Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 8710-2:2011

Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 8710-2:2011. Tiêu chuẩn về Bệnh thủy sản - quy trình chẩn đoán - phần 2: bệnh hoại tử thần kinh ở cá biển. Tiêu chuẩn này quy định quy trình chẩn đoán bệnh hoại tử thần kinh ở cá biển. Mời các bạn tham khảo.

TCVN TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8710-2:2011 Xuất lần BỆNH THỦY SẢN – QUY TRÌNH CHẨN ĐỐN – PHẦN 2: BỆNH HOẠI TỬ THẦN KINH Ở CÁ BIỂN Aquatic animal disease – Diagnostic procedure – Part 2: Viral nervous necrosis (VNN) disease in marine fish HÀ NỘI – 2011 TCVN 8710-2:2011 Lời nói đầu TCVN 8710-2:2011 Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp Phát triển nơng thơn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học Cơng nghệ công bố TCVN 8710-2:2011 TCVN 8710-2:2011 TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8710-2:2011 Bệnh thủy sản – Quy trình chẩn đốn – Phần 2: Bệnh hoại tử thần kinh cá biển Aquatic animal disease – Diagnostic procedure – Part 2: Viral nervous necrosis (VNN) disease in marine fish CẢNH BÁO – Việc áp dụng tiêu chuẩn liên quan ñến vật liệu, thiết bị thao tác gây nguy hiểm Tiêu chuẩn ñưa ñược hết tất vấn ñề an tồn liên quan đến việc sử dụng chúng Người sử dụng tiêu chuẩn phải tự thiết lập thao tác an tồn, sức khỏe thích hợp xác ñịnh khả áp dụng giới hạn quy ñịnh trước sử dụng tiêu chuẩn Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn quy định quy trình chẩn đốn bệnh hoại tử thần kinh (VNN) cá biển Thuật ngữ ñịnh nghĩa Trong tiêu chuẩn sử dụng thuật ngữ ñịnh nghĩa sau ñây: Bệnh hoại tử thần kinh cá biển (viral nervous necrosis disease in marine fish) Bệnh truyền nhiễm nguy hiểm gây vi rút thuộc giống Betanodavirus họ Nodaviridae Khi cá bị cảm nhiễm, vi rút có kích thước nhỏ 25 nm đến 30 nm, khơng có màng bao, cấu trúc di truyền ARN chuỗi đơn (+ARN) CHÚ THÍCH: Hiện có kiểu gen Betanodavirus gây bệnh VNN, phân loại thành: SJNNV (striped jack nevous necrosis virus), TPNNV (tiger puffer nervous necrosis virus), RGNNV (red-spotted grouper nervous necrosis virus) BFNNV (barfin flounder nervous necrosis virus) TCVN 8710-2:2011 Phương pháp chẩn đốn 3.1 Chẩn đốn lâm sàng 3.1.1 Dịch tễ học Hiện nay, có khoảng 30 loài cá biển thuộc 16 họ nhiễm VNN Vi rút gây bệnh VNN lây truyền theo chiều dọc (từ mẹ sang con) lây truyền theo trục ngang qua dòng nước, lây truyền từ cá thể bị bệnh sang cá thể khỏe mạnh bể, chúng lây lan qua dụng cụ vận chuyển cá sản phẩm từ cá bị nhiễm vi rút từ nơi ñến nơi khác Ở Việt Nam bệnh VNN có gần quanh năm bùng phát mạnh từ tháng ñến tháng 10, đặc biệt