Nghiên cứu này triển khai nhằm mục đích đánh giá mức độ nhạy cảm của ChE ở CRĐ khi tiếp xúc với diazinon và fenobucarb. Qua đó đánh giá tiềm năng sử dụng ChE ở CRĐ để đánh dấu sinh học và cảnh báo sớm ảnh hưởng của sử dụng hoá chất BVTV lên sinh vật trước khi nó gây ra những ảnh hưởng nghiêm trọng đến các loài thuỷ sinh vật.
Tạp chí KHOA HỌC ĐHSP TP HCM Số 14 năm 2008 NHẠY CẢM CỦA CHOLINESTERASE Ở CÁ RÔ ĐỒNG (ANABAS TESTUDINEUS) GIỐNG VỚI DIAZINON VÀ FENOBUCARB Nguyễn Văn Công1, Nguyễn Tuấn Vũ2, Trần Sỹ Nam3 Giới thiệu Cá rô đồng (CRĐ) (Anabas testudineus) loài cá nước ngọt, phân bố nhiều loại hình thuỷ vực, ruộng lúa nơi mà cá xuất Đồng ruộng đồng sông Cửu Long (ĐĐBSCL) nơi mà thuốc bảo vệ thực vật (BVTV) sử dụng nhiều, trung bình 1,8kg hoạt chất/ha/vụ phun từ 5,7 đến 8,2 lần/vụ (Berg, 2001) Nơng dân ĐBSCL có thoái quen sử dụng thuốc BVTV cao dẫn Do CRĐ tự nhiên có nhiều nguy bị ảnh hưởng từ việc sử dụng thuốc BVTV canh tác lúa Thuốc BVTV hoạt chất diazinon fenobucarb thường sử dụng phổ biến canh tác lúa (Berg, 2001) Diazinon thuộc nhóm lân hữu cơ, có liên kết P=S công thức cấu tạo gây hại cho động vật chế làm giảm hoạt tính enzyme cholinesterase (ChE) (Stenerson, 2004) Fenobucarb thuốc BVTV nhóm carbamate, chế gây chết động vật giống diazinon (Stenerson, 2004) Khi ChE bị ức chế đến 70% làm chết hầu hết loài thuỷ sinh vật (Fulton Key, 2001) 30% bị ức chế xem giới hạn cho phép tối đa cho hầu hết sinh vật (Aprea et al., 2002) Nghiên cứu độc tính diazinon CRĐ đánh giá nồng độ gây chết ảnh hưởng đến mô học, giá trị LD50-96 diazinon 60EC CRĐ giống 6,55 mg/l nồng độ 3,75 mg/l, diazinon 60EC gây ảnh hưởng đến tế bào gan thận CRĐ (Rahman et al., 2002) Trong chế gây hại cho động vật diazinon ức chế hoạt tính ChE chưa được rõ Nghiên cứu triển khai nhằm mục đích đánh giá mức độ nhạy cảm ChE CRĐ tiếp xúc với diazinon fenobucarb Qua đánh giá tiềm sử dụng ChE CRĐ để đánh dấu sinh học cảnh báo sớm ảnh hưởng sử dụng hoá chất BVTV lên sinh vật trước gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến lồi thuỷ sinh vật Khoa Mơi trường & Tài nguyên Thiên nhiên – Trường ĐH Cần Thơ Khoa Môi trường & Tài nguyên Thiên nhiên – Trường ĐH Cần Thơ Khoa Môi trường & Tài nguyên Thiên nhiên – Trường ĐH Cần Thơ 69 Tạp chí KHOA HỌC ĐHSP TP HCM Nguyễn Văn Công tác giả Phương pháp nghiên cứu 2.1 Hoá chất Hóa chất Na2HPO4.2H2O NaH2PO4.2H2O (Merck) dùng để pha dung dịch đệm pH 7,4 pH Các hóa chất 5,5 dithio – bis nitrobenzoic acid (DTNB, Sigma Aldrich, Germary), acetylthiocholine iodide (ACTH) (Sigma Aldrich, Germany), butyrylcholine iodide (BUTH) (Sigma Aldrich, Germany) tetraisopropyl pyrophosphoramide (iso-OMPA) (Sigma Aldrich, Germany) sử dụng để đo hoạt tính ChE Aceton (Trung Quốc) nước cất dùng để rửa dụng cụ nghiền mẫu trước sử dụng nghiền mẫu Thuốc BVTV Basudin 50EC (diazinon) Bassa 50EC (fenobucarb) công ty Bảo vệ Thực vật An Giang sản xuất sử dụng nguồn diazinon fenobucarb cho nghiên cứu 2.2 Sinh vật thí nghiệm CRĐ giống (5 1 gam, 6,50,7cm) mua từ trại cá giống quận Ô môn – Thành phố Cần Thơ, dưỡng 15 - 20 ngày trước triển khai thí