Mục đích cơ bản của luận án này là đánh giá kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng để tạo nguồn vật liệu mô sẹo và cụm chồi cho xử lý chiếu xạ tia gamma (60Co); Xác định liều gây chết 50% (LD50) của tia gamma (60Co) trên mô sẹo và cụm chồi hoa huệ sau 150 ngày nuôi cấy;
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chun ngành: Cơng Nghệ Sinh Học Mã ngành: 62 42 02 01 ĐÀO THỊ TUYẾT THANH TẠO DÕNG HOA HUỆ (Polianthes tuberosa L.) ĐỘT BIẾN BẰNG TIA GAMMA (60Co) TRONG ĐIỀU KIỆN IN VITRO Cần Thơ, 2018 CƠNG TRÌNH ĐƢỢC HỒN THÀNH TẠI TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS NGUYỄN BẢO TOÀN Luận án bảo vệ trước hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp trường Họp tại:……………………………, Trường Đại học Cần Thơ Vào lúc … … ngày … tháng … năm … Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Có thể tìm hiểu luận án thƣ viện: Trung tâm Học liệu, Trường Đại học Cần Thơ Thư viện Quốc gia Việt Nam DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ Nguyễn Bảo Toàn, Nguyễn Quang Thức Đào Thị Tuyết Thanh, 2014 Xử lý tia gamma 60Co liều chiếu xạ khác cụm chồi hai giống hoa huệ (Polianthes tuberosa L.) in vitro Tạp chí Khoa học, Trường Đại học Cần Thơ (4): 41 46 Đào Thị Tuyết Thanh Nguyễn Bảo Toàn, 2016 Hiệu liều lượng tia gamma 60Co sinh trưởng cụm chồi hoa huệ (Polianthes tuberosa L.) in vitro, xuất cấu trúc bất thường xác định LD50 Tạp chí Khoa học, Trường Đại học Cần Thơ 45: 25 - 32 Đào Thị Tuyết Thanh, Lê Thị Ngọc Quý Nguyễn Bảo Toàn, 2017 Nghiên cứu đa dạng sinh trưởng dạng hoa dòng huệ đơn cánh (Polianthes tuberosa L.) nuôi cấy mô xử lý tia gamma 60Co Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Nơng nghiệp Việt Nam 2(75): 47 - 52 Đào Thị Tuyết Thanh Nguyễn Bảo Toàn, 2017 Sử dụng thị ISSR việc đánh giá đa dạng di truyền dòng/giống hoa huệ (Polianthes tuberosa L.) nuôi cấy mô xử lý đột biến tia gamma Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Nông nghiệp Việt Nam 6(79): 20 - 24 Đào Thị Tuyết Thanh Nguyễn Bảo Toàn Ảnh hưởng liều chiếu xạ tia gamma lên sinh trưởng, hoa hình thái dòng hoa huệ (Polianthes tuberosa L.) ni cấy mơ Tạp chí Cơng nghệ Sinh học Đang chờ đăng CHƢƠNG 1: MỞ ĐẦU Tính cấp thiết luận án Cây hoa huệ (Polianthes tuberosa L.) hoa cắt cành phổ biến vùng nhiệt đới cận nhiệt đới Ở Việt Nam, hoa huệ loại trồng mang lại thu nhập cao so với lúa trồng khác Vì vậy, hoa huệ đưa vào chương trình chuyển đổi cấu trồng xem trồng xóa đói giảm nghèo tỉnh Tiền Giang, Đồng Tháp, Cần Thơ An Giang Hiện nay, có hai giống hoa huệ với tràng hoa gồm cánh với hai tràng hoa gồm 12 cánh canh tác chủ yếu Đồng Bằng Sông Cửu Long Tuy nhiên, việc nhân giống hoa huệ chủ yếu củ qua nhiều hệ dẫn đến giống bị thối hóa nghiêm trọng, dễ bị sâu bệnh công làm giảm suất đáng kể Do đó, nhu cầu giống để thay cần thiết Mặt khác, việc lai tạo giống hoa huệ theo kiểu truyền thống gặp phải số hạn chế tính bất tương hợp cao, hoa có nhụy nhị chín khơng lúc hạt khơng tạo điều kiện tự nhiên (Estrada-Basaldua et al., 2011) Hơn nữa, có giống hoa đơn tạo hạt, hạt khó nẩy mầm Có lẽ tạo đột biến cách tốt việc tạo giống hoa huệ Trong tác nhân đột biến vật lý, tia gamma sử dụng rộng rãi có hiệu (Matsumara et al., 2010) Kỹ thuật làm tăng biến dị di truyền số loài hoa thay đổi màu sắc, hình dạng, đặc tính sinh trưởng… hoa (Xu et al., 2012) Bên cạnh đó, kỹ thuật ni cấy in vitro cần áp dụng để tăng số mẫu chiếu xạ Sự nhân giống hoa huệ in vitro nghiên cứu (Huỳnh Thị Huế Trang ctv., 2007; Hutchinson et al., 2004) Trong đó, ni cấy đỉnh sinh trưởng chiếu xạ phương pháp hiệu để làm bệnh, nhân nhanh có biến dị Sự kết hợp áp dụng thành công cọ, táo, khoai tây, khoai lang khóm (Ulukapi and Nasircilar, 2015) hồn tồn áp dụng việc chọn tạo giống hoa huệ Mặt khác, cánh hoa có vai trò quan trọng nở hoa, thụ phấn giao phấn… Đối với hoa kiểng, số lượng cánh hoa