mưa nhiều Nhiệt độ thích hợp cho phát triển bệnh 25 ºC ñến 30 ºC, tỷ lệ chết lên ñến 100 % 3.1.2 Triệu chứng lâm sàng Dấu hiệu bệnh lý ñiển hình cá nhiễm VNN biểu thần kinh như: bơi lội khơng bình thường (bơi vòng tròn, bơi ngửa, bơi hỗn loạn khơng định hướng…), bỏ ăn, da tối màu, trương bóng tỷ lệ chết lớn Cơ quan đích Betanodavirus thường xuất mơ não võng mạc cá bị bệnh Giai ñoạn cấp tính thường xuất trại ương giống ấu trùng (từ 10 ngày tuổi ñến 25 ngày tuổi) Cá giống bỏ ăn, cá chết rải rác, bơi khơng bình thường, bơi lội mạnh khơng định hướng, đầu lao xuống Cá chết hấp hối hầu hết bóng trương phồng, có xung huyết Cá bệnh hoạt ñộng yếu ñầu treo mặt nước nằm ñáy bể ñáy lồng Triệu chứng tăng dần quần ñàn nhiễm bệnh Cá chết sau khoảng từ ngày đến ngày sau có dấu hiệu bệnh Trong lồng, cá lớn (trên 150 g) bị bệnh VNN có triệu chứng tỷ lệ chết giảm Cá thường chuyển màu ñen bơi chậm chạp với bóng trương phồng khơng có vết bệnh đầu Giải phẫu quan nội tạng bình thường ruột khơng có thức ăn 3.2 Chẩn đốn phòng thí nghiệm 3.2.1 Phương pháp RT PCR (reverse transcription polymerase chain reaction) 3.2.1.1 Nguyên tắc Phương pháp PCR (polymerase chain reaction) dựa hoạt ñộng ADN polymerase tổng hợp nên mạch từ mạch khn, có tham gia mồi, bốn loại nucleotit gồm adenin (dATP), thymin (dTTP), guanin (dGTP), cytocin (dCTP), dùng ñể khuếch đại đoạn ADN đích thơng qua chu kì ln TCVN 8710-2:2011 nhiệt Để thực phản ứng khuếch đại ADN đích cần có q trình: biến tính, bắt cặp kéo dài mạch tổng hợp mạch RT PCR phương pháp PCR mà nucleic axit đích ARN Để có thực PCR trước hết ARN đích phải phiên mã ngược (RT- reverse transcription) thành cADN mồi ñặc hiệu cho phản ứng Giai ñoạn phiên mã ngược RT, enzym ñược sử dụng Reverse Transcriptase Đây loại enzym không chịu nhiệt, sử dụng mạch ARN mạch khuôn ñể tổng hợp nên sợi ADN bổ sung (cADN) có tham mồi, dNTP dung dịch ñệm cho phản ứng Có hai phương pháp thực RT PCR, RT PCR bước RT PCR hai bước Trong quy trình này, phương pháp PCR bước thực khuếch đại ARN đích 3.2.1.2 Thuốc thử vật liệu thử Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích sử dụng nước cất hai lần khử ion nước có độ tinh khiết tương đương khơng có ARNase, trừ có quy ñịnh khác – Trizol; – Cloroform; – Isopropanol; – Cồn 75 % 95 %; – Dung dịch TBE X Dung dịch ñệm TBE ñậm ñặc 10 lần (Tris - axit boric - EDTA 10X): Hòa tan 108 g Tris 55 g axit boric 600 mL nước Thêm 40 mL EDTA 0,5 M thêm nước cho đủ lít Hấp vơ trùng 121 oC 15 min, bảo quản nhiệt độ phòng Khi sử dụng, thêm 900 ml nước vào 100 ml dung dịch TBE gốc (10X) thành dung dịch TBE 1X – Dung dịch EDTA (etylen diamin tetra