多个已知的 耐药变异同时也可以检测未知的耐药变异。不需要标记引物、核苷酸和凝胶电泳， 具有高灵敏、高特异性和准确性等特点，能早期检测核苷（酸）类似物治疗患者 的 HBV 逆转录酶区基因耐药突变异。还可以运用杂交原理的检测方法如(1)线 性探针技术,将特异的寡核苷酸探针固定于硝酸纤维素膜条上对生物素化 PCR 扩增的目标片段进行反向杂交后显色，使检测结果肉眼可见。本法对检测样本病 毒载量的要求与直接测序法相近,可用于临床上早期发现耐药变异的出现。但本 方法受探针的局限，只能检测常见的几种变异位点，不能用于检测和研究未知的 耐药变异。(2)荧光实时定量 PCR, 该方法结合了 PCR 技术和 FRET 核酸定量 检测技术。在 DNA 扩增的同时释放可供检测的荧光信号，实现对模板 DNA 的 定量分析。该方法应用于单核苷酸多态性分析，检测的敏感性高，对血清样本病 毒载量要求较低。此法敏感性较高，可同时检测多个耐药变异位点。但本方法只 能检测常见的几种变异位点，不能用于检测和研究未知的耐药变异。(3) 基因芯 片法,该方法在芯片表面有序地固定高密度的寡核苷酸或特定基因片段探针，再 与生物素标记的待检基因片段反应， 然后通过显色产生荧光信号， 软件处理信 号获得待测基因序列信息。表型耐药检测是指在体外细胞培养系统中使 HBV 基 因组中一个或多个位点突变，再检测病毒对药物的敏感性降低或丧失，可作为耐 II Tianjin Medical University 药诊断的依据。已发展多种技术如瞬时转染细胞模型、稳定转染细胞模型、酶活 性分析等用于检测表型耐药。目前使用核苷(酸)类似物耐药突变的特点与乙型肝 炎的治疗和管理密切相关。NAs 不能完全清除体内病毒，目前用药患者数巨大 且患者长期服用 NAs，对 NAs 耐药问题在临床上越发严重，往往导致患者病情 反复甚至加重。不同 NAs 药物导致慢性乙肝患者 HBV 逆转录酶区变异位点、 变异模式特点不同。本研究旨在探讨中国天津地区慢性乙型肝炎患者的突变位点 和突变模式的分布特点。 方法：本研究分为三部分。第一部分：对 1320 例慢性乙型肝炎患者 HBV 基因组 RT 区扩增，直接测序后分析耐药突变相关的位点，其中包括 rt80，rt169，rt173， rt180，rt181，rt184，rt194，rt196 ，rt202，rt204，rt207，rt213，rt214，rt215， rt236，rt237，rt238 和 rt250。然后分析其基因型、性别、年龄等是否存在统计学 显着性差异。在第二部分中，我们进一步研究各个突变位点的突变百分比以了解 抗病毒耐药的分子机制，包括 LAM，ADV，ETV，LDT 和 TDF。第三部分，我 们又进一步分析了基因型，性别和年龄组之间的突变模式。 结果：收集 2012 年 月至 2015 年 12 月在天津市第二人民医院，天津市肝病研 究所诊治的慢性乙型肝炎感染者 1320 名，其中男性占比 73.79％，女性占比 26.21%，患者的平均年龄为 46.94（10-80 岁），经分析发现其携带 HBV 的基因 型包括基因型 B 和基因型 C 两种，感染率分别为 8.71％和 91.29％，之后对耐药 相关突变位于 HBV P 基因的 RT 区域进行测序分析。 以 1320 例天津地区慢性乙型肝炎患者为研究对象，对所有患者的临床资料 进行突变分析，包括 rt80，rt169，rt173，rt180，rt181，rt184，rt194，rt196，rt202， rt204，rt207，rt213，rt214，rt215，rt236，rt237，rt238 和 rt250，其中以 rtM204 突变率最多，占 24.25％，其次为 rt180（14.97％）和 rt181（12.43％）。之后， 我们进一步分析了不同 HBV 基因型、性别和年龄在各个位点突变所占的比例。 rtA181 位点 ADV 相关突变在基因型 C 中的百分比显着高于基因型 B（13.11％ 比 4.25％，p