Phân tích trình tự ORF2 của PCV2 từ heo nuôi ở một số tỉnh phía nam và nghiên cứu vắc xin phòng bệnh liên quan PCV2 trên heo sau cai sữa tt

1 MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài PCV2 liên quan đến số bệnh heo, gọi chung bệnh circovirus heo (Procine circovirus diseases - PCVDs) (Segalés ctv, 2012) Trong đó, đáng lưu ý hội chứng còi cọc heo sau cai sữa (postweaning multisystemic wasting syndrome - PMWS) làm gia tăng tỉ lệ heo chết loại thải, tăng tiêu tốn thức ăn giảm tăng trọng, gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến hiệu kinh tế chăn nuôi heo Các ca nghi ngờ PMWS heo báo cáo Việt Nam vào cuối năm 2004 có liên quan đến việc gia tăng tình trạng còi cọc đàn heo sau cai sữa (Lâm Thị Thu Hương ctv, 2005) Sự đa dạng di truyền PCV2 không mối quan tâm mặt dịch tễ, mà hiệu bảo hộ vắc-xin phòng bệnh PCV2 Các nghiên cứu trình tự gen cho thấy, PCV2 lưu hành hầu khắp tỉnh thành Việt Nam xếp vào genotype 2b, 2d nhóm tái tổ hợp (Nguyễn Ngọc Hải ctv, 2013; Huỳnh Thị Mỹ Lệ ctv, 2012; 2013; Phạm Hồng Quân ctv, 2017) Tiêm vắc-xin PCV2 áp dụng rộng rãi Việt Nam, giúp cải thiện tăng trọng bình quân hàng ngày, giảm tỉ lệ chết loại thải, giảm lượng vi-rút thải giảm bệnh tích vi thể mơ bạch huyết Tuy nhiên, tất loại vắc-xin dựa genotype PCV2a, PCV2 lưu hành Việt Nam chủ yếu thuộc genotype PCV2b, PCV2d nhóm tái tổ hợp Takahagi ctv (2010) cho rằng, genotype PCV2 ảnh hưởng đến hiệu phòng PMWS vắc-xin Do đó, việc nghiên cứu chế tạo vắc-xin từ chủng PCV2b, genotype lưu hành phổ biến Việt Nam cần thiết, nhằm giúp chủ động nguồn cung vắc-xin, góp phần hiệu phòng bệnh PMWS giảm giá thành chăn nuôi Để giải vấn đề thực tiễn trên, đề tài: “Phân tích trình tự ORF2 PCV2 từ heo ni số tỉnh phía Nam nghiên cứu vắc-xin phòng bệnh liên quan PCV2 heo sau cai sữa” tiến hành Mục tiêu luận án - Xác định genotype đánh giá tương đồng di truyền PCV2 lưu hành số tỉnh thành Việt Nam - Nghiên cứu chế tạo vắc-xin phòng bệnh liên quan PCV2 heo sau cai sữa Những đóng góp khoa học - Xác định đa dạng di truyền lưu hành genotype PCV2 Việt Nam từ năm 2007 - 2016 - Phân lập số chủng PCV2 làm nguồn gen việc nghiên cứu chế tạo vắc-xin - Sản xuất thử nghiệm thành công vắc-xin PCV2 vô hoạt nhũ dầu chủng PCV2b phân lập thực địa Bố cục luận án Luận án dài 125 trang, gồm mở đầu (3 trang), tổng quan (39 trang), nội dung phương pháp nghiên cứu (20 trang), kết thảo luận (61 trang), kết luận đề nghị (2 trang), có 23 bảng, 15 hình, 11 biểu đồ, 292 tài liệu tham khảo (17 tiếng Việt 275 tiếng nước ngồi) 12 phụ lục Trong tóm tắt luận án này, chúng tơi trình bày từ chương trở phần nội dung 2 Chương NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Thời gian địa điểm Được thực từ năm 2012 đến 2018, Trung Tâm Nghiên Cứu Thú Y thuộc Công ty cổ phần thuốc thú y trung ương NAVETCO, Trường Đại học Nơng Lâm thành phố Hồ Chí Minh 44 trại heo 13 tỉnh thành Việt Nam bao gồm 12 tỉnh thành phía Nam (Cà Mau, Cần Thơ, Bến Tre, Long An, Tp Hồ Chí Minh, Tây Ninh, Bình Dương, Đồng Nai, Lâm Đồng, Khánh Hòa, Phú Yên Bình Định) tỉnh Bắc Trung Bộ (Nghệ An) 2.2 Vật liệu - Sinh phẩm - Bộ kit - Động vật thí nghiệm Tế bào dòng thận heo PK15A, đối chứng dương PCV2b Phòng thí nghiệm sức khỏe động vật quốc gia Úc - AAHL cung cấp Bộ kít ly trích ADN QIAamp® Mini kit (QIAGEN, Đức), hóa chất ni cấy tế bào (Gibco, Mỹ) Bộ kít ELISA Ingezim PCV IgG (Ingenasa, Tây Ban Nha), HRP protein A (Invitrogen, Mỹ), bromoethylamine (Sigma, Mỹ), sodium thiosulfate (Merck, Đức) Heo tuần tuổi từ số trại heo thương phẩm kiểm tra âm tính với kháng nguyên PCV2, CSFV, PRRSV Mycoplasma hyopneumoniae (kiểm tra phương pháp PCR, RT-PCR) 2.3 Nội dung nghiên cứu (1) Khảo sát đa dạng di truyền PCV2 số tỉnh thành miền Nam Việt Nam (2) Khảo sát đặc tính sinh học chủng PCV2 phân lập (3) Nghiên cứu chế tạo vắc-xin PCV2 vơ hoạt nhũ dầu (4) Khảo sát tính an tồn hiệu lực vắc-xin PCV2 vô hoạt nhũ dầu điều kiện phòng thí nghiệm 2.4 Phương pháp nghiên cứu 2.4.1 Phân tích di truyền PCV2 số tỉnh thành miền Nam Việt Nam Tổng cộng 48 mẫu bệnh phẩm heo dương tính ADN-PCV2 thu thập từ năm 2007-2016 từ 44 trại heo 13 tỉnh thành phía Nam Việt Nam Mẫu bệnh phẩm bảo quản -700C Xác định mẫu dương tính ADN-PCV2 phương pháp PCR thực NAVETCO Gởi sản phẩm PCR để giải trình tự đoạn gen