axetic) 0,5 M Hòa tan 93,05 g EDTA 350 mL nước, chỉnh pH 8,0 dung dịch NaOH nồng ñộ M Thêm nước cho đủ 500 ml Hấp vơ trùng 121 oC 15 Bảo quản nhiệt độ phòng – Dung dịch DEPC Dung dịch di-etypyrocacbonat 0,1 % thể tích, lắc trộn khoảng 10 Sau để qua đêm bình kín, nới lỏng nắp hấp khử trùng 121 °C 15 min, bảo quản nhiệt ñộ –20 °C TCVN 8710-2:2011 – Dung dịch TE (Tris - EDTA) Chuẩn bị dung dịch chứa Tris [tris (hydroxymetyl) aminometan] 10 mM EDTA mM, dùng HCl ñể chỉnh pH 7,6 – Dung dịch TBE 1X TAE 1X Thêm 900 ml nước vào 100 ml dung dịch TAE gốc (10X) dung dịch TBE gốc (10X) – AMV RT(Reverse Transcriptase); – Hỗn hợp phản ứng RT-PCR; – Dung dịch ñệm tải mẫu ADN ñậm ñặc lần (loading dye 6X); – Thang chuẩn ADN (ADN marker) gồm có thang 100 bp; 200 bp; 300bp; 400 bp; 500 bp; 1000 bp; 1500 bp; – Etidi bromua (EtBr); – Gel agarose; 3.2.1.3 Thiết bị, dụng cụ Sử dụng thiết bị, dụng cụ phòng thử nghiệm chẩn đốn bệnh cụ thể sau: – Tủ lạnh – Tủ lạnh âm sâu, hoạt ñộng nhiệt ñộ -20 ºC; – Máy li tâm, hoạt động với vận tốc 13000 r/min – Máy lắc trộn; – Cân phân tích, cân xác đến 0,1 mg; – Đèn cồn; – Khay hay hộp ñể ñựng ñá lạnh; – Micropipet ñơn kênh có dải từ 0,5 µl đến 10 µl, từ µl ñến 20 µl, từ 10 µl ñến 100 µl, từ 100 µl đến 1000 µl; – Giá eppendorf có kích thước 0,2 ml 1,5 ml; – Bộ kéo panh vơ trùng, chày nghiền mẫu, bút đánh dấu, sổ ghi chép; TCVN 8710-2:2011 – Hộp ñựng giấy thấm lau tay, gang tay, trang; – Hộp ñựng ñầu típ micropipet loại; – Máy PCR; – Bếp điện lò vi sóng; – Ống đong, dung tích 100 ml; 500 ml; 1000 ml; – Bình nón chịu nhiệt, dung tích 250 ml; – Bộ điện di gồm nguồn máng chạy ñiện di; – Buồng ñổ gel; – Bàn ñọc gel (UV); – Giấy parafin 3.2.1.4 Lấy mẫu Cá bột: lấy (20 con) Cá giống: ñến con, lấy phần trước ñầu (20 con) Cá lớn: lấy não, mắt, trứng sẹ Lượng mẫu lấy ñể tách chiết ARN khoảng 20 mg, dùng cá sống, tiến hành làm mẫu cố ñịnh cồn 95 % ñể làm sau 3.2.1.5 Cách tiến hành 3.2.1.5.1 Tách chiết ARN CHÚ THÍCH: Có nhiều quy trình tách chiết ARN từ mơ động vật theo hướng dẫn nhà sản xuất Hiện có nhiều thuốc thử kít thương mại hữu ích cho việc tách chiết ARN…) Người sử dụng lựa chọn kít thích hợp an tồn theo hướng dẫn nhà sản xuất Phương pháp tách chiết ARN trizol: Cho 20 mg mẫu vào ống Eppendorf 1,5 ml Nếu mẫu ñược cố ñịnh cồn 95 %, cần làm khô cồn cách ñổ cồn dốc ngược tờ giấy lọc, để khơ tự nhiên Cho vào ống Eppendorf có chứa mẫu khoảng 100 µl đến 200 µl dung dịch trizol (lượng mẫu không 10 % trizol) TCVN 8710-2:2011 Nghiền nhỏ mịn chày nghiền, sau thêm vào khoảng 550 µl đến 650 µl dung dịch trizol nghiền tiếp ñến nhuyễn Giữ nhiệt độ phòng đến Ly tâm 