Quy chuẩn kỹ thuật Quốc gia QCVN 01-17:2010/BNNPTNT quy định việc điều tra theo dõi sinh vật gây hại trên giống cây có múi nhập khẩu trong khu cách ly kiểm dịch thực vật trên phạm vi cả nước. Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết.
CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM QCVN 01-17 : 2010/BNN PTNT QUY CHUẨN KỸ THUẬT QUỐC GIA VỀ QUY TRÌNH ĐIỀU TRA, THEO DÕI SINH VẬT GÂY HẠI TRÊN GIỐNG CÂY CÓ MÚI NHẬP KHẨU TRONG KHU CÁCH LY KIỂM DỊCH THỰC VẬT National technical regulation on the procedure for monitoring of pests on imported citrus varieties in isolated quarantine area QCVN 01-17 : 2010/BNN PTNT HÀ NỘI - 2010 Lời nói đầu QCVN 01-17 : 2010/BNNPTNT Ban Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia kiểm dịch thực vật biên soạn, Cục Bảo vệ thực vật trình duyệt, Bộ Nơng nghiệp PTNT ban hành Thông tư số 26./2010/TT-BNNPTNT ngày 27 tháng năm 2010 QCVN 01-17 : 2010/BNN PTNT QUY CHUẨN KỸ THUẬT QUỐC GIA QUY TRÌNH ĐIỀU TRA THEO DÕI SINH VẬT GÂY HẠI TRÊN GIỐNG CÂY CÓ MÚI NHẬP KHẨU TRONG KHU CÁCH LY KIỂM DỊCH THỰC VẬT National technical regulation on the procedure for monitoring of pests on imported citrus varieties in isolated quarantine area I QUY ĐỊNH CHUNG 1.1 Phạm vi điều chỉnh Quy chuẩn quy định việc điều tra theo dõi sinh vật gây hại giống có múi nhập khu cách ly kiểm dịch thực vật phạm vi nước 1.2 Đối tượng áp dụng Các tổ chức, cá nhân nhập giống có múi 1.3 Giải thích từ ngữ Quy chuẩn sử dụng thuật ngữ định nghĩa Tiêu chuẩn Việt Nam - TCVN 3937:2007 thuật ngữ định nghĩa sau: 1.3.1 Cây có múi Là loài thực vật thuộc họ Rutaceae 1.3.2 Giống có múi Bao gồm hạt, phận có múi dùng để nhân giống 1.3.3 Giống có múi nhập Là giống có múi nhập từ nước ngồi vào nước để trồng với mục đích khác 1.3.4 Khu cách ly kiểm dịch thực vật Là nơi gieo trồng thực vật, bảo quản sản phẩm thực vật cách ly hồn tồn với mơi trường bên ngồi thời gian kiểm dịch 1.3.5 Kiểm dịch sau nhập Kiểm dịch áp dụng chuyến hàng sau nhập 1.3.6 Sinh vật hại tiềm ẩn Là sinh vật gây hại tài nguyên thực vật chưa biểu triệu chứng ẩn triệu chứng mà mắt thường thiết bị kiểm tra thô sơ chưa phát 1.4 Tài liệu viện dẫn - TCVN 4731- 89: Kiểm dịch thực vật - Phương pháp lấy mẫu - Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 3937:2007 Kiểm dịch thực vật -Thuật ngữ định nghĩa QCVN 01-17 : 2010/BNN PTNT II CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH 2.1 Ghi nhận thông tin mẫu giống Khi nhận mẫu giống phải ghi chép đầy đủ thông tin mẫu giống có múi nhập vào sổ lưu mẫu: Tên giống (Tên thông thường tên khoa học) Nơi xuất xứ Cơ quan nhập Cửa nhập Khối lượng số lượng lơ hàng Nơi gieo trồng Tình hình sinh vật gây hại phát cửa 2.2 Kiểm tra sinh vật gây hại mẫu giống có múi trước gieo trồng - Kiểm tra trùng nhện: Kiểm