ORF2 PCV2 1st BASE – Malaysia Trình tự chuỗi nucleotide gen ORF2 chủng vi-rút thực địa chủng vi-rút tham khảo xếp vào cột so sánh tương đồng phần mềm BioEdit 7.2.5 (2013) Sử dụng phần mềm MEGA 5.2.2 (2012) theo phương pháp Neighbor-joining (NJ) với bootstrap 1000 lần lặp lại để thiết lập phát sinh chủng loại Sử dụng phần mềm RDP phiên 4.39 (2015) SimPlot phiên 3.5.1 (2003) để phân tích tái tổ hợp ước đốn vị trí tái tổ hợp (recombinant breakpoint) 2.4.2 Khảo sát đặc tính sinh học chủng PCV2 phân lập 2.4.2.1 Phân lập PCV2 môi trường tế bào PK15A Phân lập PCV2 từ 21 mẫu bệnh phẩm (9 mẫu hạch, mẫu phổi, mẫu huyết mẫu lách) từ 48 mẫu dương tính ADN-PCV2 (đã xác định genotype) cách nuôi cấy tế bào dòng PK15A theo quy trình chuyển giao kỹ thuật từ Phòng thí nghiệm sức khỏe động vật quốc gia Úc Mỗi mẫu tiếp đời lần Ở lần tiếp đời thứ 3, mẫu xác định dương tính phương pháp PCR nhuộm IPX, sau xác định hiệu giá vi-rút Chuẩn độ hiệu giá PCV2 phân lập môi trường tế bào PK15A theo quy trình AAHL Hiệu giá vi-rút thể log10 TCID50/ml phương pháp Reed-Muench (1938) 2.4.2.2 Xác định liều lượng vi-rút gây nhiễm Sử dụng dịch nuôi cấy vi-rút chủng NAVET-DongNai2/2009 (PCV2b) lần tiếp đời thứ (P6) để khảo sát hiệu giá vi-rút PCV2 tế bào PK15A với tỉ số gây nhiễm (lượng vi-rút/ lượng tế bào), MOI (multiplicity of infection) khác gồm 0,01; 0,02; 0,05; 0,1 Cụ thể, tế bào PK15A dạng tế bào tươi (tế bào sau tách rời trypsin) nhiễm vi-rút với lượng vi-rút/lượng tế bào tính tốn để đạt tỉ số gây nhiễm MOI Tế bào nhiễm nuôi chai 25 cm2 (T25) với số lượng T25/nồng độ/thời điểm thu hoạch Sau 24 gây nhiễm tiến hành xử lý Dglucosamine mô tả mục 2.5.4 luận án Thu hoạch vi-rút thời điểm khác nhau: 72, 96 120 sau gây nhiễm Thí nghiệm lặp lại lần Xác định liều lượng vi-rút gây nhiễm thời gian thu hoạch để thu dịch vi-rút có hiệu giá cao 2.4.2.3 Xác định thời gian thu hoạch tối ưu chủng phân lập Các chủng phân lập NAVET-DongNai2/2009 (PCV2b), NAVET-LongAn2/2012 (PCV2d) NAVET-vietnam3/2004 (PCV2-Re (2h)) (ở lần tiếp đời thứ 7) gây nhiễm tế bào PK15A (dạng tế bào tươi) với tỉ số gây nhiễm MOI = 0,1 Tế bào nhiễm nuôi chai 25 cm2 (T25), với số lượng T25/chủng/thời điểm thu hoạch Sau 24 gây nhiễm, tiến hành xử lý D-glucosamine mô tả mục 2.5.4 luận án Thu hoạch vi-rút theo thời gian 12 giờ, từ thời điểm 36 đến 120 sau gây nhiễm Thí nghiệm thực lặp lại lần Xác định thời gian thu hoạch để thu dịch vi-rút có hiệu giá cao đối với chủng 2.4.2.4 So sánh tương đồng kháng nguyên chủng PCV2 phân lập thuộc genotype khác Các chủng vi-rút dùng thí nghiệm chủng NAVET-DongNai2/2009 (PCV2b), NAVET-LongAn2/2012 (PCV2d) NAVET-vietnam3/2004 (PCV2-Re) Các mẫu huyết heo chứa kháng thể chống PCV2b: thu thập từ heo đối chứng (6ĐC3, 8ĐC3 10ĐC3) 28 dpc thí nghiệm 3; chống PCV2d: mẫu huyết từ heo thu thập 28 ngày sau gây nhiễm với chủng NAVET-LongAn2/2012 (PCV2d) (số liệu thí nghiệm chưa cơng bố); chống PCV2-Re: mẫu huyết lưu trữ từ thí nghiệm gây nhiễm chủng NAVET-vietnam3/2004 heo tác giả Nguyễn Thị Thu Hồng ctv (2008) Bảng 2.2 Bố trí thí nghiệm phản ứng trung hòa chéo chủng PCV2 phân lập Vi-rút trung hòa Mẫu huyết heo PCV2b PCV2d PCV2-Re* Kháng PCV2b Trung hòa Trung hòa chéo Trung hòa chéo Kháng PCV2d Trung hòa chéo Trung hòa Trung hòa chéo Kháng PCV2-Re (2h)* Trung hòa chéo Trung hòa chéo Trung hòa * PCV2-Re (2h): recombinant (nhóm tái tổ hợp), 2h: theo phân loại Franzo Segalés (2018) Thực phản ứng trung hòa chéo chủng PCV2 phân lập thuộc genotype PCV2b, PCV2d PCV2-Re (2h) với mẫu huyết heo chứa kháng thể chống lại PCV2b, PCV2d PCV2-Re (2h), mẫu huyết thực lặp lại lần Thí nghiệm bố trí theo Bảng 2.2 Phương pháp trung hòa thực dựa theo quy trình Fort ctv (2007) (trình bày mục 2.5.3.3) 2.4.2.5 Thí nghiệm 1: Đánh giá khả gây bệnh tính sinh miễn dịch chủng NAVET-DongNai2/2009 (PCV2b) Chủng vi-rút NAVET-DongNai2/2009 (PCV2b), khảo sát đặc tính di truyền đặc tính ni cấy mơi trường tế bào PK15A sử dụng Liều gây nhiễm: heo lơ thí nghiệm nhỏ mũi ml tiêm bắp ml dịch vi-rút phân lập tiếp đời thứ với hiệu giá 5,33log10 TCID50/ml Sử dụng dịch chiết tế bào PK15A lơ đối chứng Thí nghiệm gồm heo tuần tuổi, thời điểm chuyển heo có kháng thể thụ động kháng PCV2, hàng tuần heo lấy máu để kiểm tra kháng thể PCV2 phương pháp IPMA Tiến hành gây nhiễm thí