12000 r/min thời gian 10 min, sau chuyển dịch sang ống Eppendorf mới, nhỏ thêm 200 µl cloroform/1 ml trizol Lắc cẩn thận tay 15 s Ủ 15 oC ñến 30 oC từ ñến Ly tâm 12000 r/min từ oC ñến oC 15 min, sau chuyển phần phía sang ống Eppendorf 1,5 ml Thêm 500 µl dung dịch isopropanol/1 ml trizol, ủ 15 oC ñến 30 oC 10 Ly tâm 12000 r/min oC 10 min, sau rút bỏ isopropanol Rửa phần viên etanol 75 %; ml etanol 75 %/1 ml trizol Trộn ñều máy vortex ly tâm 7500 r/min oC, sau rút bỏ etanol Làm khơ phần viên Hòa tan ARN nước tinh khiết DEPC (dietyl pyrocarbonat) với lượng khoảng từ 50 µl đến 100 µl tùy thuộc vào lượng ARN tách chiết ñược CẢNH BÁO AN TỒN: Việc tách chiết ARN sử dụng hố chất nguy hiểm có khả gây hại thao tác không cẩn thận Do vậy, nên tránh tiếp xúc trực tiếp với da hít phải hố chất Ln ln đeo gang tay, trang, mặc quần áo bảo hộ thực thao tác 3.2.1.5.2 Tiến hành phản ứng RT PCR 3.2.1.5.2.1 Cặp mồi sử dụng phản ứng RT PCR Phản ứng khuếch ñại ñược thực máy luân nhiệt theo phương pháp RT PCR bước, sử dụng cặp mồi khuếch đại đoạn gen vùng T4 mã hố protein vỏ chủng SSJNNV R3: 5'-CGA-GTC-AAC-ACG-GGT-GAA-GA-3' F2: 5'-CGT-GTC-AGT-CAT-GTG-TCG-CT-3' Chuẩn bị mồi: – Mồi trạng thái đơng khơ phải ñược ly tâm ngắn ñể mồi lắng xuống ñáy ống trước mở hồn ngun Lần nên dùng đệm TE để hồn ngun mồi nồng độ 200 pmol/µL làm gốc 10 TCVN 8710-2:2011 – Mồi sử dụng nồng độ 20 pmol/µL: pha lỗng mồi gốc nước khơng có nuclease (10 µl mồi gốc 90 µl nước) 3.2.1.5.2.2 Chuẩn bị phản ứng Tùy theo điều kiện phòng thí nghiệm chọn lựa hỗn hợp Mix phản ứng cho phù hợp sử dụng theo hướng dẫn nhà sản xuất Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng theo số mẫu chẩn đốn, cộng thêm mẫu ñối chứng dương mẫu ñối chứng âm, trộn chung vào ống Eppendorf Sau hút 22,5 µl hỗn hợp phản ứng vào ống Eppendorf 0,2 ml Ghi kí hiệu mẫu lên nắp ống Eppendorf, chứng dương chứng âm 3.2.1.5.2.3 Hỗn hợp phản ứng RT PCR bước Thêm 2,5 µl ARN mạch khn (tách chiết ñược) vào ống PCR chứa sẵn 22,5 µl hỗn hợp phản ứng RT PCR để thu 25 µl hỗn hợp có thành phần sau: dNTP loại có nồng độ mM; mồi R3 có nồng độ 0,5 µM pmol; mồi F2 có nồng độ 0,1 µM pmol; dung dịch ñệm cho phản ứng RT PCR; ADN polymerase chịu nhiệt (0,625 U); enzym phiên mã ngược AMV reverse transcriptase (2,5 U); Nhiều hỗn hợp phản ứng thương mại có chứa sẵn thành phần cho tổng hợp ADN từ ARN Ví dụ hỗn hợp phản ứng sử dụng Mix RT PCR độ đậm đặc lần (2X), có thành phần: Tfl ADN polymerase, dNTP, magie sulfat dung dịch ñệm phản ứng, enzym phiên mã ngược AMV RT Bảng – Ví dụ hỗn hợp phản ứng RT PCR Thành phần Thể tích cho mẫu, Nồng ñộ cuối µl RT PCR Master Mix, 2X 