Nghiên cứu khả năng hấp thụ thuốc berberine hydrochloride của vật liệu cellulose tạo ra từ gluconacetobacter xylinus nuôi cấy trong môi trường nước dừa già

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI KHOA SINH - KTNN TRẦN THỊ HẢI YẾN NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG HẤP THỤ THUỐC BERBERINE HYDROCHLORIDE CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE TẠO RA TỪ GLUCONACETOBACTER XYLINUS NUÔI CẤY TRONG MÔI TRƯỜNG NƯỚC DỪA GIÀ KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Sinh lý học người động vật Hà Nội, tháng năm 2019 Hà Nội, tháng 11 năm 2018 TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI KHOA SINH - KTNN TRẦN THỊ HẢI YẾN NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG HẤP THỤ THUỐC BERBERINE HYDROCHLORIDE CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE TẠO RA TỪ GLUCONACETOBACTER XYLINUS NUÔI CẤY TRONG MÔI TRƯỜNG NƯỚC DỪA GIÀ KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Sinh lý học người động vật Người hướng dẫn: TS Nguyễn Xuân Thành Hà Nội, tháng năm 2019 LỜI CẢM ƠN Đề tài “Nghiên cứu khả hấp thụ thuốc Berberine hydrochloride vật liệu cellulose tạo từ Gluconacetobacter xylinus nuôi cấy môi trường nước dừa già” nội dung em chọn để làm khóa luận tốt nghiệp sau năm học tập khoa Sinh – KTNN trường Đại học Sư phạm Hà Nội Để hồn thành q trình nghiên cứu hồn thiện khóa luận, lời em xin chân thành cảm ơn chân thành tới thầy giáo Nguyễn Xuân Thành, người tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em suốt trình thực khóa luận Em xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu, thầy cô giáo khoa Sinh – KTNN, thầy cô Viện Nghiên cứu Khoa học Ứng dụng – Trường Đại học Sư phạm Hà Nội tận tình giảng dạy tạo điều kiện thuận lợi thời gian em học tập nghiên cứu trường Đây lần đầu em tham gia nghiên cứu khoa học, kinh nghiệm em nhiều hạn chế Do khơng tránh khỏi sai sót em mong nhận nhận xét đóng góp thầy bạn để đề tài khóa luận em hoàn thiện Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 20 tháng năm 2019 SINH VIÊN Trần Thị Hải Yến LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan đề tài thực hướng dẫn TS Nguyễn Xuân Thành Các số liệu kết nghiên cứu khóa luận trung thực, khơng trùng lặp với cơng trình nghiên cứu Hà Nội, ngày 20 tháng năm 2019 SINH VIÊN Trần Thị Hải Yến DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt VLC OD UV - vis E coli Tên đầy đủ Vật liệu cellulose Optical Density Ultraviolet visible Escherichia coli MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Lý chọn đề tài Mục đích nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Ý nghĩa khoa học thực tiễn NỘI DUNG Chương Tổng quan 1.1 Giới thiệu vật liệu cellulose 1.1.1 Đặc điểm cấu trúc màng vật liệu cellulose 1.1.2 Tính chất màng vật liệu cellulose 1.1.3 