Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 8710-4:2011 trình bày nội dung về bệnh thủy sản - quy trình chẩn đoán - phần 4: bệnh đầu vàng ở tôm. Mời các bạn cùng tham khảo để nắm bắt nội dung của tiêu chuẩn này.
TCVN TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8710-4:2011 Xuất lần BỆNH THỦY SẢN – QUY TRÌNH CHẨN ĐỐN – PHẦN 4: BỆNH ĐẦU VÀNG Ở TÔM Aquatic animal disease – Diagnostic procedure – Part 4: Yellow head disease HÀ NỘI – 2011 TCVN 8710-4:2011 Lời nói đầu TCVN 8710-4:2011 Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp Phát triển nơng thơn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm ñịnh, Bộ Khoa học Công nghệ công bố TCVN 8710-4:2011 TCVN 8710-4:2011 TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8710-4:2011 Bệnh thủy sản – Quy trình chẩn đốn – Phần 4: Bệnh đầu vàng tôm Aquatic animal disease – Diagnostic procedure – Part 4: Yellow head disease CẢNH BÁO – Việc áp dụng tiêu chuẩn liên quan đến vật liệu, thiết bị thao tác gây nguy hiểm Tiêu chuẩn khơng thể đưa hết tất vấn đề an tồn liên quan đến việc sử dụng chúng Người sử dụng tiêu chuẩn phải tự thiết lập thao tác an toàn sức khỏe thích hợp xác định khả áp dụng giới hạn quy ñịnh trước sử dụng tiêu chuẩn Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn quy ñịnh quy trình chẩn đốn bệnh đầu vàng vi rút tôm he Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn Đối với tài liệu viện dẫn ghi năm cơng bố áp dụng phiên ñược nêu Đối với tài liệu viện dẫn khơng ghi năm cơng bố áp dụng phiên nhất, bao gồm sửa ñổi, bổ sung (nếu có) TCVN 8378:2010, Tơm sản phẩm tơm – Phát virut gây bệnh ñầu vàng (YHV) kỹ thuật phản ứng chuỗi trùng hợp-phiên mã ngược (RT-PCR) Thuật ngữ ñịnh nghĩa Trong tiêu chuẩn sử dụng thuật ngữ ñịnh nghĩa nêu TCVN 8378:2010 TCVN 8710-4:2011 Phương pháp chẩn đốn 4.1 Chẩn ñoán lâm sàng 4.1.1 Dịch tễ học Bệnh xảy thành dịch chủ yếu tôm sú (Penaeus monodon) tôm he chân trắng (P vannamei) Tuy nhiên, số lồi tơm tự nhiên có tượng cảm nhiễm với bệnh P japonicus, P merguiensis, P stylirostris, P setiferus, Metapenaeus ensis, Palaemon styliferus Euphasia superba YHV cảm nhiễm giai ñoạn phát triển khác chu kì sống tơm: tơm mẹ, tơm ấu trùng, hậu ấu trùng, tôm giống, tôm thịt Nhưng bệnh thường xảy giai đoạn tơm giống từ 40 ngày đến 70 ngày tuổi YHV gây tỉ lệ chết đến 100 % vòng ngày ñến ngày kể từ quan sát thấy dấu hiệu bệnh lý Phương thức lan truyền bệnh: Bệnh thường lây lan thông qua vật trung gian bị nhiễm bệnh Palaemon styliferus Acetes sp, qua nguồn nước có chứa vi rút đến tơm ni Bệnh lây lan theo cá thể nhiễm bệnh mãn tính lan truyền sang cháu q trình sinh sản 4.1.2 Triệu chứng lâm sàng Tôm bị bệnh thường giảm ăn Trong ngày thứ nhất, số lờ ñờ hôn mê bới tầng mặt gần ao Những tơm có phần đầu ngực màu vàng Sang ngày thứ hai, số tôm bị bệnh tăng lên Từ ngày thứ ba từ dừng ăn, tượng chết bắt đầu cuối chết 100 % sau ngày đến 10 ngày Tơm bệnh thường bơi gần tầng mặt gần bờ Gan tụy chuyển màu vàng nên nhìn giáp đầu ngực có màu vàng nhạt, mang tơm bệnh có màu trắng, vàng nhạt hay nâu Trong số trường hợp tôm không xuất dấu hiệu bệnh lí quan sát tế bào gan tụy, tế bào máu, quan lympho, ruột, mang, tuyến an ten, mô liên kết thấy thể vùi tế bào chất, nhân tế bào co rúm, số trường hợp vỡ thành nhiều mảnh 4.2 Chẩn đốn phòng thí nghiệm 4.2.1 Phương pháp RT PCR, theo TCVN 8378:2010 4.2.2 Phương pháp mô bệnh học 4.2.2.1 Lấy mẫu Thu lấy mẫu tơm từ Postlarvae đến tơm trưởng thành Mẫu tơm phải sống tình trạng hấp hối TCVN 