12,5 1X Mồi F2 0,125 (20 µM) 0,1 µM Mồi R3 0,625 (20 µM) 0,5 µM ARN mạch khn 2,5 AMV RT(Reverse Transcriptase) (5 U) 0,5 Nước 8,45 11 TCVN 8710-2:2011 Chu kỳ luân nhiệt: Bảng - Chu kì luân nhiệt phản ứng RT PCR Bước Nhiệt ñộ/thời gian Tạo cADN 45 oC/45 Biến tính 94 oC/2 Biến tính 94 oC/40 s Kéo dài mạch 55 oC/40 s Kéo dài mạch 72 ºC/40 s Số chu kỳ 35 chu kì 72 ºC/5 Giữ ổn định ºC Giữ ổn ñịnh CHÚ Ý: Mẫu nguyên liệu cho phản ứng PCR cần ñặt khay ñá lạnh suốt trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng CẢNH BÁO: Do chất ARN dễ bị phân huỷ môi trường enzym ARNase tiết từ vi sinh vật, môi trường chai, lọ, thiết bị, dụng cụ dung dịch Enzym ARNase bền, khó bị phân huỷ nhiệt độ Vì vậy, tất dụng cụ, thiết bị, thuốc thử dùng RT PCR phải tuyệt đối vơ trùng 3.2.1.5.3 Chạy ñiện di 3.2.1.5.3.1 Chuẩn bị gel Pha thạch nồng ñộ từ 1,5 % ñến % agarose dung dịch đệm TBE 1X TAE 1X vào bình nón 250 ml, lắc cho tan Sau cho vào lò vi sóng đun đến sơi, đợi đến nhiệt ñộ giảm xuống khoảng 40 oC ñến 50 oC, cho vào µl ethidi bromua/100 ml Lắc nhẹ tránh tạo bọt để ethidi bromua tan Chuẩn bị khn đổ thạch, đặt lược vào khn, đổ thạch vào khn Tiến hành đổ vào gel (chú ý khơng nên ñổ gel dày 0,8 cm) Khi gel đơng lại tiến hành gỡ lược khỏi gel Chuyển gel vào máng ñiện di, ñổ dung dịch ñệm (TBE 1X TAE 1X) loại với dung dịch ñã ñun agaroza) vào máng ñiện di ngập gel 12 TCVN 8710-2:2011 3.2.1.5.3.2 Điện di Hút 10 µl sản phẩm PCR nhỏ vào giếng gel Khi thực ñiện di, chạy kèm theo AND marker để dự đốn kích thước sản phẩm khuếch đại Hút 10 µl thang ADN vào giếng gel Điện di hiệu ñiện 100 volt đến 150 volt (quan sát thấy bóng khí lên từ hai phía điện cực máy điện di sau nối ñiện) Khi quan sát thấy màu xanh ñậm thuốc nhuộm cách giếng khoảng 2/3 chiều dài bảng thạch agaroza, dừng q trình điện di CHÚ Ý: Trong trường hợp Master Mix khơng có sẵn đệm tải mẫu tiến hành điện di nhỏ µl loading dye 6X lên giấy parafin, hút 10 µl sản phẩm PCR ra, nhỏ vào trộn đều, sau lấy khoảng 10 µl nhỏ vào giếng gel 3.2.1.5.4 Đọc kết Sau ñiện di xong, ñọc kết bàn ñọc UV, ñọc kết với tia UV bước sóng 302 nm Đối chiếu vạch sáng mẫu với vạch sáng từ thang ADN, mẫu kiểm chứng dương tính mẫu kiểm chứng âm tính để đưa kết luận Giếng Vạch 427 bp Kết Các vạch sáng rõ ràng Điện di tốt Khơng Khơng ngoại nhiễm chứng âm tính Có Bị ngoại nhiễm Mẫu kiểm Có Hỗn hợp phản ứng RT-PCR tốt Thang ADN Mẫu kiểm chứng dương tính Khơng Mẫu kiểm chứng dương tính hỏng enzym hỏng Có Dương tính với VNN Khơng Âm tính với VNN Mẫu thử Kết mẫu thử dương tính khi: Xuất vạch sáng có kích thước kích thước giống mẫu đối chứng dương có kích thước 427 