tra nơi mà côn trùng, nhện cư trú vết nứt, lồi lõm, khe kẽ thân, cành hom - Kiểm tra tuyến trùng: Quan sát triệu chứng tuyến trùng rễ lấy mẫu kiểm tra rây lọc tĩnh - Kiểm tra nấm bệnh: Xem xét triệu chứng nấm hại tất phận giống có múi 2.3 Kiểm tra sinh vật hại tiềm ẩn - Sau trồng phải tiến hành điều tra định kỳ ngày lần điều tra bổ sung tình hình sinh vật gây hại - Tiến hành kiểm tra triệu chứng biểu rõ ràng sinh vật gây hại cây, đặc biệt tượng còi cọc, biến dạng biến màu - Thu thập mẫu sinh vật gây hại phòng thí nghiệm để phân tích giám định 2.4 Các biện pháp kỹ thuật phân tích giám định sinh vật gây hại - Đối với nấm vi khuẩn: Dùng phương pháp ly tâm, để ẩm, nuôi cấy môi trường nhân tạo, soi trực tiếp kính hiển vi để kiểm tra - Đối với tuyến trùng: Dùng phương pháp rây lọc tĩnh để tách lọc sau giám định phương pháp so sánh hình thái - Đối với số bệnh tác nhân là: Vi khuẩn, virus, viroid, phytoplasma sử dụng phương pháp sau: + Men liên kết miễn dịch (Enzyme-Linked Immuno-Sorbent AssaysELISA) + Chỉ thị sinh học (Biological Indexing) - Phương pháp Polymerase Chain Reaction (PCR) sử dụng để giám định tất loài sinh vật gây hại 2.5 Thời gian theo dõi: 02 năm Khi hết thời hạn theo dõi tiến hành huỷ chất cách thiêu huỷ QCVN 01-17 : 2010/BNN PTNT III BÁO CÁO KẾT QUẢ - Thành phần sinh vật gây hại trước gieo trồng - Thành phần sinh vật gây hại sau gieo trồng - Dịch hại thuộc diện điều chỉnh Việt Nam sinh vật gây hại lạ giống có múi nhập - Báo cáo kết theo dõi sinh vật gây hại giống có múi nhập khu cách ly kiểm dịch (Phụ lục 1) IV KẾT LUẬN - Xử lý lô giống nhiễm dịch hại thuộc diện điều chỉnh Việt Nam - Cấp giấy chứng nhận kiểm dịch thực vật sau nhập cho lơ giống có múi khơng bị nhiễm dịch hại thuộc diện điều chỉnh Việt Nam sinh vật gây hại lạ khác QCVN 01-17 : 2010/BNN PTNT Phụ lục Mẫu báo cáo kết theo dõi sinh vật gây hại giống có múi nhập khu cách ly kiểm dịch thực vật CỤC BẢO VỆ THỰC VẬT CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Trung tâm KDTV SNK Số / KDTV Độc lập - Tự - Hạnh phúc KẾT QUẢ THEO DÕI SINH VẬT GÂY HẠI TRÊN GIỐNG CÂY NHẬP KHẨU TRONG KHU CÁCH LY KIỂM DỊCH THỰC VẬT Tên Tổ chức/ cá nhân nhập khẩu: (Địa chỉ, số điện thoại, fax) Thông báo số: Nhập từ: Cửa đến (đơn vị gửi mẫu): Khối lượng mẫu gửi: Số lượng mẫu gửi: Tên cán kiểm dịch thực vật Tên giống Địa điểm gieo trồng Phương pháp điều tra theo dõi Số lượng mẫu gieo trồng Số lượng mẫu điều tra Số lượng mẫu bị nhiễm Quan sát Tên dịch hại, mật độ Tên dịch hại thuộc diện điều chỉnh, mật độ Kết luận: GIÁM ĐỐC TRUNG TÂM KDTV SAU NHẬP KHẨU (Ký tên, đóng dấu) QCVN 01-17 : 2010/BNN PTNT Phụ lục Một số phương pháp sử dụng để giám định bệnh giống có múi nhập Phương pháp ELISA Là phương pháp thử nghiệm miễn dịch liên kết men để giám định tác nhân