8710-4:2011 Thu mẫu tôm có biểu bệnh có dấu hiệu khơng bình thường, có phần đầu ngực màu vàng, màu sắc thể nhợt nhạt, mang tơm bệnh có màu trắng, vàng nhạt hay nâu Khơng dùng tơm chết tơm bảo quản lạnh để cắt mơ 4.2.2.2 Thuốc thử vật liệu thử Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích sử dụng nước cất hai lần khử ion nước có độ tinh khiết tương đương, trừ có quy định khác – Dung dịch Davidson (xem A.1) – Thuốc nhuộm hematoxylin (xem A.2) – Thuốc nhuộm eosin (xem A.3) – Cồn 70 %, 80 %, 95 % cồn tuyệt ñối – Parafin – Xylen – Keo dán, ví dụ Bom Canada 4.2.2.3 Thiết bị, dụng cụ Sử dụng thiết bị, dụng cụ phòng thử nghiệm chẩn đốn bệnh – Kính giải phẫu – Bộ ñồ giải phẫu gồm dụng cụ panh, rùi nhọn, giải phẫu kéo loại, lam kính lamen – Lọ nhỏ cố định mẫu – Bình rót parafin – Bộ phận làm lạnh mẫu – Máy cắt mẫu microtome – Nồi nước có chỉnh nhiệt độ – Tủ ấm bàn sấy mẫu – Kính hiển vi quang học – Cassete – Khung ñúc mẫu TCVN 8710-4:2011 4.2.2.4 Cách tiến hành 4.2.2.4.1 Chuẩn bị mẫu Cố ñịnh mẫu dung dịch Davidson Tỷ lệ mẫu dung dịch cố định 1/10 Đối với tơm ấu trùng tơm postlavare (hậu ấu trùng) cố ñịnh dung dịch từ 12 h ñến 24 h Thu lấy khoảng từ 30 ñến 50 bể Sau cố định cồn 70 % nhiệt độ phòng Đối với tơm lớn lấy mang, dày biểu mô vỏ cho vào lọ có chứa dung dịch Davidson Thu lấy khoảng từ ñến 10 ao Ngâm 24 h đến 72 h phụ thuộc vào kích thước mẫu, sau bảo quản cồn 70 % nhiệt độ phòng 4.2.2.4.2 Khử mẫu cố định Ngâm cồn 90 % hai lần, thời gian 30 đến 60 lần Sau ngâm cồn tuyệt ñối hai lần, thời gian 30 ñến 60 lần 4.2.2.4.3 Làm mẫu Ngâm sang xylen ñể 30 ñến 60 Ngâm sang xylen ñể 30 ñến 60 Ngâm tẩm parafin lần, lần 56 ºC ñến 58 ºC h Đúc khn: Đặt mẫu thấm parafin vào khn đổ parafin tập trung vào mặt khn để cắt tốt Làm lạnh mẫu bàn lạnh ñể tủ lạnh 4.2.2.4.4 Cắt mẫu Cắt gọt khối block parafin vuông, mặt cắt phẳng, ñể mặt khay ñá Đặt mặt khối block nến song song với mép lưỡi dao, cắt chiều dày lát cắt từ µm đến µm Chọn lát cắt tiêu phẳng thả vào nồi nước nhiệt ñộ nước từ 30 ºC ñến 35 ºC; sau dùng lam kính vớt lát cắt tiêu Để khô 4.2.2.4.5 Nhuộm tiêu H&E Tẩy parafin cách ngâm xylen hai lần, lần từ ñến min, sau ñó ngâm cồn tuyệt ñối, cồn 90 % cồn 70 %, lần ngâm từ ñến ñem rửa vòi nước chảy từ đến TCVN 8710-4:2011 Ngâm thuốc nhuộm haematoxylin từ đến sau rửa vòi chảy từ ñến tiếp tục ngâm thuốc nhuộm eosin từ ñến Làm nước mẫu qua thang nồng ñộ cồn 75 %, cồn 90 % cồn tuyệt ñối, bước từ ñến min, chuyển sang xylen hai lần (mỗi lần từ ñến min), gắn lamen keo dán, ví dụ Bom Canada Để khơ soi kính 4.2.2.4.6 Đọc kết Soi kính hiển vi từ vật kính có độ phóng đại thấp đến vật kính có độ phóng đại cao Khi tơm bị bệnh đầu vàng, kiểm tra mơ bệnh học tế bào có tượng hoại tử nhiều quan xuất thể vùi tế bào chất, nhân thối hố kết đặc bắt màu đậm phân mảnh nhiều tế bào khác nhau: hệ bạch huyết (lymphoid), tế bào mang, tế bào kẽ gan tụy, tế bào biểu bì ruột Cơ quan tạo máu (haemolymphoid) có nhiều nhân tế bào thối hóa kết đặc bắt màu đỏ đậm, kích thước khác Kết luận Tơm xác định nhiễm bệnh vi rút đầu vàng có đặc điểm dịch tễ học, triệu chứng lâm sàng kết dương tính thu từ hai phương pháp sau: – Phản ứng PCR phát vi rút dương tính; – Mẫu cắt mơ có bệnh tích vi rút đầu vàng TCVN 8710-4:2011 Phụ lục A (Quy ñịnh) Thành phần chuẩn bị dung dịch thuốc thử A.1 Dung dịch Davidson Cồn 95 %: 330 ml Formalin (formaldehyd 37 %): 220 ml Axit axetic ñậm ñặc: 115 ml Nước: 335 ml A.2 Thuốc nhuộm hematoxylin (dung dịch hematoxylin – Mayer) Hematoxylin dạng tinh thể: 