bp, thang ADN phân vạch rõ ràng, mẫu đối chứng âm khơng có vạch sáng Kết mẫu thử âm tính khơng có vạch sáng kích thước 427 bp Khơng có vạch sáng mẫu đối chứng âm tính, có vạch sáng mẫu ñối chứng dương tính Thang ADN phân vạch rõ ràng 13 TCVN 8710-2:2011 3.2.2 Phương pháp mô học 3.2.2.1 Thuốc thử vật liệu thử Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích sử dụng nước cất hai lần khử ion nước có độ tinh khiết tương đương khơng có ARNase, trừ có quy ñịnh khác – Dung dịch Bouin (xem A.1); – Dung dịch formalin 10 % (có bổ sung % muối) (xem A.2); – Thuốc nhuộm hematoxylin (xem A.3); – Thuốc nhuộm eosin (xem A.4); – Cồn 70 %, 75 %, 90 % cồn tuyệt ñối; – Parafin; – Xylen; – Keo dán, ví dụ Bom Canada 3.2.2.2 Thiết bị, dụng cụ Sử dụng thiết bị, dụng cụ phòng thử nghiệm chẩn đốn bệnh cụ thể sau: – Kính giải phẫu – Bộ đồ giải phẫu gồm dụng cụ panh, rùi nhọn, giải phẫu kéo loại, lam kính lamen – Lọ nhỏ cố định mẫu – Bình rót parafin – Bộ phận làm lạnh mẫu – Máy cắt mẫu microtome – Nồi nước có chỉnh nhiệt độ – Tủ ấm bàn sấy mẫu – Kính hiển vi quang học – Cassete 14 TCVN 8710-2:2011 – Khung ñúc mẫu 3.2.2.3 Lấy mẫu Thu mẫu cá có dấu hiệu khơng bình thường, Cá giống bỏ ăn, cá chết rải rác, bơi khơng bình thường, bơi lội mạnh khơng định hướng, đầu lao xuống Khơng dùng cá chết cá bảo quản đá ñể cắt mô 3.2.2.4 Cách tiến hành 3.2.2.4.1 Chuẩn bị mẫu Đối với cá lớn lấy phần ñầu não, mắt cắt thành lát mỏng (0,5 cm) trước ngâm dung dịch cố định formalin 10 % (có bổ sung % muối) dung dịch Bouin nhiệt độ phòng Tỷ lệ mẫu dung dịch cố ñịnh 1/10, ngâm 24 h ñến 72 h phụ thuộc vào kích thước mẫu, sau chuyển sang dung dịch bảo quản cồn 70 % Đối với cá bột cố định con, cá giống lấy phần ñầu não, mắt ngâm dung dịch cố ñịnh từ 12 h ñến 24 h Sau ñó cố ñịnh cồn 70 % nhiệt ñộ phòng 3.2.2.4.2 Khử mẫu cố định Ngâm cồn 90 % hai lần, thời gian 30 ñến 60 lần Sau ngâm cồn tuyệt đối hai lần, thời gian 30 ñến 60 lần 3.2.2.4.3 Làm mẫu Ngâm sang lọ xylen ñể 30 ñến 60 Ngâm sang lọ xylen ñể 30 ñến 60 Sau ñó ngâm tẩm parafin hai lần, lần 56 ºC ñến 58 ºC h Đúc khuôn: Đặt mẫu ñã thấm parafin vào khuôn ñổ parafin tập trung vào mặt khn để cắt tốt Làm lạnh mẫu bàn lạnh ñể tủ lạnh 3.2.2.4.4 Cắt mẫu Cắt gọt khối block parafin vuông, mặt cắt phẳng, ñể mặt khay ñá Đặt mặt khối block parafin song song với mép lưỡi dao, cắt chiều dày lát cắt từ µm đến µm Chọn lát cắt tiêu phẳng thả vào nồi nước nhiệt ñộ nước từ 30 ºC ñến 35 ºC; sau dùng lam kính vớt lát cắt tiêu Để khô 15 TCVN 8710-2:2011 3.2.2.4.5 Nhuộm tiêu H&E Tẩy parafin cách ngâm xylen hai lần, lần từ đến min, sau ngâm cồn tuyệt ñối, cồn 90 % cồn 70 %, lần ngâm