Culture and Cryopreservation of Rat Ventral Mesencephalic Stem Cells

Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm nuôi cấy tăng sinh và bảo quản lạnh thành công tế bào gốc ngoại bì thần kinh não giữa phôi chuột cống trắng để tạo nguồn nơ ron tiết dopamin. Mời các bạn cùng tham khảo.

TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 Nguyễn Phúc Hồn*; Nguyễn Thị Bình*; Nguyễn Mạnh Hà* TÓM TẮT Nghiên cứu tiến hành nhằm nuôi cấy tăng sinh bảo quản lạnh tế bào gốc não phôi chuột cống trắng để tạo nguồn nơ ron tiết dopamin phục vụ điều trị bệnh Parkinson thực nghiệm Các tế bào gốc sàn não phôi chuột cống trắng 12,5 - 13,5 ngày tuổi phân lập nuôi cấy môi trường (DMEM/F12; 1:1) có bổ sung b-FGF2, EGF số yếu tố tăng trưởng khác Bảo quản lạnh tế bào mơi trường có bổ sung 10% DMSO Sau - ngày nuôi cấy, thu nơ ron, tế bào sao, tế bào nhánh Đa số tế bào dương tính với marker vimentin số nơ ron dương tính với marker thyroxin hydroxylase (TH) nhuộm hóa mơ miễn dịch Tỷ lệ sống tế bào sau bảo quản lạnh 64,9% * Từ khố: Tế bào gốc ngoại bì thần kinh não giữa; Nuôi cấy; Bảo quản lạnh Culture and Cryopreservation of Rat Ventral Mesencephalic Stem Cells Summary The aim of this research was to culture and cryopreserve rat ventral mesencephalon cells to treat Parkinson’s diseases in rat We have isolated rat ventral mesencephalic cells from rat embryonic days 12.5 - 13.5, then cultured them in the basic medium culture composed of DMEM/F12; 1:1, supplemented with b-FGF2, EGF and growth factors Then, harvest cells were cryopreserved in media with 10% DMSO Neuron, astrocyte, oligocyte expressed after - days in in vitro culture, some of them were positive with vimentine, TH by immunohistochemistry staining Survival cell rate after being frozen was 64,9% * Keywords: Ventral mesencephalic stem cells; Culture; Cryopreservation ĐẶT VẤN ĐỀ Trong năm gần đây, có nhiều kỹ thuật đ ứng dụng tái tạo, sửa chữa thay mô quan bị tổn thương Một số ứng dụng công nghệ tế bào gốc trị liệu Thực tế lâm sàng đ ứng dụng thành công công nghệ bảo quản lạnh tế bào gốc từ tủy xương, tế bào gốc trung mô hay tế bào gốc phôi… thời gian bảo quản lên tới vài chục năm với chi phí rẻ kỹ thuật đơn giản Khi cần người bệnh dùng tế bào gốc để điều trị bệnh như: bỏng, g y xương, teo cơ, tiểu đường, lơxemi, Alzeimer, Parkinson… [2] * Trường Đại học Y Hà Nội Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Phúc Hoàn (phuchoan85@gmail.com) Ngày nhận bài: 25/07/2017; Ngày phản biện đánh giá báo: 30/08/2017 Ngày báo đăng: 01/09/2017 Ý tưởng sử dụng tế bào gốc điều trị bệnh Parkinson đ năm 1980 Hơn nữa, việc cấy 188 ghép tế bào gốc có chức tiết dopamin vào n o động vật thực nghiệm bệnh nhân Parkinson tình nguyện đ TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 có nhiều thành cơng như: tế bào, mơ sống tốt não sau ghép có khả tiết dopamin, cải thiện triệu chứng bệnh lâm sàng Hiện nay, tế bào gốc thần kinh tiết dopamin phân lập từ nhiều nguồn: tế bào gốc não phôi, tế bào gốc phôi giai đoạn sớm (phôi nang) hay gần tế bào gốc vạn cảm ứng tế bào gốc cảm ứng tiết dopamin Trong số tế bào gốc não phôi tế bào gốc phôi giai đoạn sớm - phôi nang - sử dụng nhiều Vì vậy, song song với việc nuôi cấy để tăng sinh số lượng tế bào cần thiết cho cấy ghép, việc lưu giữ, bảo quản lạnh tế bào quan trọng để có sẵn nguồn tế bào mô điều trị Các kỹ thuật bảo quản lạnh không ngừng phát triển, đảm bảo chất lượng tế bào, mô nâng cao tỷ lệ sống tế bào sau thời gian dài lưu giữ [3] Với mục đích ni cấy tăng sinh lưu trữ lâu dài nguồn tế bào gốc ngoại bì thần kinh não (TBGNBTKNG), chúng tơi đ tiến hành nghiên cứu với mục tiêu: Nuôi cấy tăng sinh bảo quản lạnh thành công TBGNBTKNG phôi chuột cống trắng để tạo nguồn nơ ron tiết dopamin ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tƣợng nghiên cứu Chuột cống đực trưởng thành 600 phôi chuột cống trắng 12,5 - 13,5 ngày tuổi Phƣơng pháp nghiên cứu * Tạo phôi: Nhốt chuột đực với chuột qua đêm Sáng hôm sau làm phiến đồ âm đạo, thấy tinh trùng, chuột tính có thai 0,5 ngày * Phân lập TBGNBTKNG: Mổ chuột lấy tử cung chứa phôi, tách rời phơi phẫu tích lấy đoạn ống thần kinh chứa não Tách bỏ lớp ngoại bì da màng não, phẫu tích lấy sàn não giữa, sau dùng enzym dispase trypsin - EDTA để ly giải mô sàn não Tạo dịch treo tế bào phương pháp học Nhuộm dịch treo tế bào tryphan blue để xác định tỷ lệ tế bào sống mật độ tế bào buồng đếm hồng cầu * Nuôi cấy TBGNBTKNG: - Nuôi cấy dịch treo tế bào môi trường bản: DMEM/F12 (1:1 - invitrogen, Mỹ) có bổ sung thêm yếu tố: fetal bovin serum (FBS - invitrogen, Mỹ) 10%; insulin (25 ng/ml), progesteron (20 nM), putrescin (62 nM), muối selenit (30 nM); epithelial grow factor (EGF) 20 ng/ml basic fibroblast grow factor - (bFGF-2) (20 ng/ml); penicillin (100 IU/ml); streptomycin (100 µg/ml); amphotericin B (0,25 µg/ml) (Sigma, Mỹ) - Cấy TBGNBTKNG phơi chuột với mật độ 1,5 x 104/cm giếng nuôi cấy chai flask, tủ ấm 370C, 5% CO2 - Thay môi trường ngày/lần, đồng thời đánh giá phát triển tế bào qua kính hiển vi soi ngược độ phóng đại x10; x20 x40 * Bảo quản lạnh TBGNBTKNG: - Tách tế bào sau nuôi cấy khỏi chai flask trypsin - EDTA 0,05% 190 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 - Ly tâm hỗn hợp dịch treo tế bào 1.500 vòng/phút phút; lấy cặn rửa lại lần môi trường - Bổ sung thêm môi trường bản, đếm mật độ tế bào buồng đếm hồng cầu nhuộm tryphan blue đánh giá tỷ lệ tế bào sống - Bảo quản lạnh mẫu dịch treo tế bào mơi trường ni cấy có bổ sung 10% DMSO - Hạ nhiệt độ theo chương trình máy Minicool 10 (Air liquide, Pháp) - Bảo quản lạnh tế bào nitơ lỏng, nhiệt độ -1960C * Rã đơng tế bào: - Lấy tế bào từ bình nitơ ngâm vào cốc nước ấm 370C 15 phút - Dung dịch tế bào rửa chất bảo quản môi trường nuôi cấy lần - Nhuộm tryphan blue phần cặn tế bào thu để đánh giá tỷ lệ sống * Định danh tế bào sau nuôi cấy: - Nhuộm Giemsa: cố định tế bào sau nuôi cấy cồn ethylen 1000 phút Sau nhuộm dung dịch Giemsa phút Rửa nhiều lần nước cất, để khô đánh giá hình thái vi thể kính hiển vi quang học acetat chì Đối với kính hiển vi điện tử quét: khử nước, phủ vàng Các mẫu tế bào kiểm tra kính hiển vi điện tử - Hóa mơ miễn dịch: cố định tế bào PFA 4% 20 phút Rửa nhiều lần PBS Sau nhuộm marker vimentin TH (kháng thể 1), ủ mẫu nhiệt độ 40C qua đêm Sau tiếp tục phủ kháng thể gắn huỳnh