có liên quan lớn đến kiểu hình hoa Khi xử lý tia gamma riêng lẻ nuôi cấy in vitro kết hợp xử lý tia gamma làm thay đổi số lượng cánh hoa hồng, gia tăng số lượng cánh hoa cúc (Usenbaevard and Imankulova, 1974; Kahrizi et al., 2012; Nagatomi, 2001) Do đó, hoa huệ khả gây đột biến tạo nguồn biến dị đặc điểm tăng số lượng cánh hoa cao nuôi cấy in vitro xử lý tia gamma Cho đến nay, Việt Nam, chưa có giống hoa huệ với nhiều cánh hoa tạo theo phương pháp truyền thống phương pháp chọn giống kỹ thuật công nghệ sinh học đại khác Như vậy, cần thiết phải thực nghiên cứu “Tạo dòng hoa huệ (Polianthes tuberosa L.) đột biến tia gamma (60Co) điều kiện in vitro” Mục tiêu 2.1 Mục tiêu chung: Chọn dòng hoa huệ đột biến có số lượng cánh hoa nhiều giống nghiên cứu, kích thước hoa to thơm 2.2 Mục tiêu cụ thể: (1) Đánh giá kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng để tạo nguồn vật liệu mô sẹo cụm chồi cho xử lý chiếu xạ tia gamma (60Co); (2) Xác định liều gây chết 50% (LD50) tia gamma (60Co) mô sẹo cụm chồi hoa huệ sau 150 ngày nuôi cấy; (3) Xác định dạng bất thường kiểu hình giai đoạn dưỡng (4) Chọn đến dòng hoa huệ tăng số lượng cánh hoa (nhiều 12 cánh), kích thước hoa to có mùi thơm theo phương pháp nhân giống truyền thống Đối tƣợng phạm vi nghiên cứu Hai giống hoa huệ đơn kép canh tác tỉnh An Giang Theo dõi đặc tính dòng đột biến trồng đồng qua hệ Thời gian địa điểm thí nghiệm - Thực từ tháng 10/2013 đến tháng 8/2017 Trường Đại học Cần Thơ Thí nghiệm xử lý chiếu xạ tại Phòng Cơng nghệ Bức xạ, thuộc Viện Nghiên cứu Hạt nhân Đà Lạt, tỉnh Lâm Đồng Giống hoa huệ đơn trồng Thành phố Cần Thơ giống hoa huệ kép trồng tỉnh Tiền Giang Những đóng góp luận án - Sử dụng phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng để làm vật liệu khởi đầu cho nuôi cấy tạo mô sẹo cụm chồi cho xử lý chiếu xạ tia gamma (60Co); xác định liều gây chết 50% (LD50) tia gamma mô sẹo giống hoa huệ đơn cụm chồi giống hoa huệ kép in vitro - Ở hai giống/dòng hoa huệ, xác định dạng bất thường hình thái chồi sau 150 ngày nuôi cấy in vitro; xác định dạng bất thường hình thái lá, thân củ sau 60 ngày trồng đồng; xác định đặc điểm sinh trưởng dạng bất thường hình thái hoa mùi thơm giai đoạn sau 180 ngày trồng đồng - Chọn dòng hoa huệ đột biến có đặc tính khác so với giống canh tác tăng số cánh hoa lên 22 36 cánh, kích thước hoa to hoa có mùi thơm phương pháp nhân giống truyền thống sau hệ trồng - Đánh giá đa dạng di truyền phương pháp PCR - ISSR để chứng minh khác biệt gen hai dòng hoa huệ đột biến so với hai giống hoa huệ đối chứng, cụ thể có xuất băng ADN; tiếp tục giải trình tự gen để so sánh trình tự ADN vùng ITS1/4 dòng/giống hoa huệ để thấy dạng đột biến thay thế, thêm một/một đoạn nucleotide - Luận án xây dựng quy trình tạo dòng hoa huệ đột biến tia gamma (60Co) điều kiện in vitro Bố cục luận án Luận án dài 142 trang, gồm phần giới thiệu, tổng quan tài liệu, phương pháp nghiên cứu, kết thảo luận phần kết luận đề nghị phần phụ lục Luận án có 35 bảng, 35 hình 277 tài liệu tham khảo Chƣơng 3: PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Vật liệu thí nghiệm - Giống hoa huệ canh tác xã Bình Thạnh Đơng, huyện Phú Tân, tỉnh An Giang (Hình 3.1) Hình 3.1: Giống hoa huệ đơn kép canh tác tỉnh An Giang a b Ghi chú: a: Giống hoa huệ đơn (HĐ) có hoa thơm với cánh, phát hoa ngắn, nhỏ b: giống hoa huệ kép (HK) có hoa thơm với 12 cánh, phát hoa dài hơn, lớn 3.2 Phƣơng pháp thí nghiệm 3.2.1 Nội dung 1: Tạo vật liệu cho xử lý chiếu xạ tia gamma (60Co) điều kiện in vitro 3.2.1.1 Nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng hoa huệ - Quy trình khử mẫu sử dụng môi trường nuôi cấy MS (Huỳnh Thị Huế Trang ctv., 2007) * Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ mẫu cấy sống sau 30 ngày (%) 3.2.1.2 Tạo mô sẹo cụm chồi hoa - Cấy truyền mẫu đỉnh sinh trưởng 30 ngày/lần cấy lần (M5) Môi