nghiệm lúc heo 10 tuần tuổi Nhằm tránh ảnh hưởng kháng thể thụ động đến việc đánh giá tính gây bệnh PCV2 heo, heo (có ký hiệu 1TN1, 4TN1, 5TN1, 6TN1, 10TN1, 12TN1) có hiệu giá kháng thể thụ động  5,32log2 chọn vào lơ thí nghiệm Ba heo (có ký hiệu 2ĐC1, 3ĐC1, 11ĐC1) kháng thể thụ động (trung bình 10,31log2) xếp vào lơ đối chứng Hai lô heo nuôi khu chuồng riêng biệt Theo dõi biểu lâm sàng hô hấp (khó thở, ho, chảy dịch mũi), tiêu chảy, sưng hạch bẹn cạn, tình trạng lơng, da Đo nhiệt độ trực tràng heo ngày lần, từ thời điểm trước gây nhiễm ngày đến 21 ngày sau gây nhiễm (day post challenge - dpc) Cân khối lượng heo, lấy máu kiểm tra số lượng bạch cầu, tình trạng vi-rút huyết, hiệu giá kháng thể thời điểm 0, 7, 14 21 dpc Mổ khảo sát bệnh tích dpc (heo 6TN1, lơ thí nghiệm), 14 dpc (heo 5TN1, lơ thí nghiệm heo 3ĐC1, lơ đối chứng) 21 dpc (heo 10TN1, lơ thí nghiệm) 2.4.3 Nghiên cứu chế tạo vắc-xin PCV2 vô hoạt nhũ dầu 2.4.3.1 Quy trình vơ hoạt PCV2 - Xác định nồng BEI bất hoạt hồn tồn PCV2 Vi-rút: dịch ni cấy chủng NAVET-DongNai2/2009 (PCV2b) lần tiếp đời thứ chuẩn độ hiệu giá vi-rút đạt 6log10 TCID50/ml Quy trình vơ hoạt PCV2 xây dựng dựa quy trình Bahnemann (1975; 1990) Binary ethylenimine (BEI) 0,1 M chuẩn bị cách tạo vòng 2bromoethylamine 0,2 M NaOH 370C trữ 40C sử dụng vòng 18 sau chuẩn bị PCV2 vô hoạt cách ủ với nồng độ BEI cuối khác mM, mM mM nhiệt độ 370C vòng 24 Thể tích dịch vi-rút nồng độ BEI 200 ml Lấy mẫu kiểm tra hiệu giá vi-rút 10 đầu vô hoạt BEI trung hòa 0,1 mM sodium thiosulphate vòng 370C Vi-rút sau vô hoạt trữ -700C Xác định vi-rút vơ hoạt hồn toàn hay chưa cách ủ ml dịch vi-rút sau vô hoạt với tế bào PK15A, đánh quy trình phân lập PCV2 Thí nghiệm thực lặp lại lần PCV2 xem vơ hoạt hồn tồn kết phân lập dịch vi-rút sau bất hoạt lần tiếp đời âm tính 5 - Xác định khả bất hoạt hoàn toàn PCV2 thuộc chủng khác với nồng độ BEI mM Nhằm xác nhận khả vơ hoạt hồn tồn chủng PCV2 thuộc genotype khác BEI nồng độ thích hợp Sau xác định nồng độ BEI mM vơ hoạt hồn tồn PCV2 chủng NAVET-DongNai2/2009 (PCV2b), tiến hành vô hoạt đồng thời chủng NAVET-DongNai2/2009 (PCV2b), NAVET-LongAn2/2012 (PCV2d) NAVET-vietnam3/2004 (PCV2-Re (2h)) nồng độ BEI mM, nhiệt độ 370C vòng 24 Thể tích dịch vi-rút chủng 200ml Lấy mẫu kiểm tra hiệu giá vi-rút 10 đầu vơ hoạt BEI trung hòa sodium thiosulphate M với thể tích 10% thể tích BEI sử dụng, vòng 370C Vi-rút sau vô hoạt trữ -700C 2.4.3.2 Chế tạo vắc-xin PCV2 vô hoạt nhũ dầu Chế tạo vắc-xin vô hoạt nhũ dầu chứa kháng nguyên PCV2 chủng NAVETDongNai2/2009: Vi-rút sau vô hoạt (đã kiểm tra vô hoạt hồn tồn) phối trộn với nhũ dầu theo cơng thức nhũ Công ty NAVETCO, liều vắc-xin (2 ml) chứa lượng kháng nguyên vi-rút 4,5log10 6,0log10 TCID50/liều (hiệu giá vi-rút trước vô hoạt) 2.4.3.3 Tính an tồn hiệu lực vắc-xin vơ hoạt nhũ dầu thử nghiệm Thí nghiệm 2: Đánh giá an toàn khả gây đáp ứng miễn dịch vắc-xin thử nghiệm Năm heo tuần tuổi (âm tính với PCV2, CSFV PRRSV xác định phương pháp PCR RT-PCR) chuyển trại chăn nuôi Công ty NAVETCO Tại thời điểm chuyển heo kháng thể thụ động kháng PCV2 Lúc tuần tuổi có heo có hiệu giá kháng thể thụ động giảm xuống thấp (hiệu giá IPMA trung bình 6,64log2) bố trí vào lơ vắc-xin gồm heo (các heo có ký hiệu 5TN2, 9TN2, 11TN2) tiêm vắc-xin lần (2 ml/ liều, chứa lượng kháng nguyên 4,5log10 TCID50/liều) cách 21 ngày lô đối chứng gồm heo (heo có ký hiệu 14ĐC2, 15ĐC2) (có hiệu giá kháng thể thụ động cao, hiệu giá IPMA trung bình 9,64log2) heo tiêm ml dịch chiết tế bào PK15A Biểu lâm sàng theo dõi hàng ngày từ thời điểm trước tiêm vắc-xin ngày đến sau tiêm vắc-xin lần thứ 21 ngày sau tiêm vắc-xin lần thứ hai 28 ngày bao gồm: phản ứng viêm vị trí tiêm, phản ứng tồn thân, biểu hơ hấp, tiêu hóa, tình trạng lơng, da Thân nhiệt: đo nhiệt độ trực tràng heo ngày lần sáng (8 giờ) chiều (16 giờ) từ thời điểm trước tiêm vắc-xin ngày đến sau tiêm vắc-xin 21 ngày Trọng lượng: cân khối lượng heo lúc 21 sau tiêm vắc-xin lần 28 ngày sau tiêm vắc-xin lần Kháng thể chống PCV2 kiểm tra vào lúc 0, 7, 14, 21 ngày sau tiêm vắcxin lần 1, vào thời điểm 7, 14, 21, 28 ngày sau tiêm vắc-xin lần Thí nghiệm 3: Đánh giá hiệu lực vắc-xin thử nghiệm: gồm 10 heo tuần tuổi chọn lựa có kháng thể thụ động IPMA thấp (5,64log2 – 6,64log2) Heo bố trí gồm lô: lô vắc-xin gồm