1g Natri iodat: 0,2 g Amoni alum [NH4Al(SO4)2] kali alum [KAl(SO4)2]: 50 g Axit xitric: 1g Cloral hydrat: 50 g Nước: 1000 ml Hoà tan hematoxylin nước, sau cho natri iodat amoni alum kali alum, hoà tan, tiếp tục cho axit xitric chloral hydrat lọc qua giấy lọc Bảo quản dung dịch ñã pha chai tối màu A.3 Thuốc nhuộm eosin Eosin Y: 1g Cồn 70 %: lít Axit axetic băng: ml Thêm từ giọt ñến giọt axit axetic vào cồn 70 % Hoà tan eosin cồn, sau cho thêm axit axetic lọc qua giấy lọc Bảo quản dung dịch ñã pha chai tối màu 10 TCVN 8710-4:2011 Thư mục tài liệu tham khảo [1] Chainarong Wongteerasupayal, S.S., Joan E Vickers, Anutara krajamorn krajamorn., Vichai Boonsaengl., Sakol Panyiml., Anchalee Tassanakajon., Boonsirm Withyachumnarnkul., Flegel T W 1995 Yellow-head virus of Penaeus monodon is an RNA virus Dis Aquat Org 22: p 45-50 [2] Chantanachookin, C., Boonyaratpalin, S., Kasornchandra, J., Sataporn, D., Ekpanithanpong, U., Supamataya, K., Sriurairatana, S., Flegel, T.W 1993 Histology and ultrastructure reveal a new granulomas-like virus in Penaeus monodon affected by yellow-head disease Dis Aquat Org 17: p 145–157 [3] FAO/NACA 2001 Asia Diagnostic Guide to Aquatic Animal Diseases FAO Fish Pap No.402/2: p 237 pp [4] Lightner, D.V.E 1996 A Handbook of Shrimp Pathology and Diagnostic Procedures for Diseases ofCultured Penaeid Shrimp World Aquaculture Society: p 305 pp [5] Limsuwan, C 1991 Handbook for Cultivation of Black Tiger Prawns Tamsetakit Co Ltd [6] Priyanjalie K.M Wijegoonawardanea, Jeff A Cowleya, Peter J.Walkera 2008 Consensus RTnested PCR detection of yellow head complex genotypes in penaeid shrimp Journal of Virological Methods [7] OIE, 2009 Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animals [8] Spann, K.M., Vickers, J.E., Lester, R.J.G 1995 Lymphoid organ virus of Penaeus monodon from Australia Dis Aquat Org 23: p 127–134 [9] Spann, K.M., Cowley, J.A., Walker, P.J., Lester, R.J.G 1997 A yellow-head-like virus from Penaeus monodon cultured in Australia Dis Aquat Org 31: p 169–179 [10] Walker, P.J., Flegel, T.W., Boonsaeng, V., Lightner, D.V., Tang, K., Loh, P.C., Chang, P.S.,Bonami, J.R., Cowley, J.A., Snijder, E., Enjuanes, L, Roniviridae Fauquet, C.M., Mayo, M.A., Maniloff, J., Desselberger, U., Ball, L.A, 2004 Virus Taxonomy, Eighth Report of the ICTV Elsevier/Academic Press,: p 973–977 [11] Walker, P.J., Cowley, J.A., Spann, K.M., Hodgson, R.A.J., Hall, M.R., Withyachumnarnkul, B., Yellow head complex viruses: transmission cycles and topographical distribution in the AsiaPacific region Browdy, C.L., Jory, D.E., 2001 The NewWave: Proceedings of the Special Session on Sustainable Shrimp Farming: p 227–237 [12] Wongteerasupaya C., Boonsaeng V., Panyim S., Tassanakajon A., Withyachumnarnkul B & Flegel T.W 1997 Detection of yellow-head virus (YHV) of Penaeus monodon by RT-PCR amplification Dis Aquat Org., 31, 181–186 _ 11 ... chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học Cơng nghệ cơng bố TCVN 8710-4:2011 TCVN 8710-4:2011 TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8710-4:2011 Bệnh thủy sản – Quy trình chẩn đốn – Phần 4: Bệnh đầu.. .TCVN 8710-4:2011 Lời nói đầu TCVN 8710-4:2011 Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thơn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định,... Việc áp dụng tiêu chuẩn liên quan đến vật liệu, thiết bị thao tác gây nguy hiểm Tiêu chuẩn khơng thể đưa hết tất vấn ñề an toàn liên quan ñến việc sử dụng chúng Người sử dụng tiêu chuẩn phải tự