trường nuôi cấy môi trường (BM) bao gồm môi trường MS (1962) bổ sung thiamine; pyridoxine; nicotinic acid; 1,0 mg/l riboflavin cho loại; agar (8 g/l); đường (30 g/l) (Huỳnh Thị Huế Trang ctv., 2007) Pha chất trên, điều chỉnh pH 5,8 hấp khử trùng nhiệt độ 121°C, atm 30 phút chuẩn bị túi môi trường nuôi cấy Hình 3.2 a b Hình 3.2: Mơi trường Hình 3.3: Đĩa petri cấy mẫu túi nylon chuẩn trước xử lý tia gamma (60Co) Ghi chú: a: mẫu mô sẹo b: cụm chồi bị trước cấy mẫu - Môi trường tạo mô sẹo chồi hoa huệ môi trường BM bổ sung 1,0 mg/l NAA 4,0 mg/l BA (Huỳnh Thị Huế Trang ctv., 2007) 3.2.2 Nội dung 2: Xác định hiệu liều lƣợng tia gamma (60Co) hai giống/dòng hoa huệ liều gây chết 50% (LD50) in vitro * Chuẩn bị mô sẹo giống hoa huệ đơn cụm chồi giống hoa huệ kép - Cụm mô sẹo hoa huệ có kích thước 1,0 cm2 cấy vào đĩa petri Mỗi đĩa petri đổ 20 ml mơi trường (khơng có chất điều hòa sinh trưởng), cấy 10 cụm mơ sẹo/đĩa chuẩn bị 60 đĩa có cấy mẫu (Hình 3.3a) - Cụm chồi hoa huệ cắt rễ (nếu có) có chiều cao trung bình từ 1,0 - 1,2 cm, cụm có đường kính khoảng 1,0 cm, cấy vào đĩa petri (Hình 3.3b) 3.2.2.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hƣởng liều lƣợng tia 60 ( Co) gamma đến sinh trƣởng phát triển cụm mô sẹo giống/dòng hoa huệ đơn Thí nghiệm bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên, nhân tố, 10 nghiệm thức, lần lặp lại, lần lặp lại đĩa petri, đĩa petri cấy 10 cụm mô sẹo môi trường BM Nghiệm thức không xử lý chiếu xạ đối chứng (ĐC) Cụm mô sẹo chiếu xạ tia gamma (60Co) với suất liều chiếu xạ 1,58 kGy/giờ Thí nghiệm bố trí theo Bảng 3.1 Bảng 3.1: Bố trí liều chiếu xạ nghiệm thức giống hoa huệ đơn Giống HĐ ĐC NT1 NT2 10 NT3 15 NT4 Liều chiếu xạ (Gy) 20 25 30 NT5 NT6 NT7 40 NT8 50 NT9 60 NT10 Sau xử lý chiếu xạ, cụm mô sẹo cấy vào môi trường BM bổ sung 1,0 mg/l NAA 6,0 mg/l BA (Lê Lý Vũ Vi ctv., 2014) để tái sinh chồi nhân chồi, cấy truyền sau 30 ngày (1 cụm mô sẹo/chồi/túi) * Chỉ tiêu theo dõi: - Tỷ lệ cụm mô sẹo tái sinh thành chồi sau 30 ngày (%) Quan sát cụm chồi thời điểm 150 ngày sau xử lý chiếu xạ - Tỷ lệ chết (%) = (Tổng số chồi chết/Tổng số chồi) x 100 Cụm mô sẹo xem chết không tái sinh thành chồi màu xanh khơng tạo chồi - Tính liều gây chết LD50 theo mô tả Randhawa (2009) - Chiều cao chồi (cm), số chồi/cụm chồi, số lá/cụm chồi - Cụm chồi bất thường ghi nhận lá, rễ, chồi, chùn đọt 3.2.2.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hƣởng liều lƣợng tia gamma (60Co) đến sinh trƣởng phát triển cụm chồi giống/dòng hoa huệ kép Thí nghiệm sử dụng cụm chồi giống hoa huệ kép bố trí liều chiếu xạ tương tự thí nghiệm (Bảng 3.2) Bảng 3.2: Bố trí liều chiếu xạ nghiệm thức giống hoa huệ kép Giống HK ĐC NT1 NT2 10 NT3 Liều chiếu xạ (Gy) 15 20 25 30 NT4 NT5 NT6 NT7 40 NT8 50 NT9 60 NT10 Sau xử lý chiếu xạ, cụm chồi cấy vào môi trường nhân chồi tương tự thí nghiệm 1, cấy truyền sau 30 ngày (1 cụm chồi/túi) * Chỉ tiêu theo dõi: - Tỷ lệ chết (%), tính liều gây chết LD50, chiều cao chồi (cm), số chồi, số dạng cấu trúc bất thường sau 150 ngày: (thực tương tự thí nghiệm 1) Cụm chồi chết màu xanh không tạo chồi 3.2.2.3 Nhân chồi tạo rễ thành hoa huệ hồn chỉnh - Mơi trường nhân chồi sử dụng môi trường BM bổ sung 1,0 mg/l NAA 6,0 BA mg/l (Lê Lý Vũ Vi ctv., 2014), cấy truyền lần, 30 ngày cấy truyền lần, cấy 10 cụm chồi/túi môi trường - Sau nhân khoảng 500 chồi, chuyển sang môi trường tạo rễ môi trường BM bổ sung ml/l atonik (Lê Lý Vũ Vi ctv., 2014) 60 ngày, 30 ngày cấy truyền lần, cấy 10 chồi/túi môi trường đến rễ 3.2.3 Nội dung 3: Xác định đa dạng mặt hình thái giai đoạn dƣỡng nhà lƣới - Quy trình dưỡng theo Nguyễn Minh Kiên (2011) * Chỉ tiêu theo dõi sau 30 ngày: Tần số bất thường hình thái (%): dạng sọc lá, uốn éo (nếu có)… 3.2.4 Nội dung 4: Chọn dòng hoa huệ tăng số cánh hoa, kích thƣớc hoa hoa có mùi thơm theo phƣơng pháp truyền thống 3.2.4.1 