gây bệnh dựa vào phản ứng đặc hiệu kháng nguyên-kháng thể Phương pháp ELISA gồm có DAS –ELISA Indirect –ELISA Cả hai phương pháp thực nguyên tắc chung phương pháp ELISA dựa vào phản ứng đặc hiệu kháng nguyên-kháng thể có nghĩa kháng nguyên liên kết với kháng thể quy trình bao gồm bước sau: + Bước 1: Phủ Bản ELISA kháng nguyên (đối với Indirect – ELISA) kháng thể đặc hiệu virus (Đối với DAS - ELISA) + Bước 2: Cố định kháng thể đặc hiệu kháng nguyên (đối với Indirect ELISA) kháng nguyên đặc hiệu kháng thể (DAS - ELISA) vào ELISA + Bước 3: Gắn kháng thể đặc hiệu kháng thể (đối với Indirect - ELISA) kháng thể đặc hiệu kháng nguyên (Đối với DAS - ELISA) có liên kết Enzim + Bước 4: Cố định chất đánh giá kết Bộ Kit thơng dụng để kiểm tra sử dụng cho bệnh sau: - Xylella fastidiosa - Spiroplasma citri (Xoắn khuẩn) - Satsuma dwarf ilarvirus (Lùn Satsuma) - Citrus tristeza closterovirus (Tàn lụi cam quýt) - Citrus tatter leaf cappillovirus (Virus nhỏ cam quýt) - Các loại kít khác Phương pháp PCR Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) Kary Mullis cộng (Mỹ) phát minh năm 1985 kể từ tạo nên tác động to lớn nghiên cứu sinh học toàn giới Ðây phương pháp in vitro sử dụng cặp mồi để tổng hợp số lượng lớn từ trình tự ADN đặc biệt dựa hoạt động enzyme polymerase Phương pháp PCR dựa hoạt động ADN polymerase trình tổng hợp ADN từ mạch khuôn Tất ADN polymerase cần mồi, đoạn ADN ngắn có khả bắt cặp bổ sung với đầu mạch khuôn Ðoạn mồi sau nối dài nhờ hoạt động AND polymerase để hình thành mạch hoàn chỉnh Một phản ứng PCR chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, chu kỳ gồm ba giai đoạn: - Giai đoạn biến tính: tách chuỗi ADN từ mạch đôi thành dạng mạch đơn QCVN 01-17 : 2010/BNN PTNT - Giai đoạn bắt cặp: gắn cặp mồi đặc trưng theo nguyên tắc bổ sung - Giai đoạn kéo dài chuỗi: tổng hợp chuỗi AND giống chuỗi AND gốc Sau sản phẩm PCR đem chạy điện di để xác định tác nhân gây bệnh dựa vào trọng lư ợng phân tử AND so với đối chứng Nhờ phương pháp này, xác định đư ợc tác nhân gây bệnh nồng độ chúng thấp Phương pháp thị 3.1 Một số loài thị thông dụng Cây thị Tác nhân gây bệnh Citrus sinensis Psorosis complex (Tổ hợp Virus bệnh đốm) Spiroplasma citri Liberobacter asiaticum Liberobacter africanum Citrus limon Citrus tristeza closterovirus, yellows strain (Virus tàn lụi cam quýt) Citrus leaf rugose virus (Virus quăn cam quýt) Citrus variegation ilarvirus Citrus medica Citrus exocortis viroid (Viroid vẩy vỏ) Citrus aurantifolia Citrus tristeza closterovirus-stem pitting strain (Virus tàn lụi cam quýt) Citrus vein enation virus (Virus biến dạng gân lá) P trifoliata X C Citrus tatter leaf capillovirus (Nhỏ cam quýt) sinensis 3.2 Các ngưỡng nhiệt độ cần ý giám định bệnh thị Dùng thị để xác định bệnh ẩn có múi hai