heo (heo số 1TN3, 2TN3, 3TN3, 4TN3, 5TN3, 7TN3) tiêm liều vắc-xin thử nghiệm (2 ml/ liều, chứa lượng kháng nguyên 6,0log10 TCID50/liều) lô đối chứng gồm heo (heo số 6ĐC3, 8ĐC3, 9ĐC3, 10ĐC3) tiêm ml dịch chiết tế bào PK15A lúc heo tuần tuổi Sau tiêm vắc-xin 28 ngày, tất heo công cường độc cách nhỏ mũi ml tiêm bắp ml với vi-rút chủng NAVET-DongNai2/2009 tiếp đời thứ với hiệu giá 5,33log10TCID50/ml Biểu lâm sàng thân nhiệt theo dõi hàng ngày từ thời điểm trước tiêm vắc-xin ngày đến sau tiêm vắc-xin 28 ngày sau công cường độc 28 ngày Cân heo lúc 28 dpv 28 dpc Kháng thể chống PCV2 kiểm tra vào lúc 0, 7, 14, 21, 28 dpv 7, 14, 21, 28 dpc Tình trạng vi-rút huyết, số lượng bạch cầu, tình trạng xuất vi-rút qua phân dịch tiết mũi kiểm tra vào lúc 0, 7, 14, 21 28 dpc Bệnh tích đại thể vi thể: lúc 28 ngày sau cơng độc, chọn heo có khối lượng thể nhỏ nhất, biểu lâm sàng bất thường lơ mổ khảo sát bệnh tích 2.5 Kỹ thuật xét nghiệm Phương pháp trung hòa PCR phát ADN-PCV2 thực dựa theo quy trình Fort ctv (2007) Phương pháp phân lập chuẩn độ PCV2 môi trường tế bào PK15A phương pháp IPMA để phát kháng thể kháng PCV2 thực theo quy trình AAHL Sử dụng kít thương mại Ingezim CIRCO IgG (Ingenasa, Tây Ban Nha) để phát kháng thể IgG kháng PCV2 Thực quy trình phản ứng theo hướng dẫn nhà cung cấp Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân tích di truyền phân lập PCV2 số tỉnh thành Việt Nam 3.1.1 Phân tích phát sinh chủng loại dựa ORF2 PCV2 Kết phân tích phát sinh chủng loại dựa ORF2 48 mẫu PCV2 thu thập từ năm 2007 đến 2016 từ 13 tỉnh thành Việt Nam (Hình 3.1) cho thấy, mẫu PCV2 xếp vào PCV2b chiếm 50,00% (24/48), PCV2d chiếm 33,33% (16/48) PCV2-Re (2h) chiếm 16,67% (8/48), mẫu PCV2 xếp vào genotype PCV2a Theo cách phân loại mới Franzo Segalés (2018) số chủng PCV2 trước xếp vào nhóm tái tổ hợp xếp vào genotype PCV2h Vì phần trình bày chủng PCV2 trước xếp vào nhóm tái tổ hợp mà theo cách phân loại mới xếp vào PCV2h viết tắt PCV2-Re (2h) Sự phân bố theo thời gian nguồn gốc địa lý 48 mẫu PCV2 nghiên cứu thể qua Biểu đồ 3.1 Biểu đồ 3.2 Qua cho thấy lưu hành phổ biến genotype PCV2b qua năm khảo sát, đồng thời có xuất ngày trở nên phổ biến genotype PCV2d, đặc biệt PCV2d-2 Có lưu hành lúc nhiều genotype địa phương Các nghiên cứu dịch tễ học toàn giới chứng minh phân bố theo thời gian genotype PCV2 có biến đổi toàn cầu từ PCV2a sang PCV2b xuất vượt trội PCV2b từ sau năm 2003 (Olvera ctv, 2007; Cortey ctv, 2011) Các nghiên cứu gần cho thấy, PCV2d đặc biệt PCV2d-2 lưu hành phổ biến chí trở nên vượt trội so với PCV2b (Xiao ctv, 2016; Kwon ctv, 2017a) Một điều thú vị chủng NAVET-vietnam3/2004, BinhDuong6/2012 BinhDuong7/2013 phát trại qua năm khác (Hình 3.1 Phụ lục 8), chủng NAVET-vietnam3/2004, BinhDuong6/2012 xếp vào PCV2-Re (2h), chủng BinhDuong7/2013 lại xếp vào genotype PCV2b Điều nhập mới hậu bị mang theo vi-rút PCV2b có biến đổi di truyền PCV2 lưu hành trại Sự biến đổi genotype xảy theo thời gian 98 99 99 0.01 DQ629115/isolate n32eu/USA/2005 87 EU340258/strain 16845/USA/2007 EU340257/strain 17639/Canada/2006 TpHCM3/2010 NAVET-DongNai2/2009 BinhDinh6/2013 CaMau/2007 BinhDuong7/2013 KhanhHoa/2007 BinhDuong1/2009 62 BinhDuong3/2009 PhuYen/2014 99 BinhDuong11/2015 NAVET-TpHCM8/2016 LamDong2/2013 NAVET-BinhDuong2/2009 JQ181591/isolate HB1-1/Vietnam/2011 PCV2b TpHCM6/2010 AF055394/strain 48285/France TpHCM7/2010 EU886637/isolate Aust3959/Australia/2007 DongNai6/2014 FJ598044/strain WuHan/China/2008 DongNai3/2012 BinhDuong4/2009 DongNai5/2014 TpHCM1/2010 KF871068/strain SNUVR000463/Korea BinhDinh5/2013 AAHL-strain DongNai4/2013 64 DongNai1/2009 BinhDuong5/2010 vietnam5/2007 LC004742/isolate ML-7/India/2013 76 NAVET-BenTre/2014 64 KP698404/isolate DE143-14/Germany/2014 PCV2d-1 AY686763/strain SH/China/2004 AY181946/strain TJ/China/2002 NAVET-LongAn2/2012 BinhDuong10/2014 LamDong3/2013 63 BinhDuong9/2014 LamDong1/2013 73 84 BinhDinh1/2013 TayNinh/2014 LongAn1/2012 LongAn3/2012 PCV2d DongNai8/2016 64 NAVET-NgheAn1/2015 PCV2d-2 76 NAVET-NgheAn2/2015 KJ133547/strain SNUVR130689/Korea/2013 BinhDuong12/2016 DongNai7/2016 JX535296/isolate 22625-33/USA/2012 BinhDuong8/2013 HM038017/strain BDH/China/2008 JQ181600/isolate Han8/Vietnam/2011 KJ437506/strain SNUVR140004/Korea/2013 KX828231/isolate KU-1604/Korea/2016 