Thí nghiệm 3: Khảo sát sinh trƣởng phát triển giống/dòng hoa huệ đơn sau xử lý tia gamma (60Co) đồng a Trồng lần (VĐM1) - Thí nghiệm bố trí theo thể thức khối hồn tồn ngẫu nhiên nhân tố, nghiệm thức với lần lặp lại (3 lô) gồm ĐC củ 4.2.1.5 Tác động liều chiếu xạ tia gamma (60Co) cấu trúc bất thƣờng giống/dòng hoa huệ đơn Có kiểu cấu trúc bất thường giống/dòng hoa huệ đơn ảnh hưởng liều gamma khác ĐC cấy mơ có dạng chồi bình thường; 5; 10; 15 20 Gy, dạng chồi có dính nhau, cuộn tròn; chồi 25; 30 40 Gy co dúm cuộn tròn; chồi 50 60 Gy bị sắc tố diệp lục 4.2.2 Hiệu liều lƣợng tia gamma (60Co) đến sinh trƣởng phát triển cụm chồi giống/dòng hoa huệ kép 4.2.2.1 Tỷ lệ chết cụm chồi Với liều chiếu xạ 40 Gy, tỷ lệ chết cụm chồi 50% Tỷ lệ tăng đột biến xử lý với liều 50 Gy đạt tỷ lệ chết 100% liều xử lý 60 Gy 4.2.2.2 Liều gây chết LD50: Giá trị LD50 HK giống hoa huệ kép 22,91 Gy ± 4,01 Gy (Hình 4.2) Hình 4.2: Đồ thị tương quan hồi quy để xác định LD50 liều chiếu xạ khác giống/dòng hoa huệ kép sau 150 ngày nuôi cấy Ghi chú: Đường biểu diễn Log(LD50HK) Đường biểu diễn Log(LD84HK) Log(LD16HK) 4.2.2.3 Số chồi, chiều cao chồi số Ở liều chiếu xạ từ 5; 15 25 Gy, số chồi gia tăng theo thời gian tất nghiệm thức Chiều cao chồi đạt giá trị cao nghiệm thức 15 Gy Nghiệm thức 25 Gy, tạo số nhiều (khoảng 21 lá) Mặc dù liều chiếu xạ gây chết hồn tồn 60 Gy khơng cho gia tăng số chồi chiều cao chồi 13 có gia tăng số thời điểm nuôi cấy 150 ngày (Bảng 4.2) Bảng 4.2: Số chồi, chiều cao chồi số giống/dòng hoa huệ kép xử lý tia gamma (60Co) sau 150 ngày nuôi cấy Ngày 150 Chiều cao Chiều cao Số chồi Số Số chồi Số chồi (cm) chồi (cm) a b 3,4 1,1 2,2 7,3 5,4 18,0b ab a 3,4 1,1 2,2 6,9 7,0 18,6ab bc b 10 3,4 1,0 2,2 6,3 6,0 20,1ab abc a 15 3,5 1,1 2,3 6,7 6,6 21,7a c c 20 3,3 1,1 2,3 6,1 6,2 10,5c c b 25 3,5 1,1 2,2 6,1 5,6 21,1a d d 30 3,4 1,1 2,2 4,8 2,7 4,6d de d 40 3,5 1,1 2,2 4,2 2,4 9,9c ef e 50 3,4 1,1 2,1 3,6 1,1 4,7d f e 60 3,4 1,1 2,1 3,4 1,2 3,2d F ns Ns ns * * * CV (%) 6,4 3,6 8,6 10,6 13,3 21,8 Ghi chú: Các số có chữ số theo sau giống khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê qua phép thử Duncan; *: khác biệt mức ý nghĩa 5% Liều chiếu xạ (Gy) 4.2.2.4 Tác động liều chiếu xạ tia gamma (60Co) cấu trúc bất thƣờng giống/dòng hoa huệ kép Có kiểu cấu trúc bất thường tác động liều xạ gamma khác giống/dòng hoa huệ kép ĐC cấy mơ Gy có chồi bình thường; chồi 10 Gy có co dúm; chồi 15 Gy có sắc tố tạo rễ; chồi 20 Gy với có cưa chùn đọt; 25 40 Gy chồi chùn đọt sắc tố; chồi 30 50 Gy có cuộn tròn, dính sắc tố 60 Gy cụm chồi hóa nâu 4.2.3 Nhân chồi tạo rễ thành hoàn chỉnh Ở giống/dòng hoa huệ đơn, giai đoạn nhân chồi 90 ngày cho hệ số nhân chồi tốt, chồi xanh, khỏe Trung bình chồi ban đầu cho trung bình khoảng 4,5 chồi sau 30 ngày ni cấy trừ liều chiếu xạ 25 30 Gy 14 Đối với giống/dòng hoa huệ kép, hệ số nhân chồi cao nghiệm thức ĐC cấy mô; 10 Gy, trung bình chồi ban đầu cho 6,5 chồi Các nghiệm thức lại cho hệ số nhân chồi thấp trung bình 2,5 - 3,5 chồi Các nghiệm thức 40 50 Gy chồi hai giống sinh trưởng yếu chết dần nên không tạo hồn chỉnh Khi chuyển sang mơi trường tạo rễ chồi huệ đơn kép với tỷ lệ rễ khoảng 95,0% 97,0% tất nghiệm thức sau 60 ngày nuôi cấy 4.3 Nội dung 4.3.1 Tỷ lệ chết giống/dòng hoa huệ đơn Nghiệm thức ĐC củ có số chết (3 cây) ĐC cấy mơ có số chết nhiều (30 cây), chiếm tỷ lệ khoảng 10,0% 4.3.2 Tỷ lệ chết giống/dòng huệ kép Ở giống/dòng hoa huệ kép, số chết thấp nghiệm thức ĐC củ với tỷ lệ 3,0% Trái lại, nghiệm thức ĐC cấy mô Gy cho số chết nhiều (trên 20 cây) chiếm tỷ lệ 8,5 7,2% 4.3.3 Các dạng bất thƣờng kiểu hình giống/dòng hoa huệ đơn kép Chồi bất thường giai đoạn in vitro không tạo hồn chỉnh khơng tạo rễ có sức sống yếu chết q trình dưỡng Ở giai đoạn này, nhỏ nên khác biệt hình thái chồi không nhận thấy rõ ràng 4.4 Nội dung 4.4.1 Các đặc điểm sinh trƣởng hoa