mức nhiệt độ: * Nhiệt độ 18 - 25oC (tốt 20 - 22 oC) cho tác nhân gây bệnh sau: - Viruses Citrus tristeza closterovirus (Virus tàn lụi có múi) - Citrus veinenation virus (Virus biến dạng gân có múi) - Citrus varegation ilarvirus - Citrus leaf rugose virus (Vius quăn có múi) - Citrus tatter leaf cappillovirus (Virus bé có múi) * Nhiệt độ 25 - 35oC (tốt 30 - 35 oC) cho tác nhân gây bệnh: - Citrus exocortis viroid (Viroid vảy vỏ có múi) - Citrus cachexia viroid (Viroid mạch dẫn có múi) - Spiroplasma citri (xoắn khuẩn cam quýt) - Liberobacter asiaticum QCVN 01-17 : 2010/BNN PTNT - Liberobacter africanum 3.3 Một số triệu chứng bệnh thị Dải nhiệt độ Lạnh Nóng Bệnh Citrus leaf rugose (Quăn lá) Citrus variegation (Biến dạng gân lá) Crinkly leaf (Giòn lá) Cristacortis Impietratura Psorosis A (Đốm dòng A) Psorosis B (Đốm dòng B) Tatter Leaf / Stunt (Nhỏ lá/lùn) Tristeza Stempitting (Đốm tàn lụi) Tristeza - Yellows (Vàng tàn lụi) Vein Enation / Woody Gall (Biến dạng/u thân gỗ) Exocortis Greening and Dieback (Greening khô cành) Stubborn Sweet Eureka Orange Lemon (Cam (Chanh ngọt) Eureka) CF West Indian Lime (Chanh Tây Ấn) LP Citrange cv Rusk or Swingle (Chanh, bưởi, quýt) Etrog Citron (Chanh yên) AS AS LP OL OL CF OL CM &S CVF&W P LY & S VE LE VY & LM CM AS - Asteroid Spots (Đốm dạng sao) CM-Chlorotic Mottling (Đốm màu) LM - Leaf Mottle (Đốm lá) LY - Leaf Yellowing (Vàng lá) S - Stunting (Lùn cây) VY - Vein Yellowing (Vàng gân) CVF - Chlorotic Vein Flecking (biến vàng gân) CF - Chlorotic flecks (Đốm vàng) LE - Leaf Epinasty LP - Leaf Puckering (Nhăn lá) OL - Oak Leaf Pattern (Dải sùi lá) VE - Vein Enation (Biến dạng gân) WP - Wood Pitting (Đốm thân gỗ) QCVN 01-17 : 2010/BNN PTNT Phụ lục Phương pháp nhân giống, chăm sóc bảo quản sở sau nhập Nhân giống, chăm sóc bảo quản sở sau nhập 1.1 Nhân gốc ghép thị Các hạt gieo để làm thị sinh học gốc ghép lấy từ sở bệnh có uy tín, hạt đem gieo khay để nhiệt độ 20 - 25 oC Cây thị chanh yên (Etrog) nhân giống từ cành nhiệt độ 30 - 35oC Trước sử dụng làm thị gốc ghép khơng bón thúc cho Sau chuyển chúng vào chậu túi nilon có dung tích 2,5 l có chứa giá thể Nếu biểu triệu chứng thiếu dinh dưỡng bón bổ sung hỗn hợp chất độn với tỷ lệ máu khô bột xương: 1Dolomit Sau chanh Yên (Etrog) số loại cam trồng điều kiện nhiệt độ 30 - 35 oC 1.2 Nhân giống từ mắt ghép Hai nhân giống từ mắt ghép gốc chanh sần Ba đến bốn tuần sau ghép mắt, cắt chồi nách chanh Sần để tập trung cho mắt ghép phát triển Chọn làm thị Nếu có u cầu tiến hành ghép đỉnh sinh trưởng Cây nhân lên từ thị trả lại cho chủ hàng Loại bỏ virus nhân giống Ghép đỉnh sinh trưởng kỹ thuật nhân dòng giống có múi loại bỏ bệnh, với khả tạo dòng Virus tác nhân gây bệnh khác Tất có múi phải ghép đỉnh sinh trưởng lần trước xuất khỏi sở Kiểm