quang Soi chụp ảnh mẫu tế bào kính hiển vi huỳnh quang * Chỉ tiêu nghiên cứu: - Tỷ lệ mọc mẫu sau nuôi cấy - Tế bào phát triển theo thời gian - Hình thái vi thể tế bào sau ni cấy - Hình thái siêu vi tế bào sau nuôi cấy - Sự diện marker vimentin TH tế bào sau nuôi cấy - Tỷ lệ sống tế bào sau bảo quản lạnh - Tỷ lệ mọc mẫu tế bào sau bảo quản lạnh * Thời gian địa điểm nghiên cứu: Nghiên cứu tiến hành từ tháng 10 - 2014 đến 12 - 2016 Bộ môn Mô phôi, Trường Đại học Y Hà Nội Phòng Kính hiển vi Điện tử, Viện Vệ sinh Dịch tễ TW - Cấu trúc hình thái siêu vi thể: kỹ thuật hiển vi điện tử xuyên quét: cố định glutaraldehyt 2,5%, hậu cố định axít * Đạo đức nghiên cứu: osmic 1% Đối với kính hiển vi điện tử xuyên: Nghiên cứu đ Hội đồng Đạo đức khử nước, chuyển, đúc khối, cắt lát mỏng Trường Đại học Y Hà Nội thơng qua 300 - 400 µm, nhuộm uranyl KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 191 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 Từ tháng 10 - 2014 đến - 2016, chúng tơi đ phẫu tích 600 phơi chuột, thu 600 mảnh mơ sàn não Trong đó, 562 mảnh mô phân lập thành dịch treo tế bào để ni cấy Còn lại 38 mảnh mơ phân lập thành dịch treo tế bào để bảo quản lạnh Ni cấy TBGNBTKNG phơi chuột Hình 1: TBGNBTKNG phơi chuột sau - ngày nuôi cấy (A: sau ngày nuôi cấy, tế bào tạo cụm, với nhiều nhành bào tương (kính hiển vi soi ngược, x500); B: sau ngày ni cấy, tế bào có hình thái nơ ron, có nhiều nhánh bào tương nối với (nhuộm Giemsa, x500)) Trong số 562 phôi nuôi cấy, 19 mẫu mơ (3,3%) khơng có tế bào mọc Còn lại 543 mẫu tế bào mọc tốt có nhiều nơ ron bám đĩa ni cấy Tỷ lệ mọc mẫu mô khoảng 96,7% Sau ngày nuôi cấy, đa số tế bào đ bám đáy chai ni cấy Một số đ có nhánh bào tương tỏa xung quanh để nối với tế bào bên cạnh Sau - ngày nuôi cấy, tế bào tiếp tục phát triển mạnh Trong mẫu nuôi cấy quan sát hình ảnh nhiều tế bào “giống nơ ron”: hình đa diện, có nhiều nhánh, nối với thành mạng lưới Các tế bào đứng riêng rẽ, đa phần tạo thành cụm tế bào Sau khoảng ngày ni cấy, tách chiết tế bào phục vụ ghép thử nghiệm chuột bảo quản lạnh 192 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QN SỰ SỐ CHUN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 Hình 2: Nhuộm hóa mơ miễn dịch marker vimentin TH tế bào não phôi chuột sau nuôi cấy ((2): tế bào dương tính với marker vimentin; (4): tế bào dương tính với marker TH (màu đỏ); (1, 3) nhân tế bào màu xanh với sytox Ảnh chụp kính hiển vi huỳnh quang, x500) Các tế bào sau ni cấy dương tính với marker vimentin mạnh Rất nhiều tế bào dương tính với marker TH Hình (1) (2) kênh màu cấu trúc Hình (3) (4) kênh màu cấu trúc Bảo quản lạnh TBGNBTKNG phôi chuột Trong số 543 mẫu tế bào gốc não phôi chuột nuôi cấy được, bảo quản lạnh mẫu dịch treo tế bào Như vậy, thời điểm này, đ bảo quản 150 mẫu, 72 mẫu bảo quản giai đoạn sau phân lập tạo dịch treo tế bào (nhóm A), chia 78 mẫu bảo quản sau nuôi cấy làm nhóm: nhóm chưa cấy chuyển (nhóm B) nhóm cấy chuyển lần (nhóm C) Sau r đơng, chúng tơi thu tỷ lệ sống trung bình 64,9% Khơng có khác biệt tỷ lệ sống nhóm A nhóm B, nhiên tỷ lệ sống sau bảo quản lạnh nhóm C thấp có ý nghĩa thống kê với nhóm lại Bảng 1: Tỷ lệ sống tế bào thần kinh sau r đơng Nhóm Số mẫu (n) Tỷ lệ sống (%) Sau phân lập (nhóm A) 72 66,6 ± 11,6 = 0,1 > 0,05 Chưa cấy chuyển (nhóm B) 68 69,8 ± 11,4 < 0,001 Sau cấy chuyển lần (nhóm C) 10 19,9 ± 8,2 < 0,001 Tỷ lệ sống trung bình 193 64,9 % p TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 Biểu đồ 1: Tỷ lệ mọc mẫu nuôi cấy sau r đông Tiến hành nuôi cấy tăng sinh mẫu tế bào sau r đông, kết thu tỷ lệ mọc mẫu nhóm A nhóm B tương đương nhau, tỷ lệ mọc mẫu nhóm C thấp có ý nghĩa thống kê với nhóm lại (p < 0,001) BÀN LUẬN Nuôi cấy TBGNBTKNG phơi chuột Mục đích nghiên cứu ni cấy tăng sinh số lượng tế bào tiết dopamin để phục vụ điều trị bệnh lý Parkinson thực nghiệm chuột Vì vậy, chúng tơi đ lựa chọn mảnh mơ sàn não phôi chuột cống khoảng 12,5 - 13,5 ngày tuổi Tại vị trí đ chứng minh nơi tập trung tế bào đầu dòng tiết dopamin [1] Tuy nhiên, số lượng tế bào phôi 12,5 13,5 ngày không nhiều, cần phải nuôi cấy tăng sinh đủ lượng tế bào phục vụ điều trị Mẫu mô sàn não sau phân tách enzym tiến hành nuôi cấy phiến nuôi cấy chai flask Việc bổ sung bFGF vào môi trường nuôi cấy Bouvier CS (1995) chứng minh giúp tăng sinh số lượng tế bào gốc mô thần kinh làm chậm q trình biệt hóa thành nơ ron tiết dopamin, trì hỗn lên tới ngày thực nghiệm [4] Trong nghiên cứu chúng tôi, tế bào bám vào bề mặt nuôi cấy sớm, khoảng ngày, tăng sinh nhanh sau khoảng ngày ni cấy đ biệt hóa thành nơ ron tế bào thần kinh đệm tạo mô thần kinh Các loại tế bào theo thời gian nuôi cấy dần thể r đặc điểm cấu trúc hình thái: nơ ron với nhánh dài liên kết chặt chẽ với nhau, tập trung thành đám, tế bào hình tế bào nhánh đứng rải rác Sự xuất tế bào hay tế bào nhánh mơ thần kinh đệm góp phần thúc đẩy q trình biệt hóa nơ ron thành nơ ron tiết dopamin chúng sản xuất số chất trung gian hóa học như: IGF-I; GDNF… [4, 5] 194 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 Bằng phương pháp nhuộm hóa mơ miễn dịch với hai loại marker vimentine TH, ghi nhận đa số tế bào sau ni cấy thể dương tính với marker vimentin Rất nhiều nơ ron số dương tính với marker TH - thể tế bào có nguồn gốc mơ thần kinh có khả tiết dopamin [5] Sử dụng tế bào gốc sàn não sau nuôi cấy tăng sinh để tiêm cho chuột đ gây bệnh Parkinson thực nghiệm Bảo quản lạnh TBGNBTKNG phôi chuột Việc ứng dụng tế bào gốc thần kinh điều trị đ nghiên cứu từ sớm kèm nhiều nghiên cứu vể bảo quản lạnh tế bào gốc thần kinh đưa với hy vọng mang lại nguồn cung cấp tế bào gốc dồi ổn định phục vụ điều trị [6] Sử dụng DMSO (dimethyl sulfoxide), loại chất bảo quản lạnh tế bào môi trường bảo quản đ nhiều nghiên cứu chứng minh có hiệu tốt trình bảo quản tế bào gốc thần kinh: tỷ lệ tế bào sống cao sau r đơng, quy trình thao tác đơn giản khơng ảnh hưởng tới tính “gốc” tế bào [7, 8] Trong nghiên cứu này, sử dụng môi trường bảo quản 10% DMSO Tỷ lệ sống tế bào sau r đông 64,9%, tương đồng với tác giả khác Milosevic (2005) Hancock (2000) (khoảng 50 - 70%) Tuy nhiên, nhóm quần thể tế bào giai đoạn khác bảo quản lạnh, nhóm A nhóm B có tỷ lệ sống cao so với nhóm C Daniel Rodiguez CS (2017) đ công bố tỷ lệ sống sau r đông nhóm 194 nơ ron ni cấy từ tế bào gốc não phôi chuột từ 29 - 34%, thấp