giống/dòng hoa huệ đơn trồng lần (M1) - Tỷ lệ chết Sau 60 ngày trồng đồng, tỷ lệ chết hoa huệ đơn gia tăng liều chiếu gia tăng Tuy nhiên, nghiệm thức trồng 15 từ cấy mô, nghiệm thức liều 10 Gy có tỷ lệ chết 4,0% Liều chiếu xạ 25 30 Gy có số lượng chết cao chiếm 8,0% - Số chồi, số lá, số củ đƣờng kính củ Ở liều chiếu xạ cao gia tăng số chồi (trừ nghiệm thức xử lý liều Gy) Nghiệm thức ĐC củ hoa huệ cho số chồi cao Số nghiệm thức có chênh lệch cao từ 48,9 đến 130,3 Dòng hoa huệ liều chiếu xạ 25 Gy tạo nhiều củ (14,5 củ) so với giống hoa huệ trồng từ củ (13,5 củ) Trong tất giống/dòng hoa huệ xử lý chiếu xạ, liều 25 Gy, cho số củ tốt nghiệm thức ĐC củ ĐC cấy mơ có số lượng chồi vượt trội so với dòng hoa huệ lại Dòng hoa huệ 15 25 Gy có đường kính củ lớn khoảng 4,1 cm (Bảng 4.3) Liều chiếu Số Số Số củ Đƣờng kính Bảng 4.3: Các tiêu xạ (Gy) chồi củ (cm) sinh trưởng a b ab ĐC củ 9,4 107,8 13,5 3,0d giống/dòng hoa huệ đơn ĐC cấy mô 7,3b 130,3a 13,0b 3,4c sau 180 ngày trồng de c c cd 10 15 20 25 30 F CV (%) 5,1 7,0bc 5,6cd 4,2de 4,7de 3,8e * 14,1 89,7 121,0ab 89,6c 48,9e 80,9cd 67,0d * 9,1 11,5 10,9c 8,3d 6,4e 14,5a 9,5d * 7,1 3,3 2,7e 4,1a 3,1cd 4,1a 3,7b * 4,4 Ghi chú: Các số có chữ số theo sau giống khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê qua phép thử Duncan; *: khác biệt mức ý nghĩa 5% - Thời gian hoa, chiều cao phát hoa, số hoa/phát hoa đƣờng kính hoa Các nghiệm thức ĐC củ, nghiệm thức chiếu xạ 10 25 Gy có thời gian hoa ngắn khoảng 147 ngày Ngược lại, dòng hoa huệ từ cấy mơ, nghiệm thức xử lý liều 5, 20 30 Gy có thời gian hoa kéo dài khoảng 175 ngày 16 Dòng hoa huệ xử lý với liều 20 25 Gy có chiều cao phát hoa 118,0 122,7 cm ĐC củ ĐC cấy mơ cao 91,0 103,0 cm Dòng hoa huệ liều 25 Gy có số hoa/phát hoa nhiều (41,3 hoa) Mặc dù, dòng hoa huệ liều chiếu xạ 20 Gy có chiều cao phát hoa tốt hoa đóng thưa nên số hoa (28 hoa) Dòng có đường kính hoa to dòng 25 Gy (3,6 cm) Trái lại, dòng hoa huệ có đường kính hoa thấp chiếu xạ với liều 30 Gy (1,8 cm 2,9 cm) Ở dòng hoa huệ với liều Gy có hoa khơng nở hồn tồn nên đường kính hoa nhỏ (Bảng 3.4) Bảng 4.4: Đặc điểm hoa giống/dòng hoa huệ đơn hoa lần Liều chiếu xạ Thời gian Chiều cao Số hoa/phát Đƣờng kính (Gy) hoa (ngày) phát hoa (cm) hoa hoa (cm) ĐC củ 147,7a 91,0d 36,0abc 3,0b bc cd cd ĐC cấy mô 175,3 103,0 31,3 3,0b bc bc bcd 175,0 107,3 34,0 1,8c a bc abc 10 152,7 108,7 36,0 3,5a ab bc ab 15 162,0 108,0 40,7 3,5a bc ab d 20 177,7 118,0 28,0 3,1b a a a 25 155,7 122,7 41,3 3,6a c bc cd 30 181,3 110,0 30,7 2,9c F * * * * CV (%) 5,8 6,3 10,7 6,8 Ghi chú: Các số có chữ số theo sau giống khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê qua phép thử Duncan; *: khác biệt mức ý nghĩa 5% - Các đặc điểm bất thƣờng dòng hoa huệ đơn đƣợc xử lý tia gamma (60Co) + Ở lá: Sau 60 ngày trồng ngồi đồng, có dạng bất thường dòng hoa huệ đơn ĐC củ ĐC cấy mơ có bình thường; 20 Gy với có sắc tố màu tím; 10 Gy với có nhỏ nằm bên phải lớn nằm bên trái; 15 Gy với có sọc trắng dọc hai bên mép lá; 25 Gy với 17 dính 1/3 từ thân chóp mọc hai hàng không đối xứng 30 Gy với có nhỏ, rộng dày + Ở thân củ: Ở dòng hoa huệ đơn, có kiểu hình bất thường sau xử lý đột biến Cây 15 Gy với thân có bẹ xếp lệch thành hình tia; 20 Gy với thân có bẹ mọc xếp chồng lên thành bên hàng 25 Gy với tạo củ sớm + Ở hoa: Dòng hoa huệ nghiệm thức Gy cho hoa khơng nở hồn tồn nên khơng xác định số cánh hoa dòng xử lý với liều 15; 25 30 Gy xuất hoa với cánh cánh phát hoa với tần số cao (lên đến 75%) (Hình 3.3) - Mùi thơm: Ở dòng hoa huệ tăng số cánh lên cánh liều 15; 25 30 Gy đánh giá điểm Dòng hoa huệ với liều xử lý Gy với đặc điểm hoa khơng nở hồn tồn nên mùi thơm Ở giống/dòng hoa huệ đơn khơng có đột biến cánh hoa dạng kép (nhiều 12 cánh) nên dòng đột biến chọn lọc theo dõi riêng Hình 4.3: Các dạng hoa huệ đơn với số cánh hoa tăng hoa lần a b c d Ghi chú: a: ĐC