Ứng dụng màng vật liệu cellulose 1.2 Giới thiệu thuốc berberine hydrochloride 1.3 Nước dừa già 1.4 Tổng quan tình hình nghiên cứu nước 1.4.1 Tình hình nghiên cứu thuốc: 1.4.2 Tình hình nghiên cứu màng VLC Chương Vật liệu phương pháp nghiên cứu 2.1 Vật liệu nghiên cứu 2.1.1 Giống vi khuẩn 2.1.2 Nguyên liệu hóa chất 2.1.3 Thiết bị dụng cụ 2.1.4 Vật liệu làm môi trường nuôi cấy màng VLC 2.2 Phương pháp nghiên cứu 10 2.2.1 Phương pháp tạo màng VLC 10 2.2.2 Phương pháp xây dựng đường chuẩn 11 2.2.3 Phương pháp xác định lượng thuốc hấp thụ vào màng 11 2.2.4 Phương pháp phân tích thống kê 12 Chương Kết nghiên cứu thảo luận 13 3.1 Kết tạo vật liệu VLC 13 3.1.1 Thu màng VLC thô 13 3.1.2 Tạo màng VLC tinh khiết 14 3.2 Đường chuẩn hấp thụ thuốc berberine hydrochloride 15 3.3 Khả hấp thụ thuốc berberine hydrochlorid màng VLC 16 KẾT LUẬN 20 Kết luận 20 Kiến nghị 20 TÀI LIỆU THAM KHẢO 21 MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Berberine hydrochloride khó tan ethanol nước, khơng tan ether, thuốc đường tiêu hóa dùng qua đường uống Nó có tác dụng chống loại vi khuẩn, ký sinh trùng đường ruột gây hại cho thể, không ảnh hưởng tới hoạt động vi sinh vật có lợi đường tiêu hóa Berberine hydrochloride có khả ngăn ngừa lây lan nấm, bột nhiễm nấm, chống lại tác hại vi khuẩn tả, E Coli Berberine hydrochloride có tác dụng phụ gây táo bón, dùng với liều lượng cao 500 mg gây đau bụng, buồn nơn, nơn mửa, căng thẳng, trầm cảm, khó thở, nhịp tim chậm, suy tim, hạ huyết áp, co giật, gây tê liệt dẫn đến tử vong Tuy nhiên, berberine hydrochloride có sinh khả dụng thấp, q trình sử dụng bị tác nhân khác gây ảnh hưởng làm giảm hiệu hấp thụ Do đó, cần thiết để thiết kế loại màng giúp thuốc hấp thụ cách nhanh chóng tăng khả điều trị bệnh berberine hydrochloride [1] VLC tạo thành từ Gluconacetobacter xylinus có cấu trúc hóa học giống với thành cellulose thực vật có số tính chất hóa lý đặc biệt như: độ bền học, khả thấm hút nước cao, đường kính sợi nhỏ, độ tinh khiết cao, độ polymer hóa lớn, có khả phục hồi độ ẩm ban đầu,… Vì vậy, VLC ứng dụng nhiều lĩnh vực như: thực phẩm, công nghiệp dệt, công nghiệp giấy, mỹ phẩm, y học, … đáng ý kiểm soát hệ thống vận chuyển thuốc Amin cộng [15] báo cáo việc sử dụng vật liệu VLC làm màng bọc cho paracetamol cách sử dụng kĩ thuật phun phủ Kết cho thấy vật liệu VLC giúp cho thuốc giải phóng cách kéo dài làm tăng hiệu sử dụng thuốc Gần hơn, Huang cộng [16] nghiên cứu việc sử dụng màng VLC cho việc kiểm soát in vitro berberine Ngoài nghiên cứu thẩm thấu qua da, thí nghiệm kiểm sốt giải phóng thuốc qua màng VLC thử nghiệm mơ dày, ruột Nước dừa già môi trường tiềm việc nuôi cấy màng VLC lên men từ vi khuẩn có chứa nhiều vi chất dinh dưỡng, vitamin, axit hữu cơ, đường, đặc biệt hợp chất quan trọng nuôi cấy in vitro Vì Gluconacetobacter