nhiều so với nhóm tế bào gốc sau phân lập (60 - 70%) [9] Lý giải khác biệt này, đa số nhà khoa học cho tế bào đ biệt hóa có sức chịu đựng trình hạ nhiệt độ so với tế bào chưa biệt hóa Vì vậy, màng tế bào dễ bị tổn thương, dẫn đến ly giải tế bào q trình r đơng [9] Trong nghiên cứu này, tiếp tục nuôi cấy tế bào sau r đông, cho tỷ lệ mọc mẫu khoảng 80% Ở nhóm C, tỷ lệ mọc mẫu 10%, đặc biệt không quan sát thấy tế bào tăng sinh nhóm có tỷ lệ sống ≤ 10% Trong mẫu nuôi cấy, quan sát thấy nhiều nơ ron tế bào hình tế bào nhánh Điều cho thấy việc bảo quản lạnh tế bào gốc não phôi chuột không ảnh hưởng tới khả biệt hóa tế bào KẾT LUẬN Từ kết nghiên cứu, đưa số kết luận: - Đ nuôi cấy tăng sinh thành công tế bào gốc não phôi chuột cống trắng để tạo nơ ron tiết dopamin - Đ bảo quản lạnh thành công tế bào gốc não phôi chuột cống trắng nuôi cấy phục vụ điều trị bệnh Parkinson thực nghiệm LỜI CẢM ƠN Nhóm nghiên cứu xin gửi lời cảm ơn tới Quỹ Phát triển Khoa học Công nghệ Quốc Gia, Bộ Khoa học Công nghệ đ tài trợ cho nghiên cứu TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 TÀI LIỆU THAM KHẢO to recovery in Parkinsonian rats Nature Neuroscience 1998, (4), pp.290-295 Nguyễn Thanh Hoa, Nguyễn Thị Bình, Nguyễn Mạnh Hà Sự biệt hóa tế bào tiền thân tiết dopamin não phôi chuột cống trắng Tạp chí Y học Việt Nam 2015, 437, tr.91-95 Barker S.D Cell-based therapies for Parkinson's disease Expert Rev Neurother 2011, 11 (6), pp.831-844 Hunt C.J Cryopreservation of human stem cells for clinical application: A review Transfus Med Hemother 2011, 38 (2), pp.107-123 Han F et al Development of stem cellbased therapy for Parkinson's disease Transl Neurodegener 2015, 4, p.16 Bouvier M, Mythilineon C Basic fibroblast growth factor increases divison and delays differentiation of dopamine precursors in vitro 1995 Studer L, Tabar V, Mckay G Transplantation of expanded mesencephalic precusors leads Milosevic J Cryopreservation does not affect proliferation and multipotency of murine neural precusor cells Stem Cell 2005, 23, pp.681-688 Hancock C.R Neuronal differentiation of cryopreservation neural progenitor cells dirived from mouse embryonic stem cell Biochemical and Biophysical research Communications 2000, 271, pp.418-421 Rodriguez-Martinez D, Martinez-Losa M, Alvarez-Dolado M Cryopreservation of GABAergic neuronal precursors for cellbased therapy PLoS One 2017, 12 (1), p e0170776 TẠO ỐNG GHÉP MẠCH MÁU BẰNG PHƢƠNG PHÁP KHỬ TẾ BÀO ĐỘNG MẠCH LỢN KẾT HỢP VỚI TẾ BÀO GỐC TỪ MƠ MỠ Tơ Minh Qn*; Trịnh Ngọc Lê Vân*; Lê Thị Vĩ Tuyết* 195 ... affect proliferation and multipotency of murine neural precusor cells Stem Cell 2005, 23, pp.681-688 Hancock C.R Neuronal differentiation of cryopreservation neural progenitor cells dirived from... increases divison and delays differentiation of dopamine precursors in vitro 1995 Studer L, Tabar V, Mckay G Transplantation of expanded mesencephalic precusors leads Milosevic J Cryopreservation. .. (6), pp.831-844 Hunt C.J Cryopreservation of human stem cells for clinical application: A review Transfus Med Hemother 2011, 38 (2), pp.107-123 Han F et al Development of stem cellbased therapy