Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 5284:1990 về Thức ăn chăn nuôi - Phương pháp xác định hàm lượng caroten áp dụng cho các loại thức ăn chăn nuôi có nguồn gốc thực vật và quy định phương pháp xác định hàm lượng Caroten.
TIÊU CHUẨN VIỆT NAM TCVN 5284:1990 THỨC ĂN CHĂN NUÔI PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CAROTEN Animal feeding stuffs Method for determination of carotin content Tiêu chuẩn áp dụng cho loại thức ăn chăn ni có nguồn gốc thực vật quy định phương pháp xác định hàm lượng Caroten Nguyên tắc phương pháp Phương pháp dựa khả hòa tan Caroten dung môi hữu cho mầu vàng, cường độ mầu dung dịch tỷ lệ thuận với hàm lượng Caroten đo máy quang điện hay quang phổ kế bước sóng 440 - 450nm Vì Caroten tinh thể dễ bị oxy hố khơng khí nên việc chuẩn bị thang chuẩn thường sử dụng dung dịch kali bicromat hay azobenzen Trong dung môi hữu (ete petrol hay xăng) khơng Caroten mà sắc tố diệp lục, xanthofin chất khác bị hòa tan Vì cần thiết phải tách chúng khỏi Caroten phương pháp sắc ký hấp phụ Lấy mẫu Tiến hành lấy mẫu thử theo TCVN 4325-86 Dụng cụ hoá chất 3.1 Dụng cụ - Máy cắt mẫu thực vật, bảo đảm phần cắt nhận có độ dài - 3cm - Máy nghiền mẫu phòng thí nghiệm - Máy so màu quang điện có kính lọc màu xanh ứng với bước sóng 440 - 450nm hay quang phổ kế - Cân phân tích có độ xác đến 0,001g; - Cân kỹ thuật có độ xác đến 0,05g; - Cối chày sứ - ống đong dung tích 100ml - Burét dung tích 50ml - Bình định mức dung tích 100ml; 1000ml; - Bình nón có nút mài dung tích 100 - 150; 200ml - Bình Bunden; - Dụng cụ có hút chân khơng; - Cột hấp phụ (ống Allin) đường kính - 4cm; - Đũa thủy tinh 3.2 Hoá chất - Kali bicromat, TKHH; - Azobenzen, TKHH; - Ete petrol hay xăng trắng, TK; - Oxyt nhôm (khan), TK; - Oxyt canxi (khan), TKPT; - Natri sunfat (khan), TKPT; - Natri bicacbonat, TKPT hay TKHH; - Cồn etylic 96°; - Nước cất hay nước có độ tinh khiết tương đương; Chú thích: Tất cơng việc tiến hành với ete phải thực tủ hút Khi bảo quản ete, xăng tiến hành thí nghiệm cần cách ly hoàn toàn với chất dễ cháy chất nổ Chuẩn bị thử 4.1 Chuẩn bị oxyt nhơm có độ ẩm 10% Thêm 100 ml nước cất vào 900g oxyt nhôm khan trộn Thuốc thử bảo quản lọ có nút mài sử dụng để phân tích khơng sớm ngày sau lúc chuẩn bị 4.2 Chuẩn bị cột hấp phụ (ống Allin) Đặt vào chỗ hẹp ống Allin nút bơng hút ẩm đổ lên - 5cm chất hấp phụ - oxyt nhơm có độ ẩm 10% Dùng đũa thủy tinh dồn nhẹ lớp oxyt nhơm xuống, phủ lên miếng bơng mỏng đổ tiếp lên - 2cm natri sunfat khan Lắp ống hấp phụ vào nút bình Bunden Trước chạy sắc ký cần đổ lượng ete petrol lên hút nhẹ chân không ete petrol thấm ướt cột hấp phụ, chảy xuống phía lại phía chất hấp phụ 4.3 Chuẩn bị dung dịch gốc Kali bicromat Hồ tan 0,720 g kali bicromat (đã sấy khơ đến khối lượng không đổi 140°C) nước cất đưa thể tích dung dịch đến vạch mức 1000 ml 1ml dung dịch tương ứng theo màu sắc với 0,00416 mg Caroten Dung dịch bảo quản với thời hạn năm sau chuẩn bị 4.4 Chuẩn bị dung dịch gốc azobenzen Hòa tan 14,5 mg azobenzen tinh thể 100 ml cồn etylic 96 °, 1ml dung dịch tương ứng theo màu sắc với 0,00235 mg Caroten 4.5 Chuẩn bị thang dung dịch chuẩn Dùng burét cho vào bình định mức dung tích 100 ml 10; 20; 30; 40; 50 ml dung dịch gốc Kali bicromat đưa thể tích đến vạch mức nước cất, cẩn thận trộn Thời hạn sử dụng dung dịch chuẩn không tháng Đo mật độ quang dung dịch chuẩn máy so màu với cuvét có chiều dày 20-30 mm bước sóng 440 - 450 nm Dung dịch đối chứng nước cất Từ kết mật độ quang thu tiến hành xây dựng đồ thị chuẩn với trục hồnh thể tích dung dịch gốc Kali