củ (hoa có cánh); b: 15 Gy (hoa có cánh); c: 25 Gy (hoa có cánh) d: 30 Gy (hoa có cánh) 4.4.2 Các đặc điểm sinh trƣởng hoa giống/dòng hoa huệ kép trồng lần (M1) - Tỷ lệ chết Cây ĐC củ chết ĐC cấy mơ có số chết nhiều (8 cây) chiếm tỷ lệ 4% Nghiệm thức 15 25 Gy có số chết với tỷ lệ (3,3%) Ở liều chiếu xạ 10 Gy 18 30 Gy cho số chết (5 cây), cho tỷ lệ chết khác - Số chồi, số lá, số củ đƣờng kính củ Nghiệm thức ĐC củ nghiệm thức 25 30 Gy tạo khoảng 4,0 chồi, số chồi đạt cao nghiệm thức 0; 5; 10; 15 20 Gy (trung bình khoảng chồi) Cây ĐC trồng từ củ cấy mơ có số trung bình 29,0 liều chiếu xạ 5; 10 20 Gy có số 36,8; 40,5 35,9 Ở liều chiếu xạ 25 Gy, có số (chỉ 50% số đạt so với có số cao liều 10 Gy) Tuy nhiên, liều chiếu xạ cao 30 Gy lại cho số cao 15 Gy Cây ĐC củ nghiệm thức 15 Gy có số củ cao (khoảng 14,0 củ) cho đường kính nhỏ trung bình khoảng 3,8 cm Ngược lại, nghiệm thức có số củ gồm nghiệm thức ĐC cấy mơ; 10; 20 30 Gy có số củ cho đường kính củ đạt trung bình khoảng 4,0 cm (Bảng 4.5) Liều chiếu xạ (Gy) ĐC củ ĐC cấy mô 10 15 20 25 30 F CV (%) Số chồi Số Số củ 3,9b 5,8a 6,0a 5,7a 6,1a 6,2a 4,3b 3,6b * 10,4 28,9abcd 29,3abcd 36,8ab 40,5a 21,3cd 35,9abc 19,3d 23,8bcd * 26,6 13,9ab 9,1d 13,0ab 7,7d 14,4a 10,7c 12,4b 7,9d * 8,1 Đƣờng kính củ 3,8ab 4,2a 3,8ab 3,8ab 3,8ab 4,1ab 3,6b 3,9ab * 6,6 Bảng 4.5: Các tiêu sinh trưởng giống/dòng hoa huệ kép sau 180 ngày Ghi chú: Các số có chữ số theo sau giống khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê qua phép thử Duncan; *: khác biệt mức ý nghĩa 5% - Thời gian hoa, chiều cao phát hoa, số hoa/phát hoa đƣờng kính hoa Thời gian hoa nghiệm thức ĐC củ liều chiếu xạ 10 Gy ngắn (156 ngày) Ngược lại, xử lý chiếu xạ với liều 15 Gy có thời gian hoa kéo dài lên đến 188,7 ngày Trong chiều cao phát hoa ngắn 30 Gy 64,3 cm 19 chiều cao phát hoa trung bình khoảng 82,3 đến 97,7 cm nghiệm thức ĐC củ liều chiếu xạ 0; 10 Gy Ngược lại, chiều cao phát hoa lớn 100 cm nghiệm thức chiếu xạ với liều 15; 20 25 Gy Số hoa dòng hoa huệ xử lý liều chiếu xạ 10 Gy 38,7 hoa phát hoa Ngược lại, số hoa phát hoa nhiều nghiệm thức ĐC cấy mơ dòng Gy với trung bình khoảng 52 hoa/phát hoa Đường kính hoa nhỏ nghiệm thức ĐC củ; ĐC cấy mô; 5; 10 30 Gy (khoảng 4,0 cm) Các liều chiếu xạ lại có đường kính hoa lớn (5,0 cm) (Bảng 4.6) Bảng 4.6: Đặc điểm hoa giống/dòng hoa huệ đơn hoa lần Liều chiếu xạ (Gy) ĐC củ ĐC cấy mô 10 15 20 25 30 F CV (%) Thời gian hoa (ngày) 157,7d 161,0cd 163,0cd 156,0d 188,7a 177,7ab 170,0bcd 175,0abc * 4,5 Chiều cao phát hoa (cm) 97,7b 89,2b 90,2b 82,3b 102,3a 106,3a 104,7a 64,3c * 17,8 Số hoa/phát hoa 37,0b 51,7a 52,3a 38,7b 48,0a 45,7a 46,0a 45,3a * 54,6 Đƣờng kính hoa (cm) 4,1bc 4,1bc 4,2bc 3,8cd 5,1a 5,3a 5,2a 4,4b * 9,1 Ghi chú: Các số có chữ số theo sau giống khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê qua phép thử Duncan; *: khác biệt mức ý nghĩa 5% - Các đặc điểm bất thƣờng dòng hoa huệ kép đƣợc xử lý tia gamma (60Co) + Ở lá: Kết cho thấy có dạng bất thường hình dạng màu sắc Cây ĐC củ với mảnh; ĐC cấy mơ; 10 Gy với có sắc tố màu tím gốc có nhỏ nằm bên phải; 10 Gy với nhỏ nằm bên phải; 15 Gy có dính từ chóp vào trong; 20 Gy với có sọc vàng dọc theo chiều dài lá; 20 Gy có nhỏ nằm bên trái; 20 25 Gy với có nằm bên phải 30 Gy với có nhỏ, rộng dày + Ở thân củ: Có tất kiểu hình thân củ dòng hoa huệ kép đột biến ĐC củ với thân có bẹ mọc xếp chồng lên thành bên hàng; 10 Gy với thân có bẹ mọc xếp chồng lên, mọc lệch thành hình tia với lá; 15 Gy với thân có bẹ mọc xếp chồng lên tạo củ sớm, mọc lệch thành hình tia với lá; 25 Gy với thân có bẹ mọc xếp chồng lên, mọc lệch thành hình tia với + Ở hoa: Có tất 18 kiểu hình khác dòng hoa huệ kép xử lý chiếu xạ Nghiệm thức ĐC cấy mơ khơng có bất thường số lượng cánh hoa có có hoa với nhị vàng chiếm tần số 2,3% Liều lượng chiếu xạ Gy không làm thay đổi số cánh hoa cánh hoa có dạng