64 96 KX828231/isolate KU-1604/Korea/2016 97 MH465453/strain GXLZ1208a/China/2012 MH465473/strain GXYL1208/China/2012 CanTho/2008 JX099781/isolate P477LG/Vietnam/2009 vietnam2/2006 HQ395058/strain 10QH/China/2010 99 KJ729072/isolate PCV2Izn-89-13/India/2013 KM042398/strain 549-QNa/Vietnam/2009 TpHCM4/2010 BinhDinh4/2013 PCV2-Re (2h) NAVET-vietnam3/2004 BinhDinh2/2013 TpHCM2/2010 BinhDuong6/2012 BinhDinh3/2013 HM776443/isolate HUN-11/China/2009 vietnam1/2002 JQ181599/isolate Han6-13/Vietnam/2011 TpHCM5/2010 AF465211/strain SC/Taiwan/2002 89 AF055392/strain 1010 Stoon/Canada/1998 87 AF264042/isolate 40895/USA/1998 PCV2a KM042397/strain 748-NA/Vietnam/2008 AY256455/strain 212/Hungary/2003 99 HM038034/strain LG/China/2008 MF139076/isolate SC5/China/1999 KT369067/strain Papuan 04.1/Indonesia/2013 PCV2f 99 LC004750/isolate MZ-5/India/2013 98 JN006443/isolate WB/ROM3/Romania/2008 FJ998185/strain SCNB/CHA/05/China/2005 PCV2g JX099786/isolate P2425NT/Vietnam/2008 99 EU148503/isolate DK1980PMWSfree/Danmark/1980 PCV2c KJ094599/strain PM163/Brazil/2010 KT867799/isolate PCV2/USA/MN-088/2006 KT867801/isolate PCV2/MEX/YU-002/2012 99 KT795287/strain MEX/41238/2014 PCV2e 94 KX510062/isolate 19792-IA-2016-APRIL 87 KT795290/strain USA/45358/2015 58 KT867795/isolate PCV2/USA/IA-084/2013 Hình 3.1 Cây phát sinh chủng loại chủng PCV2 dựa trình tự nucleotide ORF2 48 mẫu PCV2 nghiên cứu này, phân lập PCV2 tham khảo () 46 chủng tham khảo đăng ký GenBank Cây phát sinh chủng loại xây dựng phần mềm MEGA phiên 5.2.2 (2012) theo mơ hình Kimura-2 parameter, phương pháp Neighbor-joining (NJ) với bootstrap 1000 lần lặp lại mức độ trại Kwon ctv (2017a) ghi nhận nghiên cứu đa dạng di truyền biến đổi genotype PCV2 xảy Hàn Quốc Tuy nhiên, vấn đề cần nghiên cứu thêm SỐ LƯỢNG 14 Biểu đồ 3.1 Phân bố thời gian mẫu PCV2 thu thập miền Nam Việt Nam từ năm 2007 đến 2016 12 PCV2b PCV2d PCV2-Re (2h) 10 4 2007 2008 2009 2010 2012 2013 3 2014 1 2015 2016 NĂM SỐ LƯỢNG 14 12 PCV2-Re (2h) PCV2d PCV2b 10 2 1 1 1 NGUỒN GỐC Biểu đồ 3.2 Phân bố địa lý mẫu PCV2 thu thập miền Nam Việt Nam từ năm 2007 đến 2016 3.1.2 Phân tích đa dạng di truyền PCV2 dựa vào ORF2 Kết phân tích khoảng cách di truyền genotype genotype PCV2 dựa ORF2 48 mẫu PCV2 lưu hành miền Nam Việt Nam khoảng thời gian từ năm 2007 đến 2016 cho thấy, mẫu PCV2 xếp vào genotype PCV2d có tính đa dạng di truyền cao với khoảng cách di truyền p = 0,0078  0,0018, cao gần gấp đôi so với mẫu PCV2 xếp vào PCV2b (p = 0,0038  0,0014) PCV2-Re (2h) (p = 0,0038  0,0010) Ngoài ra, khoảng cách di truyền genotype biến động từ 0,0595  0,0096 đến 0,0663  0,0102, giá trị cao nhiều so với giá trị ngưỡng phân định genotype p = 0,035 (Segalés ctv, 2008) Nhìn chung, khoảng cách di truyền genotype cao, sở để phận định thành genotype riêng biệt 9 3.1.3 Đặc điểm ORF2 chủng PCV2 Việt Nam Bảng 3.2 Các a-xít a-min protein Cap khác genotype PCV2 Vị trí PCV2b PCV2d PCV2-Re (2h) 53 F I F 59 R K/A K 68 A N A 89 R L L 90 S T T 131 T T P 134 T N T 151 T T/P T 169 S R/G S 190 T/A T S 191 G G A 215 V I V 231-233 LNP LNP LHP 234 K K PCV2-Re (2h): recombinant (nhóm tái tổ hợp), 2h: theo phân loại Franzo Segalés (2018) Viết tắt A: alanine; F: phenylalanine; G: glycine; H: histidine; I: isoleucine; K: lysine; L: leucine; M: methionine; N: asparagine; P: proline; R: arginine; S: serine; T: threonine; V: valine; Y: tyrosine Phân tích kết giải trình tự toàn ORF2 48 mẫu PCV2 cho thấy, chiều dài toàn ORF2 702 nt (24/48) đối với mẫu PCV2 xếp vào genotype PCV2b, 705 nt (24/48) đối với mẫu PCV2 xếp vào PCV2d PCV2-Re (2h) Chiều dài chuỗi polypeptide protein capsid suy từ trình tự chuỗi nucleotide tương ứng 233 234 aa Phân tích tương đồng a-xít a-min genotype PCV2 cho thấy, chiều dài toàn protein capsid PCV2a PCV2b 233 aa, nhiên PCV2d, PCV2c PCV2-Re (2h) chiều dài protein capsid 234 aa, thêm lysine (ký hiệu K) vị trí 234 (Bảng 3.2) Mức độ tương đồng 24 mẫu PCV2 xếp vào genotype PCV2b cao, từ 98,7% đến 100% nucleotide từ 97,8% đến 100% a-xít a-min Tương đồng với chủng chủng 48285 chủng WuHan từ 98,5% - 99,8% nucleotide, 97,8% -99,5% a-xít amin So sánh tương đồng mẫu PCV2d-2 nghiên cứu với với số chủng tham khảo giới cho thấy chúng tương đồng với cao (98,5 - 100% nucleotide 98,2 - 100% a-xít a-min) chúng tương đồng với chủng BDH chủng SNUVR130689, từ 99,0% - 99,8% nucleotide từ 99,1 100% a-xít a-min Mức độ tương đồng mẫu PCV2 xếp vào genotype PCV2-Re (2h) biến động từ 98,7% đến 100% nucleotide a-xít a-min, mẫu PCV2 tương đồng cao với phân lập HUN-11 3.1.4 Phân tích tái tổ hợp Kết phân tích phần mềm RDP4 SimPlot 3.5.1 cho thấy có tái tổ hợp xảy mẫu PCV2 thuộc genotype PCV2-Re (2h)), bao gồm mẫu CanTho/2008, TpHCM2/2010, TpHCM4/2010, TpHCM5/2010, BinhDuong6/2012, BinhDinh2/2013, BinhDinh3/2013, BinhDinh4/2013, có bố mẹ giả định chủng AY181946/strain 10 TJ/China/2002 (PCV2d) (major parent) AF465211/strain SC/Taiwan/2002 (PCV2a) (minor parent) với phần trăm tương đồng tương ứng 95,7 – 96,3% 95,1 – 96,2% Trong đó, 7/8 mẫu có vị trí tái tổ hợp bắt đầu nucleotide 96 kết thúc vị trí 227 238, riêng mẫu CanTho/2008 có bố mẹ vị trí tái tổ hợp khác biệt so với mẫu lại với điểm bắt đầu vị trí 677 kết thúc vị trí 227 (vị trí gen ORF2) Kết phù hợp với kết phân tích phát sinh chủng loại Trong đó, mẫu CanTho/2008 xếp nhóm PCV2-Re (2h) lại nằm nhánh riêng biệt so với mẫu lại nhóm (Hình 3.1) 3.2 Kết phân lập PCV2 đặc tính ni cấy số phân lập PCV2 3.2.1 Kết phân lập PCV2 từ mẫu thực địa Phân lập PCV2 từ 21 mẫu bệnh phẩm (9 mẫu hạch, mẫu phổi, mẫu huyết mẫu lách) từ 48 mẫu dương tính ADN-PCV2 (đã xác định genotype phần 3.1) tế bào dòng PK15A Kết sau lần tiếp đời phân lập 18/21 (85,71%) mẫu dương tính PCV2 (Bảng 3.5) Trong loại mẫu bệnh phẩm dùng phân lập PCV2 mẫu hạch đạt tỉ lệ phân lập dương tính cao 100% (9/9) với hiệu giá vi-rút lần tiếp đời thứ biến động từ 1,67 đến 5,50log10 TCID50/ml Ngoài ra, PCV2 phân lập từ mẫu huyết thanh, hiệu giá vi-rút lần tiếp đời thứ thấp, đạt 1,67log10 TCID50/ml Đã phân lập 9/18 (50%) mẫu PCV2 dương tính thuộc genotype PCV2b, 6/18 (33,33%) mẫu dương tính thuộc genotype PCV2d 3/18 (16,67%) mẫu dương tính thuộc genotype PCV2-Re (2h) 3.2.2 Xác định liều lượng gây nhiễm chủng NAVET-DongNai2/2009 tế bào PK15A Hiệu giá (log10 TCID50/ml) 6.5 6.0 5.72bc 5.46b 5.86c 72 g 96 g 120 g 5.5 4.67a 5.0 4.50a 4.5 4.0 3.5 3.0 0,01 0,02 0,05 0,1 1,0 MOI Biểu đồ 3.4 Hiệu giá vi-rút theo hệ số MOI thời gian thu hoạch chủng NAVET-DongNai2/2009 a, b, c: khác biệt thống kê với P < 0,05 11 Bảng 3.5 Kết phân lập PCV2 môi trường tế bào PK15A ST T Ký hiệu mẫu Geno type Loại mẫu 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 CaMau/2007 KhanhHoa/2007 BinhDuong1/2009 NAVET-BinhDuong2/2009 BinhDuong3/2009 BinhDuong4/2009 NAVET-DongNai2/2009 TpHCM6/2010 BinhDinh5/2013 BinhDinh6/2013 NAVET-TpHCM8/2016 NAVET-LongAn2/2012 BinhDinh1/2013 LamDong1/2013 NAVET-NgheAn1/2015 NAVET-NgheAn2/2015 NAVET-BenTre/2014 CanTho/2008 TpHCM4/2010 BinhDuong6/2012 BinhDinh3/2013 2b 2b 2b 2b 2b 2b 2b 2b 2b 2b 2b 2d-2 2d-2 2d-2 2d-2 2d-2 2d-1 Re (2h)* Re (2h) Re (2h) Re (2h) Phổi Phổi Hạch Hạch Hạch Hạch Hạch Phổi Huyết Huyết Phổi Hạch Phổi Phổi Hạch Phổi Hạch Lách Hạch Phổi Phổi Loại heo Sau cai sữa Sau cai sữa Sau cai sữa Sau cai sữa Sau cai sữa Sau cai sữa 16 tuần Sau cai sữa Nái Nái Thai Sau cai sữa Thai 12 tuần Sau cai sữa Sau cai sữa Cai sữa Sau cai sữa Sau cai sữa tuần tuổi Sau cai sữa Triệu chứng lâm sànga Kết phân lập Mắc bệnh tai xanh Còi Còi Còi Còi Còi Còi, khó thở, viêm da, da nhợt nhạt Triệu chứng hô hấp: ho, khó thở Mắc bệnh tai xanh, sinh heo chết Mắc bệnh tai xanh, sẩy thai Thai khô Mắc bệnh tai xanh, viêm da Thai sẩy Mắc bệnh tai xanh, viêm da Còi Còi Khơng có liệu Khơng có liệu Mắc bệnh tai xanh, viêm da Gầy trơ xương, tiêu chảy nặng Khơng có liệu + + + + + + + + + + + + + + + + + + Hiệu giáb (P3) log10 TCID50/ml 1,67 3,67 1,67 3,67 4,50 1,67 1,67 1,67 4,00 5,50 1,67 1,67 5,50 5,00 5,00 4,33 1,67 1,67 * Re: recombinant (nhóm tái tổ hợp), 2h: theo phân loại mới Franzo Segalés (2018) a: Các heo xác định mắc bệnh tai xanh dịch tả heo thơng qua triệu chứng lâm sàng, bệnh tích xác định có diện vi-rút PRRS CSF mẫu bệnh phẩm phương pháp RT-PCR b: xem Phụ lục 12 Xác định liều lượng gây nhiễm thông qua việc xác định hệ số gây nhiễm (multiplicity of infection - MOI) Kết ghi nhận có gia tăng hiệu giá virút với gia tăng hệ số MOI (Biểu đồ 3.4) Trung bình hiệu giá virút thu hoạch thời điểm 96 (5,32  0,65log10 TCID50/ml) sau nhiễm đạt cao so với thời điểm thu hoạch 72 (5,26  0,66log10 TCID50/ml) 120 (5,14  0,57log10 