bicromat lấy để chuẩn bị thang chuẩn trục tung giá trị mật độ quang tương ứng dung dịch chuẩn Tiến hành thử 5.1 Mẫu cỏ khô, rơm rạ cắt máy hay kéo thành đoạn có chiều dài - cm, trộn mảnh nilon sau từ chỗ khác lấy lượng mẫu 100 g nghiền nhỏ máy nghiền Những loại bột từ thân xanh có kích thước hạt 1-2 mm phân tích khơng cần phải nghiền Từ lượng mẫu trộn đều, cân 1- g mẫu với độ xác đến 0,05 g chuyển vào cối sứ nghiền nát cẩn thận với 5-10 g cát hay thủy tinh giã nhỏ 5.2 Mẫu thức ăn giàu nước (thức ăn xanh, củ quả, thức ăn ủ) cắt nhỏ, đảo mảnh nilon từ nhiều chỗ khác cân lượng - g mẫu với độ xác đến 0,05 g cho vào cối sứ chứa sẵn 5-10 g cát hay thủy tinh giã nhỏ Nếu mẫu thức ăn ủ chua hay ủ héo cho thêm lượng xô đa đầu mũi dao nhỏ Nhanh chóng nghiền nát hỗn hợp cối sứ với thời gian khơng - phút Để nhận khối lượng rời, khử nước mẫu cần thêm vào 15-25 g natri sunfat khan, đảo 5.3 Chuyển cẩn thận lượng mẫu xử lý theo mục 5.1, 5.2 vào bình nón dung tích 100-150ml rót vào 20-25ml ete petrol Rửa cối chày sứ vài lần lượng không nhiều ete petrol chuyển vào bình nón Dùng đũa thủy tinh khuấy đậy nắp bình lại để yên 20 - 24 bóng tối 5.4 Sau thời gian chiết suất, cẩn thận chắt dịch chiết lên cột sắc ký chuẩn bị sẵn (theo mục 4.2) tiến hành lọc chân khơng yếu Rửa phần lại bình nón lượng không nhiều ete petrol lại đổ lên cột Việc rửa tiến hành vài lần đến dung dịch chảy trở nên không màu 5.5 Đo thể tích dung dịch ete petrol có chứa Caroten thu từ bình Buđen ống đong hay xi lanh Sau đo mật độ quang dung dịch máy so màu với cuvét có chiều dày 2030 mm bước sóng 440 - 450 nm Dung dịch đối chứng ete petrol Trong trình phân tích lượng đáng kể Caroten bị tác dụng mạnh ánh sáng phá hủy khơng khí việc đo mật độ quang dịch chiết cần tiến hành khoảng thời gian ngắn 5.6 Nếu mật độ quang dịch chiết lớn 0,6 cần pha lỗng cách lấy xác 25 ml dịch chiết cho vào bình định mức 50 ml thêm tiếp ete petrol đến vạch mức Kết trường hợp nhân lên gấp đơi Tính tốn kết 6.1 Hàm lượng Caroten (X) biểu thị mg 1kg mẫu tính theo cơng thức Trong đó: a - Lượng tương đương với dung dịch gốc tìm thấy đồ thị chuẩn, tính ml 0,00416 - Hệ số chuyển 1ml dung dịch gốc kali bicromat lượng tương đương với Caroten, mg; V - Thể tích dịch lọc mẫu thử sau qua cột hấp phụ, tính ml; b - Thể tích dung dịch chuẩn, tính ml; m - Khối lượng mẫu thử, tính g; 1000 - Hệ số chuyển 1kg mẫu 6.2 Kết cuối trị số trung bình hai lần xác định song song Sự sai khác cho phép lần xác định song song (d,) phụ thuộc vào hàm lượng Caroten có mẫu không vượt qua trị số ghi bảng sau: Dạng mẫu X, mg/kg d, mg/kg Dạng mẫu X, mg/kg d, mg/kg Bột từ thân xanh đến 80 81 - 120 10 Thức ăn đến 10 121-150 12 xanh, 11- 20 151-180 14 Thức ăn 21-30 181-230 cao Cỏ khô 16 đến 10 11-20 21-30 cao ủ chua, 31- 40 10 ủ héo 41 - 50 cao 12 6.3 Hàm lượng Caroten (X1) biểu thị mg kg dạng vật chất khô tính theo cơng thức: Trong đó: X - Hàm lượng Caroten kg mẫu dạng khô không khí tính mg; W - Độ ẩm mẫu, tính % ... nổ Chuẩn bị thử 4.1 Chuẩn bị oxyt nhơm có độ ẩm 10% Thêm 100 ml nước cất vào 900g oxyt nhôm khan trộn Thuốc thử bảo quản lọ có nút mài sử dụng để phân tích khơng sớm ngày sau lúc chuẩn bị 4.2 Chuẩn. .. hạn năm sau chuẩn bị 4.4 Chuẩn bị dung dịch gốc azobenzen Hòa tan 14,5 mg azobenzen tinh thể 100 ml cồn etylic 96 °, 1ml dung dịch tương ứng theo màu sắc với 0,00235 mg Caroten 4.5 Chuẩn bị thang... với trục hoành thể tích dung dịch gốc Kali bicromat lấy để chuẩn bị thang chuẩn trục tung giá trị mật độ quang tương ứng dung dịch chuẩn Tiến hành thử 5.1 Mẫu cỏ khô, rơm rạ cắt máy hay kéo thành