nghiệm Cá thay nước ngày nước máy, cho ăn thức ăn dạng viên 2.3 Bố trí thí nghiệm 2.3.1 Xác định loại Cholinesterase có não thịt CRĐ Nguyên não CRĐ nghiền nát dung dịch đệm pH 7,4 chia làm phần, phần cho iso-OMPA vào cho nồng độ sau isoOMPA mẫu 0,001M Phần lại pha loãng dung dịch pH 7,4 cho nồng độ não mẫu có khơng có iso-OMPA giống Các mẫu sau ly tâm đo hoá chất acetylthiocholine iodide (ACTH) butyrylcholine iodide theo phương pháp Ellman et al., (1961) Xác định mức độ nhạy cảm ChE với Diazinon, Fenobucarb 48 tiếp xúc 2.3.2 Ba mức nồng độ diazinon (0,025, 0,05, 0,1 mg/l) mức nồng độ fenobucarb (0,11, 0,23, 1,14 mg/l) đối chứng bố trí theo khối hoàn toàn ngẫu nhiên bể kiếng dung tích 30 lít, lập lại lần, lần lập lại có 15 CRĐ 70 Tạp chí KHOA HỌC ĐHSP TP HCM Số 14 năm 2008 Ở thời điểm 3, 6, 12, 24, 48 sau bố trí, dùng vợt vớt nhẹ CRĐ cho mức nồng độ (1 cá/bể) giết nước đá, sau lấy nguyên não, phần thịt để đo hoạt tính ChE Xác định mức độ ức chế hoạt tính ChE Diazinon Fenobucarb làm cá chết 2.3.3 Bốn nồng độ diazinon (0,05, 0,1, 0,15, 0,2 mg/l), ba nồng độ fenobucarb (11,4, 17,1, 22,7 mg/l) đối chứng bố trí hồn tồn ngẫu nhiên bể kiếng dung tích trên, lập lại lần cho mức nồng độ Thí nghiệm bố trí vòng 96 cho diazinon 24 cho fenobucarb, bể có CRĐ Số cá chết ( con) nghiệm thức đo ChE não thịt Khi kết thúc thí nghiệm cá sống đo ChE não thịt 2.3.4 Phân tích hoạt tính ChE ChE đo theo phương pháp so màu (Ellman et al., 1961) Quá trình chuẩn bị mẫu, ly tâm, đo tính tốn hoạt tính ChE dựa theo mô tả Nguyễn Văn Công cộng (2006) 2.4 Xử lý số liệu Phân tích phương sai one-way ANOVA, kiểm định Duncan Dunnet áp dụng để so sánh khác biệt hoạt tính ChE so với đối chứng nghiệm thức Số liệu kiểm tra phân phối chuẩn tính đồng phương sai trước áp dụng thống kê Kết thảo luận 3.1 Kết 3.1.1 Xác định loại ChE não Hoạt tính trường hợp đo ACTH có khơng có iso-OMPA sai khác khơng có ý nghĩa (p>0,05) Tương tự, đo BUTH không thấy khác biệt (p>0,05) có khơng có chất iso-OMPA Tuy nhiên hoạt tính đo BUTH thấp đo ACTH nhiều, khoảng 10% Số liệu trình bày trung bình sai số chuẩn, n=6) đo hoá chất khác Acetylcholine iode (ACTH) đo tổng ChE; S-butyrylcholine iode (BUTH) đo butyrylcholinesterase; iso-OMPA (tetraisopropyl pyrophosphoramide) sử dụng nồng độ 0,001M, chất có tác dụng chuyên biệt gây ức chế butyrylcholinesterase Những cột có chữ giống sai khác khơng có ý nghĩa thống kê (p>0,05, Duncan test) 71 Tạp chí KHOA HỌC ĐHSP TP HCM Nguyễn Văn Công tác giả Bảng 3.1.1: Hoạt tính ChE não thịt cá rô giống (không tiếp xúc thuốc) đo hoá chất khác Hoá chất đo mẫu ACTH Iso-OMPA + ACTH BUTH Iso-OMPA +BUTH Hoạt tính ChE (mol/g/phút) 8,65 0,49a 7,84 0,34a 0,86 0,15b 0,11 0,00b 3.1.2 Ảnh hưởng nồng độ ngưỡng gây chết Diazinon lên hoạt tính ChE CRĐ Kết cho thấy có ảnh hưởng diazinon lên hoạt tính ChE, mức độ ảnh hưởng khác theo nồng độ thời gian tiếp xúc Sau tiếp xúc, nồng độ 0,1mg/l hoạt tính giảm đáng kể (giảm 59%) so với đối chứng (p0,05) Sau tiếp xúc thấy rõ ảnh hưởng (p0.05) so với đối chứng Sau 48 thí nghiệm, ảnh hưởng diazinon lên hoạt tính ChE thấy rõ (p