TCID50/ml), nhiên, khơng có khác biệt thống kê (P > 0,05) Kết so sánh hiệu giá vi-rút thu hệ số MOI cho thấy khơng có khác biệt hiệu giá vi-rút thu hệ số MOI = (5,86  0,29 log10 TCID50/ml) MOI = 0,1 (5,72  0,30log10 TCID50/ml); MOI = 0,1 (5,72  0,30log10 TCID50/ml) MOI = 0,05 (5,46  0,35log10 TCID50/ml); MOI = 0,02 (4,67  0,26log10 TCID50/ml) MOI = 0,01 (4,50  0,17log10 TCID50/ml) Tuy nhiên, có khác biệt có ý nghĩa hiệu giá thu hệ số MOI = 0,05 MOI = 1; MOI = 0,01 0,02 so với MOI = 0,05; 0,1 (P < 0,05) Từ kết nghiên cứu chọn hệ số MOI = 0,1 để tiếp tục khảo sát khả nhân lên phân lập PCV2 môi trường tế bào PK15A 3.2.3 Khả gây bệnh tích tế bào Khi gây nhiễm PCV2 tế bào PK15A với hệ số MOI thấp 0,01 – 0,02 không ghi nhận khác biệt hình dạng tế bào bị nhiễm vi-rút tế bào đối chứng Tuy nhiên, gây nhiễm vi-rút với hệ số MOI từ 0,05 trở lên nhận thấy có thay đổi hình dạng tế bào bị nhiễm vi-rút: tế bào to hơn, co tròn, đậm màu có nhiều tế bào chết so với tế bào đối chứng không nhiễm Kết nghiên cứu tương tự báo cáo Dvorak ctv (2013) gây nhiễm PCV2 dòng tế bào võng mạc bào thai heo VR1BL (porcine fetal retina cell line) Như trình bày trên, hiệu giá vi-rút thu mức MOI thấp thấp so với mức MOI cao Điều cho thấy có mối liên hệ MOI hiệu giá vi-rút thu nhận biểu hình dạng tế bào nhiễm Có thể ghi nhận bệnh tích tế bào hệ số MOI cao ( 0,1) 3.2.4 Khả nhân lên PCV2 môi trường tế bào PK15A Kết đường cong sinh trưởng chủng NAVET-DongNai2/2009, NAVET-LongAn2/2012 NAVET-vietnam3/2004 tế bào PK15A với hệ số gây nhiễm MOI = 0,1 (Biểu đồ 3.5) Trung bình hiệu giá vi-rút qua thời điểm thu hoạch khác chủng NAVET-vietnam3/2004 cao (5,20  0,31log10 TCID50/ml), chủng NAVET-LongAn2/2012 (4,75  0,60log10 TCID50/ml) thấp chủng NAVET-DongNai2/2009 (4,30  0,62log10 TCID50/ml) (P < 0,01) Ngồi ra, có khác biệt trung bình hiệu giá vi-rút thời điểm thu hoạch khác (P < 0,01) Phân tích đường cong sinh trưởng cho thấy, thời điểm thu hoạch để đạt hiệu giá vi-rút cao khác tùy theo chủng PCV2, cụ thể, đối với chủng NAVET-vietnam3/2004 72 giờ, chủng NAVET-DongNai2/2009 84 chủng NAVET-LongAn2/2012 108 13 sau nhiễm Từ kết nghiên cứu giúp chọn lựa thời gian thu hoạch thích hợp cho chủng để đạt hiệu giá vi-rút tối ưu chế tạo vắc-xin Hiệu giá (log10 TCID50/ml) 6.0 5.0 4.0 3.0 NAVET-DongNai2/2009 NAVET-LongAn2/2012 NAVET-vietnam3/2004 2.0 1.0 0.0 36 48 60 72 84 96 108 120 Giờ sau nhiễm Biểu đồ 3.5 Đường cong sinh trưởng chủng NAVET-DongNai2/2009, NAVET-LongAn2/2012 NAVET-vietnam3/2004 tế bào PK15A 3.2.5 Tính ổn định Trung bình chung qua 15 lần tiếp đời hiệu giá vi-rút chủng NAVETLongAn2/2012 cao (5,59  0,43log10 TCID50/ml) chủng NAVET-vietnam3/2004 (5,21  0,52log10 TCID50/ml) thấp chủng NAVET-DongNai2/2009 (5,15  0,38log10 TCID50/ml), khơng có khác biệt trung bình hiệu giá chủng qua 15 lần tiếp đời (P > 0,05) Điều cho thấy chủng phát triển ổn định tế bào PK15A với hiệu giá  5,0log10 TCID50/ml 3.3 Sự tương đồng kháng nguyên phân lập PCV2 thuộc genotype khác Tương đồng kháng nguyên chủng PCV2 thuộc genotype khác đánh giá thông qua giá trị R (%) tính theo cơng thức Archetti Horsfall (1950) Kết cho thấy chủng NAVETDongNai2/2009 (PCV2b) NAVET-vietnam3/2004 (PCV2-Re (2h)) tương đồng hoàn toàn kháng nguyên với hệ số R 104,20% Hệ số R chủng NAVET-DongNai2/2009 (PCV2b) chủng NAVET-LongAn2/2012 (PCV2d); NAVET-LongAn2/2012 (PCV2d) NAVET-vietnam3/2004 (PCV2-Re (2h)) tương ứng 91,60% 91,30% Theo Giambrone Solano (1988), đánh giá tương đồng kháng nguyên chủng vi-rút dựa vào giá trị R chủng xem tương đồng kháng nguyên (antigen identity) với R > 70% Giá trị R tính cặp chủng PCV2 NAVETDongNai2/2009 (PCV2b), NAVET-LongAn2/2012 (PCV2d) NAVETvietnam3/2004 (PCV2-Re (2h)) > 70% Kết cho thấy, chủng 14 khác genotype tương đồng với kháng nguyên Ngoài ra, số thí nghiệm tiêm vắc-xin cơng cường độc chứng minh khả bảo hộ chéo genotype PCV2 (Opriessnig ctv, 2014b, Jeong ctv, 2015; Huan ctv, 2018) Tuy nhiên, cần nghiên cứu thêm vấn đề 3.4 Thí nghiệm 1: Khả gây bệnh tính sinh miễn dịch chủng NAVET-DongNai2/2009 (PCV2b) Biểu lâm sàng tăng trọng: Trong suốt thí nghiệm heo lơ thí nghiệm lơ đối chứng có thân nhiệt biến động từ 39,0 đến 40,50C Khơng có biểu hơ hấp hay tiêu hóa tất heo Heo lơ thí nghiệm có tình trạng lơng da khơng bóng mượt nhóm heo đối chứng