xylinus thích hợp phát triển mơi trường Nhờ đặc tính độc đáo VLC tiềm môi trường nước dừa già, nhằm tăng khả hấp thụ thuốc có kiểm soát, tăng khả dụng sinh học thuốc berberine hydrochloride điều trị bệnh, định chọn đề tài: “Nghiên cứu khả hấp thụ thuốc berberine hydrochloride vật liệu cellulose tạo từ Gluconacetobacter xylinus nuôi cấy mơi trường nước dừa già” Mục đích nghiên cứu - Nghiên cứu chế tạo màng vật liệu cellulose từ môi trường nước dừa già - Nghiên cứu khả hấp thụ thuốc berberine hydrochloride màng vật liệu cellulose tạo từ Gluconacetobacter xylinus môi trường nước dừa già Nội dung nghiên cứu - Tạo màng xử lý màng VLC lên men từ môi trường nước dừa già - So sánh khả hấp thụ thuốc màng VLC lên men từ môi trường nước dừa già độ dày màng khác Ý nghĩa khoa học thực tiễn 4.1 Ý nghĩa khoa học Tìm hiểu khả hấp thụ để có hiểu biết tiềm hấp thụ màng VLC với thuốc 4.2 Ý nghĩa thực tiễn Xây dựng quy trình tạo màng VLC từ mơi trường nước dừa già NỘI DUNG Chương Tổng quan 1.1 Giới thiệu vật liệu cellulose 1.1.1 Đặc điểm cấu trúc màng vật liệu cellulose Cellulose polymer không phân nhánh bao gồm gốc glucopyranose nối với liên kết β-1,4 glucan Các nghiên cứu cho thấy cấu trúc hóa học VLC giống hệt cellulose thực vật Tuy nhiên, cấu trúc đa phân tính chất VLC khác với cellulose thực vật [2].Theo AJ Brown (1886), VLC gồm nhiều sợi siêu nhỏ có chất hemicellulose, đường kính 1,5 nm, kết hợp với Các sợi kết hợp với thành bó, nhiều bó hợp thành dãy [17] 1.1.2 Tính chất màng vật liệu cellulose - Vật liệu cellulose cellulose suốt, cấu trúc mạng tinh thể mịn, sức căng độ bền sinh học cao - Khả giữ nước hấp thụ nước cực tốt, tính xốp chọn lọc - Có độ tinh cao so với loại cellulose khác, không ligin hemicellulose - Khả tạo sợi, kết tinh tốt - Tính bền tốt, khả chịu nhiệt tốt [12] - Lớp màng vật liệu cellulose tổng hợp cách trực tiếp Vi khuẩn tổng hợp màng vật liệu cellulose dạng màng mỏng dạng sợi cực nhỏ 1.1.3 Ứng dụng màng vật liệu cellulose VLC ứng dụng nhiều lĩnh vực khác như: thực phẩm, mỹ phẩm, công nghiệp dệt, công nghệ giấy,… đặc biệt lĩnh vực y học Trong y học, màng VLC thu từ q trình ni cấy tĩnh nghiên cứu sử dụng làm da nhân tạo Trường Đại học Y dược Thành phố Hồ Chí Minh nghiên cứu sử dụng màng VLC có tẩm dầu mù u làm màng trị bỏng Chương Vật liệu phương pháp nghiên cứu 2.1 Vật liệu nghiên cứu 2.1.1 Giống vi khuẩn Giống vi khuẩn Gluconacetobacter xylinus mua từ Nhật Bản 2.1.2 Nguyên liệu hóa chất - Nguyên liệu: nước cất lần, gạc vô trùng - Hóa chất: + Thuốc berberine hydrochloride dạng tinh khiết (Sigma – Mỹ) + Nước dừa già, pepton + Amoni sunfat, diamoni photphat hydro, glucose, acid acetic, natri hydroxit, cồn 2.1.3 Thiết bị dụng cụ - Máy đo quang phổ UV – 2450 (Shimadzu – Nhật Bản) - Buồng cấy vô trùng (Haraeus) - Cân kỹ thuật (Sartorius – TE612) - Cân phân tích (Sartorius – Thụy Sỹ) - Nồi hấp khử trùng HV – 110/HIRAIAMA - Máy lắc tròn (Orbital Shakergallenkump – Anh) - Tủ sấy, tủ ấm (Binder – Đức) - Tủ lạnh Electrolux - Bình tam giác, hộp lồng, ống nghiệm, pipet, 2.1.4 Vật liệu làm môi trường nuôi cấy màng VLC Màng VLC tạo cách nuôi cấy Gluconacetobacter xylinus môi trường nước dừa già Thành phần khối lượng chất có mơi trường ni cấy màng VLC thể bảng 2.1 Bảng 2.1 Môi trường tạo màng VLC STT Hóa chất Glucose Pepton Diamoni photphat hydro Amoni sulfat Nước dừa già Khối lượng 30g 10g 0,3g 0,5g 1000ml 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp tạo màng VLC 2.2.1.1 Tạo màng VLC thô Chuẩn bị môi trường bảng 2.1, hấp khử trùng 1130C 15 phút sau khử trùng tia UV 30 phút để nguội môi trường bổ sung 20% dịch giống, lắc tay cho giống phân bố đề bình Dùng gạc vơ trùng bịt miệng bình, ủ tĩnh khoảng 10-15 ngày 260C sau thu màng VLC thơ 2.1.1.2 Xử lí màng VLC trước hấp thụ thuốc Quy trình xử lí màng VLC trước hấp thụ thuốc biểu diễn theo sơ đồ 2.1 Lấy màng VLC bình ni cấy Rửa nước cất Cho vào bình NAOH 3% Hấp 113oC, 15 phút Xả nước 24 Thu VLC tinh khiết Sơ đồ 2.1 Quy trình xử lí thu VLC tinh khiết 10 2.2.2 Phương pháp xây dựng đường chuẩn - Chuẩn bị dung dịch cồn 960C - Chuẩn bị dung dịch chứa thuốc Berberine Hydrochloride nồng độ khác là: 5%; 10%; 20%; 30%; 40%; 50% - Dùng máy đo quang phổ UV – 2450 để đo cường độ quang phổ dung dịch pha bước sóng 345nm [6] - Mỗi trường hợp đo lần lấy kết trung bình - Dựng đồ thị đường chuẩn lập phương trình đường chuẩn Berberine Hydrochloride phần mềm Excel 2010 - Phương trình biểu diễn mối quan hệ nồng độ độ hấp thụ có dạng: y = ax + b với R2 hệ số tương quan Trong : x : Nồng độ thuốc (mg/ml) y : Giá trị OD tương ứng với nồng độ x 2.2.3 Phương pháp xác định lượng thuốc hấp thụ vào màng Khối lượng thuốc hấp thụ vào màng tính theo cơng thức nghiên cứu tác giả Nguyễn Xuân Thành cộng [18] Lượng thuốc Berberine Hydrochloride hấp thụ vào màng thử nghiệm mẫu : màng VLC dày 0,3cm 0,5cm Cho mẫu màng loại 70% nước vào bình tam giác (mỗi bình 10 màng đục) có chứa 100ml dung dịch Berberine Hydrochloride 10% Cho bình vào máy lắc 180 vòng/phút 400C Sau giờ; 1,5 giờ; lấy mẫu đo quang phổ để xác định lượng thuốc hấp thụ vào màng đến giá trị OD khơng đổi Lặp lại thí nghiệm lần lấy giá trị trung bình để tính tốn, xác định lượng thuốc hấp thu vào màng VLC theo công thức : mht = m1 – m2 (mg) Trong đó: (2) mht: khối lượng thuốc hấp thu vào màng m1: khối lượng thuốc ban đầu dung dịch 11 m2: khối lượng thuốc dung dịch sau khoảng thời gian màng hấp thụ thuốc Hiệu hấp thụ thuốc vào màng tính theo cơng thức: EE(%) = Trong đó: 𝒎𝒉𝒕 𝒎𝟎 × 100% (3) EE: phần trăm thuốc nạp vào màng mht (mg/cm3): khối lượng thuốc hấp thụ đơn vị thể tích màng m0 (mg/cm3): khối lượng thuốc đơn vị thể tích ban đầu 2.2.4 Phương pháp phân tích thống kê Phân tích xử lý số liệu thơng qua phần mềm Excel 2013 Kiểm định giả thuyết giá trị trung bình mẫu hàm: t – Test: Two Sample Assuming Unequal Variences với ý nghĩa α = 0,05 Tất liệu trình bày theo giả định trung bình độ lệch chuẩn “MEAN ± SD” 12 Chương Kết nghiên cứu thảo luận 3.1 Kết tạo vật liệu VLC 3.1.1 Thu màng VLC thô Vi khuẩn Gluconacetobacter xylinus cho vào môi trường nuôi cấy già sử dụng chất dinh dưỡng môi trường để tạo nên màng VLC Độ dày màng phụ thuộc vào thời gian nuôi cấy điều kiện chất dinh dưỡng Sau khoảng 10 – 14 ngày, thu màng VLC có độ dày 0,3cm 0,5cm từ mơi trường nước dừa già hình 3.1 a Màng VLC thô 0,3cm 13 b Màng VLC thô 0,5cm c Màng VLC thơ (d = 8cm) Hình 3.1 Màng VLC thô lên men từ môi trường nước dừa già Qua hình 3.1 thấy: màng VLC thơ lên men từ mơi trường nước dừa già có màu trắng đục; có tính chất nhẵn, mịn, dai có chứa nhiều nước 3.1.2 Tạo màng VLC tinh khiết Xử lý màng VLC thơ theo quy trình nêu hình 2.1 thu VLC tinh khiết Màng VLC tinh khiết có đặc điểm: khơng tạp chất, khơng mùi chua, mềm mại, độ bền cao, độ đàn hồi tốt, dễ gấp mà không cần thêm vật liệu dẻo Hình ảnh màng VLC tinh khiết trình bày hình 3.2 a Màng VLC tinh khiết (d = 8cm) 14 b Màng VLC tinh khiết (d = 1,5cm) Hình 3.2 Màng VLC tinh khiết sau xử lí 3.2 Đường chuẩn hấp thụ thuốc berberine hydrochloride Giá trị OD dung dịch thuốc berberine hydrochloride nồng độ khác thể bảng 3.1 Bảng 3.1 Giá trị OD dung dịch thuốc berberine hydrochloride nồng độ (mg/ml) khác (n = 3) STT Nồng độ (mg/ml) 10 20 30 40 50 Giá trị OD 345nm Lần Lần Lần 0,355 0,351 0,353 0,691 0,719 0,72 1,552 1,52 1,50 2,185 2,21 2,22 3,017 2,98 3,015 3,608 3,59 3,65 Giá trị trung bình 0,353 ± 0,02 0,71 ± 0,016462 1,524 ± 0,02623 2,205 ± 0,018028 3,004 ± 0,020809 3,616 ± 0,03079 Dựng đồ thị biểu diễn lập phương trình đường chuẩn berberine hydrochloride phần mềm Excel 2013, kết đồ thị hình 3.4 15 OD345nm y = 0.0734x + 0.0056 R² = 0.9986 Mật độ quang OD (Abs 345nm) 3.5 2.5 OD345nm 1.5 Linear (OD345nm) 0.5 0 10 20 30 40 50 Nồng độ thuốc beberine hydrochlorid (mg/ml) 60 Hình 3.4 Phương trình đường chuẩn berberine hydrochlorid Phương trình đường chuẩn: y = 0,0734x + 0,0056 (R2 = 0,9986) Trong đó: (1) x: Nồng độ berberine hydrochlorid (mg/ml) y: Giá trị OD tương ứng với nồng độ x R : Hệ số tương quan 3.3 Khả hấp thụ thuốc berberine hydrochlorid màng VLC Loại bỏ 70% nước màng VLC trước hấp thụ thuốc Sau đó, cho 10 màng đục (d = 1,5cm) vào bình chứa 100ml dung dịch berberine hydrochlorid 10% Đặt bình vào máy lắc 180 vòng/phút 400C tiến hành lấy mẫu giờ; 1,5 giờ; Màng VLC hấp thụ thuốc thể hình 3.5 16 Hình 3.5 Màng VLC hấp thụ thuốc Sau khoảng thời gian giờ; 1,5 giờ; lấy dung dịch đo quang phổ UV – 2450 để