dịch sau nhập Các bước kiểm tra làm nhiều lần đến cho kết kiểm tra khẳng định bệnh Những gốc ghép sản xuất từ tổ chức giới có chứng nhận đạt tiêu chuẩn khơng cần phải ghép lại Việt Nam 2.1 Mắt ghép dùng ghép đỉnh sinh trưởng Việc ghép đỉnh sinh trưởng thực có mắt ghép thích hợp đưa tới Nếu có chồi ghép khơng thích hợp cho việc ghép ban đầu thời điểm nhập mắt ghép đưa đến điều kiện khơng thích hợp, mắt ghép ghép vào thân mẹ sau chọn mắt ghép thích hợp để ghép 2.2 Xử lý mắt ghép để ghép đỉnh sinh trưởng Tiệt trùng bề mặt mắt ghép trước bắt đầu ghép Nhúng mắt ghép dung dịch Ethanol 70 % phút, sau nhúng dung dịch Chlorin (Clo) 0,2 % Sodium hypochrorite 10 phút Bảo quản mắt 10 QCVN 01-17 : 2010/BNN PTNT ghép nhiệt độ 26 oC cát ẩm tiệt trùng với chu kỳ chiếu sáng 16 đến đem sử dụng 2.3 Sản xuất gốc ghép để ghép đỉnh sinh trưởng Sử dụng chanh ba lá, chanh sần Citrus grandis (Chỉ dùng cho giống bưởi Pomelo) làm gốc ghép Lấy hạt từ tươi sau rửa thịt Tách bỏ lớp vỏ hạt bảo quản giấy lọc ẩm đến đem sử dụng Khử trùng bề mặt hạt dung dịch Chlorin 0,5 % Sodium hypochrorite 10 phút Sau rửa kỹ nước tiệt trùng tối thiểu lần Đưa hạt vô trùng vào môi trường Agar để buồng cấy, sau đưa vào tủ ấm 26 oC bóng tối Nếu hạt khơng dùng sau tách khỏi quả, ta phơi giá đỡ Hạt Tiệt trùng bề mặt bảo quản cách nhúng dung dịch Chlorin % Sodium hypochrorite Sau tiến hành làm hạt tươi Hạt mọc sau - ngày, chanh sần đâm chồi nhanh chanh ba Chuẩn bị ống tuýp để trồng giữ mơi trường đồng có chứa mơi trường hỗn hợp Murshige Skoog + Đường + agar, tiệt trùng 121oC 15 phút Đặt hạt nảy mầm lên bề mặt agar ống tuýp nuôi cấy chồi bắt đầu mọc Khi chồi ghép đạt đến độ dài thích hợp - cm, sau 10 - 12 ngày đưa ống tuýp vào buồng tối - oC Chọn thẳng đưa vào buồng lạnh để ghép chồi đỉnh Thời gian lưu giữ năm 2.4 Ghép đỉnh sinh trưởng Ngâm dụng cụ cồn 70 % khoảng trước dùng Chuẩn bị mẩu dao cạo tra vào cán Nhúng dao cắt vào chất tẩy sau làm cồn hơ khơ lần cắt Không làm cháy lưỡi dao sau nhúng cồn Thay đổi lưỡi dao chúng bị cùn Tiệt trùng bề mặt cành ghép trực tiếp dung dịch Chlorin 0,5 % Sodium hypochrorite 5-10 phút, tuỳ thuộc vào điều kiện cành ghép Nếu chúng tiệt trùng trồng cát, chúng sử dụng Nếu chúng bị nhiễm bẩn đặt chúng vải xử lý dung dịch Chlorin 0,01 % Sodium hypochrorite phút sau rửa cẩn thận lần nước lọc Cắt tỉa mầm chồi bên, mở vết ghép hình chữ T tiến hành ghép Loại bỏ hết cành ghép để lộ mô phân sinh Sử dụng lưỡi dao cho mô phân sinh Đặt mô phân sinh lên vết ghép đóng nắp vết ghép lại Đặt giấy lọc trồng ống tuýp có hỗn hợp mơi trường Murshige Skoog + Đường + sắt hồ tan + Vitamin trắng Xử lý mơi trường nhiệt độ 121oC 10 phút Giữ nhiệt độ 28 oC với chu kỳ chiếu sáng 16 Chăm sóc tối thiểu - tuần dài Cây cần cắt tỉa mầm giai đoạn sinh trưởng