sng dài, có vết màu xanh thơm hoa có nhị vàng với tần số 4,6% Kiểu hình hoa bất thường xuất nhiều với liều chiếu xạ 10 15 Gy Ở 10 Gy hoa xuất có giảm số cánh hoa từ 12 cánh 4; 5; 6; 10 cánh có mùi thơm với tần số thấp Ở liều chiếu xạ cao 15; 20 25 Gy, có gia tăng số cánh hoa gấp hai, gấp ba so với ĐC Liều chiếu xạ 15 Gy cho dạng hoa 13; 16; 17; 18 19 cánh (tần số 1,1%) Liều chiếu xạ 20 Gy cho hoa với số cánh hoa tăng lên 22 cánh với tần số 5,8%, hoa có 36 40 cánh với tần số 3,5% Khi xử lý chiếu xạ với liều cao 30 Gy cho hoa với hình dạng méo mó, hoa trắng xanh khơng nở hồn tồn mùi thơm (khoảng 80%), 12 cánh với tần số 4,6% lên đến 40 cánh với tần số 62,1% (Hình 4.4; Hình 4.5; Hình 4.6) 21 Nhị vàng a Vết xanh c b d e f g h Hình 4.4: Các bất thường hình thái hoa giống/dòng hoa huệ kép hoa lần Ghi chú: a c: hoa 12 cánh liều chiếu xạ Gy; b: hoa có cánh liều chiếu xạ 10 Gy; d: hoa có 12 cánh liều chiếu xạ 30 Gy; e, f g: hoa có 24 cánh 24 cánh liều chiếu xạ 15, 20 25 Gy h: hoa có 4, 5, 10 cánh liều chiếu xạ 10 Gy Hình 4.5: Dạng hoa bất thường với hoa nở có mùi thơm giống/dòng hoa huệ kép hoa lần a b c Ghi chú: a: 15 Gy (hoa có 24 cánh); b: 20 Gy (hoa có 36 cánh; c: 20 Gy (hoa có 40 cánh) + Mùi thơm: Dựa theo số lượng cánh hoa chia thành nhóm: nhóm hoa có 4; 5; 6; 10 cánh, nhóm hoa có 13; 14; 16; 17; 18; 19; 22 24 cánh, nhóm hoa có 24 cánh nhóm hoa khơng nở hồn tồn Dòng hoa huệ với liều xử lý 20; 25 30 Gy với đặc điểm hoa có nhiều cánh khơng nở hồn tồn khơng có mùi thơm Tuy nhiên, mùi thơm dòng hoa huệ nhóm đánh giá điểm thơm dòng hoa huệ nhóm giống ĐC đánh giá điểm Nhóm hoa thứ khơng có mùi thơm đánh giá điểm 4.4.3 Trồng lần (M2) Trong số dòng hoa huệ có số lượng cánh hoa nhiều 12 cánh, chọn dòng hoa huệ kép phù hợp mục tiêu có số lượng cánh hoa 22 36 cánh để trồng lần (Hình 4.6) Từ đây, ghi nhận kích thước số phận đặc điểm hoa nhóm dựa số lượng cánh hoa (Bảng 4.7) 22 b a c d Hình 4.6: Các giống hoa huệ địa phương dòng hoa huệ đột biến chọn trồng lần Ghi chú: a: ĐC củ hoa cánh; b: ĐC củ 12 cánh; c: dòn g hoa bất thường 22 cánh d: dòng hoa bất thường 36 cánh Bảng 4.7: Đặc điểm nông học giống/dòng hoa huệ chọn sau trồng lần Đặc tính ĐC cánh ĐC 12 cánh Dòng 22 cánh Dòng 36 cánh Số chồi 6,0 5,0 7,0 8,0 Số 8,0 9,5 18,0 14,0 Số lá/phát hoa 12,0 24,5 15,0 20,0 Chiều dài (cm) 49,9 45,0 46,5 43,0 Chiều rộng (cm) 1,2 1,4 1,3 0,9 Chiều dài lóng thân (cm) 6,9 8,0 15,3 10,0 Số củ 4,0 3,0 4,0 6,0 Đường kính củ (cm) 3,0 3,8 4,1 4,2 Thời gian hoa (ngày) 147,7 120,0 123,0 145,0 Chiều cao phát hoa (cm) 91,0 97,7 141,0 133,0 Chiều cao cụm hoa (cm) 35,0 42,1 46,0 39,0 Số hoa/phát hoa 36,0 37,0 38,0 40,0 Thời gian hoa tàn (ngày) 7,0 14,0 16,0 20,0 Đường kính hoa (cm) 3,0 4,1 5,1 5,4 4.4.4 Đánh giá đa dạng di truyền giống/dòng hoa huệ bất thƣờng chọn đƣợc 4.4.4.1 Kết phân tích đa hình thị ISSR sử dụng đánh giá đa dạng di truyền dòng/giống hoa huệ Trong 14 mồi ISSR thu mồi có khuếch đại rõ cho tổng số 84 phân đoạn nhân lên với trung bình 21,0 ± 5,89 23 băng/đoạn mồi Trong có 84 phân đoạn đa hình chiếm tỷ lệ 100% Số lượng băng đa hình từ 13 (đoạn mồi 808) đến 27 băng (đoạn mồi 3A39) Kích thước mồi dao động khoảng 150 3.000 bp 4.4.4.2 Đánh giá đa dạng di truyền giống/dòng hoa huệ nghiên cứu khác biệt vị trí băng ADN Phân tích ISSR với mồi UBC 873 cho sản phẩm khuếch đại 23 băng ADN có kích thước phân tử khoảng 200 đến 3.000 bp Cây hoa huệ đột biến với 22 cánh xuất thêm băng ADN hai vị trí 250 bp 1.000 bp băng ADN vị trí 300; 350; 850; 1.250 3.000 bp so với giống hoa huệ gốc có 12 cánh Đối với dòng hoa huệ đột biến có 36 cánh, băng ADN bị vị trí 300; 350; 850 1.250 bp vị trí 1.000 2.750 bp lại xuất băng ADN so với giống gốc Với mồi P23SR1, xuất băng ADN hai dòng hoa huệ đột biến vị trí 500; 600; 800; 1.750 2.000 bp so với giống gốc Đồng thời dòng đột biến có vị trí băng ADN khác biệt