xác định lượng thuốc hấp thụ vào màng Kết đo quang phổ trình bày bảng 3.2 Bảng 3.2 Giá trị OD dung dịch berberine hydrochlorid 10% ngâm màng VLC (n = 3) môi trường nước dừa già Độ dày màng 0,3cm 0,5cm Giờ hấp thụ 1,5 1,5 Giá trị OD 345nm Lần Lần Lần 0,6492 0,6501 0,6488 0,6581 0,6493 0,6579 0,6594 0,6598 0,6599 0,6880 0,6810 0,6800 0,6630 0,6670 0,6700 0,6610 0,6611 0,6600 Giá trị trung bình 0,6494 ± 0,0007 0,6551 ± 0,005 0,6597 ± 0,0003 0,683 ± 0,0044 0,6667 ± 0,0035 0,6607 ± 0,0006 Từ bảng 3.2 ta thấy, màng VLC hấp thụ thuốc, giá trị OD trung bình thuốc giảm dần sau gần khơng giảm Có thể sau hàm lượng thuốc berberine hydrochlorid hấp thụ vào màng đạt cực đại Sử dụng hàm t – Test: Two Sample Assuming Unequal Variances, so sánh giá trị OD trung bình khoảng thời gian 1,5 màng 17 0,3cm Kết quả: t Stat (1,5837) < t Critical two-tail (4,3027), mặt khác P(T 0,05 Nên giá trị OD trung bình khoảng thời gian khơng có ý nghĩa thống kê Vì nên kết cho thấy khơng có khác biệt khả hấp thụ thuốc 1,5 màng 0,3cm Sử dụng hàm t – Test: Two Sample Assuming Unequal Variances, so sánh giá trị OD trung bình khoảng thời gian 1,5 màng 0,5cm Kết quả: t Stat (2,8996) < t Critical two-tail (4,3027), mặt khác P(T 0,05 Nên giá trị OD trung bình khoảng thời gian khơng có ý nghĩa thống kê Vì nên kết cho thấy khơng có khác biệt khả hấp thụ thuốc 1,5 màng 0,5cm Nhận xét: Giá trị OD trung bình khơng thay đổi cho màng VLC hấp thụ thuốc từ 1,5 đến độ dày màng (0,3cm; 0,5cm) Lượng thuốc berberine hydrochloride hấp thụ vào màng đạt cực đại Lấy giá trị OD trung bình thu bảng 3.2 thay vào phương trình đường chuẩn berberine hydrochlorid ta tìm nồng độ berberine hydrochlorid (C%), từ C% ta tìm khối lượng berberine hydrochlorid lại có dung dịch (m1), lấy khối lượng berberine hydrochlorid có dung dịch thay vào công thức (2) ta khối lượng berberine hydrochlorid hấp thụ vào màng VLC (mht), từ tính tỷ lệ berberine hydrochlorid hấp thụ vào màng theo cơng thức (3) Kết trình bày bảng 3.3 Bảng 3.3 Lượng thuốc berberine hydrochlorid hấp thụ vào màng VLC (n = 3) Độ dày màng (cm) Thời gian hấp thụ cực đại (giờ) Khối lượng Thể tích thuốc màng hấp thụ (mg) (cm3) Cường độ hấp thụ màng EE (%) (mg/cm3) 0,3 1,0882 ± 0,0039 5,3 0,2053 ± 0,0007 10,8816 ± 0,0394 0,5 1,0749 ± 0,0083 8,8 0,1222 ± 0,0009 10,703 ± 0,0115 18 Nhận xét: Từ bảng 3.3, ta thấy cường độ hấp thụ thuốc berberine hydrochloride qua màng VLC độ dày khác nhau, cụ thể: Sau giờ, màng VLC có độ dày 0,3cm có hiệu suất hấp thụ thuốc 10,8816% cao màng có độ dày 0,5cm 10,703% Như vậy, màng mỏng hiệu suất hấp thụ thuốc tốt so với màng dày Sử dụng hàm t – Test: Two Sample Assuming Unequal Variances để kiểm định giả thuyết, so sánh hiệu suất hấp thụ thuốc màng 0,3cm 0,5cm Kết quả: t Stat (8,5356) > t Critical two-tail (4,3027), mặt khác P(T