ống tuýp chuyển vào môi trường 11 QCVN 01-17 : 2010/BNN PTNT 2.5 Chuyển ghép đỉnh sinh trưởng khỏi ống tuýp Sau - tuần, mắt ghép mọc chồi cm với lá, đưa khỏi ống tuýp; tỉa rễ chồi trồng chậu có chứa hỗn hợp chất độn Giữ điều kiện ánh sáng yếu tuần Duy trì ẩm độ cao vài ngày đầu cách dùng nhựa che phủ Khi cứng cáp ta loại bỏ dần nhựa che phủ Có thể sử dụng biện pháp tương tự thấy mắt ghép xanh chưa phát triển Hàng ngày tưới 2g/l Ca(NO3)2 Kiểm tra dòng ghép để khẳng định loại bỏ hết bệnh 2.6 Môi trường nuôi cấy 3.6 Môi trường nuôi cấy Môi trường Các hợp chất Hàm lượng Murashige & Skoog Rắn Lỏng KNO3 1,90 g/l 1,90 g/l NH4NO3 1,65 g/l 1,65 g/l CaCl2.2H2O 440 mg/l 440 mg/l MgSO4.7H2O 370 mg/l 370 mg/l KH2PO4 170 mg/l 170 mg/l MnSO4.H2O 16,9 mg/l 16,9 mg/l ZnSO4.7H2O 8,6 mg/l 8,6 mg/l H3BO3 6,2 mg/l 6,2 mg/l Kl 0,82 mg/l 0,82 mg/l Na2MoO4.2H2O 0,25 mg/l 0,25 mg/l CuSO4.5H2O 0,025 mg/l 0,025 mg/l CoCl2.6H2O 0,025 mg/l 0,025 mg/l Vitamin trắng Myo-I-Inositol 37,3 mg/l Nicotinic 27,8 mg/l Pyridoxine 100,0 mg/l Thiamine HCl 1,0 mg/l Sucrose 30 g/l 1,00,2 mg/l Agar 10 g/l 75 g/l 12 QCVN 01-17 : 2010/BNN PTNT TÀI LIỆU THAM KHẢO Pháp lệnh Bảo vệ Kiểm dịch thực vật số 11/2001/L/CTN Chủ tịch nước công bố ngày 8/8/2001 Nghị định 127/2007/NĐ-CP ngày 01/8/2007 Chính phủ Quy định chi tiết thi hành số điều Luật Tiêu chuẩn Quy chuẩn kỹ thuật Thông tư 23/2007/TT-BKHCN ngày 28/9/2007 Bộ Khoa học Công nghệ Hướng dẫn xây dựng, thẩm định ban hành quy chuẩn kỹ thuật Cục Bảo vệ thực vật (1996), Lý luận thực tiễn Kiểm dịch thực vật, Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội Trung tâm kiêm dịch thực vật Sau nhập I (2004); Sử dụng chất nhà trồng kiểm dịch thực vật số biện pháp xử lý khử trùng, Hà Nội L Smee and P.J Setchell - Post - entry Quarantine for Imported Plants - Australian Government Publishing Service Paul R Miller - Plant pothologist; Hazel L Pollard - Technical Information Specialist Multilingual Compendium of Plant Disease Viruses and Nematodes - Production and Distribution by American Phytopathological Society for The Unites Agency for International Development Incooperation with The Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture 13 ... thi hành số điều Luật Tiêu chuẩn Quy chuẩn kỹ thuật Thông tư 23/2007/TT-BKHCN ngày 28/9/2007 Bộ Khoa học Công nghệ Hướng dẫn xây dựng, thẩm định ban hành quy chuẩn kỹ thuật Cục Bảo vệ thực vật... PTNT ban hành Thông tư số 26./2010/TT-BNNPTNT ngày 27 tháng năm 2010 QCVN 01-17 : 2010/BNN PTNT QUY CHUẨN KỸ THUẬT QUỐC GIA QUY TRÌNH ĐIỀU TRA THEO DÕI SINH VẬT GÂY HẠI TRÊN GIỐNG CÂY CÓ MÚI NHẬP.. .QCVN 01-17 : 2010/BNN PTNT HÀ NỘI - 2010 Lời nói đầu QCVN 01-17 : 2010/BNNPTNT Ban Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia kiểm dịch thực vật biên soạn, Cục Bảo