nên phân biệt với Hai mồi 3A39 808 có xuất băng ADN, với số lượng với băng khác biệt so với ĐC (Hình 4.7) c Kết mối quan hệ di truyền giống/dòng hoa huệ nghiên cứu Kết hệ số tương đồng di truyền kiểu gen giống/dòng hoa huệ nghiên cứu, dựa sở phân tích mồi ISSR đa hình (Bảng 4.8) Hệ số biến thiên khoảng 0,375 đến 0,786 Trong kiểu gen nghiên cứu, số tương đồng thấp 0,375 giống hoa huệ gốc 12 cánh dòng hoa huệ đột biến có 22 cánh Vì hai giống/dòng thể khác biệt lớn mặt di truyền Kiểu gen hoa có cánh dòng đột biến có 36 cánh cho thấy có mối quan hệ di truyền gần có số tương đồng cao (0,786) 24 Sơ đồ nhánh dựa phân tích đa hình mồi ISSR chia kiểu gen hoa huệ thành hai nhóm với số tương đồng 0,43% Nhóm thứ gồm kiểu gen với hoa 6, 22 36 cánh Nhóm thứ hai có giống có hoa 12 cánh Điều cho thấy, hai dòng hoa huệ đột biến phát sinh từ việc xử lý đột biến giống hoa huệ gốc có 12 cánh lại có mối quan hệ di truyền gần gũi với giống hoa huệ cánh Có lẽ mối quan hệ di truyền với hệ số tương đồng thấp dòng hoa huệ đột biến với giống gốc số hạn chế kỹ thuật PCR - ISSR (Hình 4.8) M M 3.000 bp 2.000 bp 900 bp 600 bp 3.000 bp 1.250 bp 850 bp 300 bp b a M M 1.000 bp 1.250 bp 600 bp 700 bp c M: Thang chuẩn 100 bp , d : băng ADN mới, Hình 4.7: Phổ điện di sản phẩm PCR dòng hoa huệ đột biến giống gốc với số mồi ISSR a) Mồi UBC 873; b) mồi P23SR1; c) Mồi 3A39; d) Mồi 808 1: giống hoa huệ đơn cánh, 2: dòng hoa huệ 22 cánh, 3: dòng hoa huệ 36 cánh, 4: giống hoa huệ kép 12 cánh : băng ADN Bảng 4.8: Hệ số tương đồng di truyền giống/dòng hoa huệ chọn với cặp mồi ISSR Giống hoa cánh Dòng đột biến 22 cánh Dòng đột biến 36 cánh Giống hoa 12 cánh Giống hoa cánh 1,000 0,643 0,786 0,429 Dòng đột biến 22 cánh Dòng đột biến 36 cánh 1,000 0,571 0,375 1,000 0,500 25 Giống hoa 12 cánh 1,000 Hình 4.8: Sơ đồ hình nhánh mối quan hệ di truyền kiểu gen hoa huệ dựa liệu ISSR 4.4.4.3 Giải trình tự vùng ITS giống/dòng hoa huệ Kết BLAST NCBI cho thấy trình tự ITS giống hoa huệ có 12 cánh hai dòng hoa huệ đột biến với 22 36 cánh tương đồng cao với trình tự ITS loài thuộc chi Polianthes spp khoảng 95 - 99% Khi so sánh trình tự ADN vùng gen mẫu cây, hai giống hoa huệ đơn kép có 12 vị trí khác nucleotid Khi so sánh trình tự ADN hai dòng hoa huệ đột biến có 22 cánh 36 cánh có 32 33 vị trí sai khác nucleotid theo thứ tự so với giống gốc có 12 cánh với dạng đột biến thay thế, thêm nucleotide đoạn nucleotide Chƣơng 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận (1) Môi trường BM + 1,0 mg/l NAA + 4,0 mg/l BA thích hợp cho tạo mô sẹo cụm chồi in vitro; (2) Khi xử lý tia gamma (60Co), LD50 giống/dòng hoa huệ đơn khoảng 10 - 15 Gy (giá trị tính 10,96 ± 2,96 Gy) LD50 giống/dòng hoa huệ kép khoảng 20 - 25 Gy (giá trị tính 22,91 ± 4,01 Gy); (3) Giai đoạn dưỡng, nhỏ nên khác biệt hình thái chồi khơng nhận thấy rõ ràng (4) Dòng hoa 26 huệ đơn đột biến liều 25 30 Gy có tăng cánh hoa, mùi thơm tốt không tạo dạng hoa kép Ở hoa huệ kép chọn dòng đột biến tiềm đặc điểm hoa to có mùi thơm với 22 36 cánh liều chiếu xạ 20 Gy Quy trình tạo dòng hoa huệ đột biến tia gamma (60Co) điều kiện in vitro sau: 5.2 Đề nghị Tiếp tục theo dõi đặc điểm nơng học dòng hoa huệ đột biến chọn lọc Sau đó, nhân nhanh số lượng để ứng dụng cho sản xuất thương mại 27 ... thực nghiên cứu Tạo dòng hoa huệ (Polianthes tuberosa L.) đột biến tia gamma (6 0Co) điều kiện in vitro Mục tiêu 2.1 Mục tiêu chung: Chọn dòng hoa huệ đột biến có số lượng cánh hoa nhiều giống... huệ để thấy dạng đột biến thay thế, thêm một/một đoạn nucleotide - Luận án xây dựng quy trình tạo dòng hoa huệ đột biến tia gamma (6 0Co) điều kiện in vitro Bố cục luận án Luận án dài 142 trang,... kép Ở hoa huệ kép chọn dòng đột biến tiềm đặc điểm hoa to có mùi thơm với 22 36 cánh liều chiếu xạ 20 Gy Quy trình tạo dòng hoa huệ đột biến tia gamma (6 0Co) điều kiện in vitro sau: 5.2 Đề nghị