từ ñến đem rửa vòi nước chảy từ ñến Ngâm thuốc nhuộm haematoxylin từ đến sau rửa vòi chảy từ đến tiếp tục ngâm thuốc nhuộm eosin từ ñến Làm nước mẫu qua thang nồng ñộ cồn 75 %, cồn 90 % cồn tuyệt ñối, bước từ ñến min, chuyển sang xylen hai lần (mỗi lần từ ñến min), gắn lamen keo dán, ví dụ Bom Canada Để khơ soi kính 3.2.2.4.6 Đọc kết Soi tiêu từ độ phóng đại thấp đến ñộ phóng ñại cao Tổ chức não mắt cá bị bệnh xuất nhiều không bào màu trắng xám có đường kính từ µm đến 10 µm Trong mô não mắt cá tồn tượng hoại tử, xâm nhập tế bào máu vào vùng mô bị hoại tử Kết luận Cá ñược xác ñịnh nhiễm bệnh VNN có đặc điểm dịch tễ học, triệu chứng lâm sàng kết dương tính thu từ hai phương pháp sau: – Phản ứng RT PCR phát vi rút dương tính; – Mẫu cắt mơ có bệnh tích vi rút VNN 16 TCVN 8710-2:2011 Phụ lục A (Quy ñịnh) Thành phần chuẩn bị dung dịch thuốc thử A.1 Dung dịch Bouin: Axit picric (dung dịch bão hoà): 750 ml Formalin (formaldehyd 37 %) : 250 ml Axit axetic ñậm ñặc: 50 ml A.2 Dung dịch formalin 10 % (có bổ sung % muối) Formalin (formaldehyd 37 %): 100 ml Dinatri hydro phosphat (Na2HPO4): 6,5 g Natri hydro phosphat (NaH2PO4): 0,4 g Natri clorua (NaCl): 20 g Nước: 900 ml A.3 Thuốc nhuộm hematoxylin (dung dịch hematoxylin – Mayer) Hematoxylin dạng tinh thể: 1g Natri iodat: 0,2 g Amoni alum [NH4Al(SO4)2] kali alum [KAl(SO4)2]: 50 g Axit axetic: 1g Cloral hydrat: 50 g Nước: 1000 ml Hoà tan hematoxylin nước, sau ñó cho natri iodat amoni alum kali alum, hoà tan, tiếp tục cho axit axetic chloral hydrat lọc qua giấy lọc 17 TCVN 8710-2:2011 Bảo quản dung dịch ñã pha chai tối màu A.4 Thuốc nhuộm eosin Eosin Y: 1g Cồn 70 %: lít Axit axetic băng: ml Thêm từ giọt ñến giọt axit axetic vào cồn 70 % Hoà tan eosin cồn, sau cho thêm axit axetic lọc qua giấy lọc Bảo quản dung dịch ñã pha chai tối màu 18 TCVN 8710-2:2011 Thư mục tài liệu tham khảo [1] Bùi Quang Tề cộng 1998., Bệnh học thủy sản [2] Danayadol, Y., Direkbusarakom, S and Supamattaya, K., 1995 Viral nervous necrosis in brownspotted grouper, Epinephelus malabaricus, cultured in Thailand In: Diseases in Asian Aquaculture II, M Shariff, [3] Frerichs G.N., Tweedie A.; Starkey W.G.; Richards R.H., 2000 Temperature, pH, and electrolyte sensitivity, and heat, UV and disinfectant inactivation of sea bass (Dicentrarchus labrax) neuropathy nodavirus Aquaculture 185: p 13-24 [4] Fukuda, Y., Nguyen, H.D., Furuhashi, M., Nakai, T., 1996 Mass mortality of cultured sevenband grouper, Epinephelus septemfasciatus, associated with viral nervous necrosis Fish Pathology 31: p 165–170 [5] Iwamoto, T., Nakai, T., Mori, K., Arimoto, M., Furusawa, I., 2000 Cloning of the fish cell line SSN1 for piscine nodaviruses Diseases of Aquatic Organisms 43: p 81– 89 [6] Johansen, R., Grove, S., Svendsen, A.K., Modahl, I., Dannevig, B.H, A., 2004 Sequential study of pathological findings in Alantic halibut, Hippoglossus hippoglossus (L.), throughout one year after an acute outbreak of viral encephalopathy and retinopathy Journal of Fish Diseases 27: p 327–341 [7] Mladineo, I., 2003 The immunohistochemical study of nodavirus changes in larval, juvenile and adult sea bass tissue Journal Applied Ichthyology 19: p 366–370 [8] Mori, K., Mangyoku, T., Iwamoto, T., Arimoto, M., Tanaka, S., Nakai, T., 2003 Serological relationships among genotypic variants of Betanodavirus Diseases of Aquatic Organisms 57: p 19–26 [9] Munday, B.L., Kwang, J., Moody, N., 2002 Betanodavirus infections of teleost fish: a review Journal of Fish Diseases, 25: 127–142 [10] Nishizawa, T., K Mori, T Nakai, I Furusawa, and K Muroga 1994 Polymerase chain reaction (PCR) amplification of RNA of striped jack nervous necrosis virus (SJNNV) Dis Aquat Org 18:103–107 19 TCVN 8710-2:2011 [11] Nishizawa, T., Furuhashi, M., Nagai, T., Nakai, T., Muroga, K., 1997 Genomic classification of fish nodaviruses by molecular phylogenetic analysis of the coat protein gene Applied and Environmental Microbiology 64: p 1633–1636 [12] Sohn, S.G and Park, M.A., 1998 Viral diseases of cultured marine fish and shrimp in Korea Fish Pathology 33 : p 189-192 [13] Tanaka, S., Takagi, M., Miyazaki, T.,2004 Histopathological studies on viral nervous necrosis of sevenband grouper, Epinephelus septemfasciatus Thunburg, at the grow-out stage Journal of Fish Diseases 27: p 385–399 [14] Toyohiko Nishizawa, Koh-ichiro Mori, Toshihiro Nakail, Iwao Furusawa, Kiyokuni Muroga 1994 Polymerase chain reaction (PCR) amplification of RNA of striped jack nervous necrosis virus (SJNNV) Dis aquat Org., 18: p 103-107 [15] Manual of Diagnostic Test for Aquatic Animals, 2006 Viral encephalopathy and retinopathy _ 20 ... chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học Cơng nghệ cơng bố TCVN 8710-2:2011 TCVN 8710-2:2011 TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8710-2:2011 Bệnh thủy sản – Quy trình chẩn ñoán – Phần 2: Bệnh hoại.. .TCVN 8710-2:2011 Lời nói đầu TCVN 8710-2:2011 Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thơn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định,... – Việc áp dụng tiêu chuẩn liên quan ñến vật liệu, thiết bị thao tác gây nguy hiểm Tiêu chuẩn ñưa ñược hết tất vấn ñề an tồn liên quan đến việc sử dụng chúng Người sử dụng tiêu chuẩn phải tự thiết