Heo trước đưa vào thí nghiệm đồng trọng lượng từ 19,2 đến 23,8kg, thể trạng từ đến điểm Sau gây nhiễm ngày, heo nhóm khơng tăng trọng, việc cân, lấy máu gây nhiễm làm heo bị stress Tăng trọng bình qn hàng ngày (TTHN) nhóm heo tiêm gây nhiễm qua thời điểm khảo sát thấp so với nhóm đối chứng (Bảng 3.10) Tuy nhiên, khơng có khác biệt thống kê TTHN nhóm heo (P > 0,05) Sự diện ADN-PCV2: Phát ADN-PCV2 huyết mô heo thí nghiệm vào ngày thứ 14 sau gây bệnh Kết kiểm tra diện ADN-PCV2 mẫu thu thập qua thời điểm khác heo sau gây nhiễm, phương pháp PCR cho thấy, khơng có diện ADN-PCV2 huyết mô heo lô đối chứng suốt q trình thí nghiệm Ở lơ thí nghiệm, ghi nhận diện ADN-PCV2 huyết thời điểm 7, 14 21 ngày sau gây nhiễm (day post challenge - dpc) tương ứng 0/6, 5/5 3/4 Trong đó, mơ heo mổ khảo sát bệnh tích thời điểm 7, 14 21 ngày sau gây nhiễm, phát diện ADN-PCV2 tương ứng 0/1, 1/1 0/1 Đáp ứng kháng thể Kết kiểm tra đáp ứng kháng thể chống PCV2 heo thí nghiệm trình bày Bảng 3.13 Bắt đầu có chuyển đổi kháng thể tổng cộng (kiểm tra phương pháp IPMA) từ 4,82 ± 0,55log2 (ở thời điểm dpc) lên 6,04 ± 1,76log2 lúc ngày sau gây nhiễm hiệu giá kháng thể tăng dần đạt cao 21 dpc (10,39  1,50log2) lơ thí nghiệm Ngược lại, lô đối chứng hiệu kháng thể (kháng thể thụ động) giảm dần tiến đến âm tính 21 dpc So với kháng thể IPMA, kháng thể trung hòa có chuyển đổi muộn Bắt đầu có chuyển đổi kháng thể trung hòa (neutralising antibody - NA) (VNT50) từ 3,50 ± 0,55log2 0dpc lên 6,6 ± 1,14log2 lúc 14 dpc tăng lên đến 8,75 ± 0,50log2 21 dpc nhóm heo thí nghiệm Trong đó, heo đối chứng có kháng thể trung hòa giảm dần âm tính lúc 21dpc (Bảng 3.13) Trên heo nhiễm vi-rút cận lâm sàng kháng thể trung hòa chống PCV2 xuất lúc 15 ngày sau gây nhiễm thí nghiệm trở (Meerts ctv, 2006; Fort ctv, 2007) 15 Bảng 3.13 Diễn biến kháng thể chống PCV2 heo thí nghiệm Lô KH heo Chỉ tiêu IPMA 1TN1 VNT50 OD IgG IPMA 4TN1 VNT50 OD IgG IPMA 5TN1 VNT50 TN1 OD IgG (gây IPMA nhiễm) 6TN1 VNT50 OD IgG IPMA 10TN1 VNT50 OD IgG IPMA 12TN1 VNT50 OD IgG IPMA VNT50 𝐱̅ ± SD OD IgG IPMA 2ĐC1 VNT50 OD IgG IPMA ĐC1 (đối 3ĐC1 VNT50 chứng) OD IgG IPMA 11ĐC1 VNT50 OD IgG IPMA VNT50 𝐱̅ ± SD OD IgG KM: không mẫu Trước gây nhiễm (10 tuần tuổi) 4,32 0,25 5,32 0,43 4,32 0,34 5,32 0,35 4,32 0,22 5,32 0,23 4,82 ± 0,55 3,50 ± 0,55 0,30 ± 0,09 10,64 1,17 10,64 10 1,24 9,64 1,25 10,31 ± 0,58 9,33 ± 0,58 1,22 ± 0,04 Sau gây nhiễm (ngày) 14 21 5,32 0,23 5,32 0,17 5,32 0,16 5,32 0,20 9,64 0,87 5,32 0,18 6,04 ± 1,76 3,33 ± 0,52 0,30 ± 0,28 9,64 0,77 8,64 0,70 4,32 0,19 7,54 ± 2,83 7,67 ± 0,58 0,55 ± 0,32 7,64 0,28 5,32 0,18 8,64 0,36 KM KM KM 9,64 0,73 6,64 0,16 7,58 ± 1,69 6,60 ± 1,14 0,34 ± 0,23 8,64 0,68 8,64 0,59 0,25 5,76 ± 4,99 5,00 ± 2,65 0,51 ± 0,23 9,64 1,14 9,64 0,59 KM KM KM KM KM KM 9,64 0,75 12,64 0,62 10,39 ± 1,50 8,75 ± 0,50 0,78 ± 0,26 8,64 0,74 KM KM KM 0 0,25 4,32 ± 6,11 1,00 ± 1,41 0,49 ± 0,34 Kết kiểm tra kháng thể IgG phương pháp ELISA cho thấy có gia tăng OD lúc 14 dpc lơ thí nghiệm, với chiều hướng tăng dần kháng thể trung hòa (Bảng 3.13) Theo Fort ctv (2007), kháng thể IgG xuất vào lúc 14 đến 21 ngày sau gây nhiễm Kết thí nghiệm gây nhiễm PCV2 heo tuần tuổi nhóm tác giả Opriessnig ctv (2006b) cho thấy sau gây nhiễm kháng thể IgG bắt đầu xuất vào thời điểm 14 dpc 16 nhóm heo thí nghiệm, ngược lại, nhóm heo đối chứng (còn kháng thể thụ động) hàm lượng IgG giảm dần đến kết thúc thí nghiệm lúc 28 dpc Bệnh tích Mổ khảo sát bệnh tích heo 6TN1 (ở dpc), 5TN1 (ở 14 dpc), 10TN1 (ở 21 dpc) lơ thí nghiệm heo 3ĐC1 (ở 14 dpc) lô đối chứng Kết ghi nhận, heo gây nhiễm với chủng NAVET-DongNai2/2009 có biểu bệnh tích đại thể hạch bẹn cạn sưng, thủy thủng, xuất huyết; hạch phổi sưng lớn xuất huyết; hạch màng treo ruột sưng; phổi dai có đốm nâu; màng thận khó bóc, thận có nang nước heo mổ khảo sát bệnh tích 14 21 dpc Bệnh tích vi thể: bệnh tích đáng chú ý suy giảm tế bào lym-phô diện tế bào đa nhân khổng lồ nốt bạch huyết viêm phổi kẽ 3.5 Kết vô hoạt PCV2 3.5.1 Vô hoạt PCV2 với nồng độ chất vô hoạt khác Bảng 3.14 Hiệu giá vi-rút (log10 TCID50/ml) giảm theo thời gian vô hoạt 37 C theo nồng độ BEI Nồng độ BEI Giờ sau vô hoạt mM mM mM 6,00 6,00 6,00 4,59 4,17 3,42 4,50 3,84 2,84 4,33 3,59 2,59 3,84 3,42 2,42 3,17 2,59 1,67 2,59 1,67 KPH 2,17 KPH KPH 1,67 KPH KPH KPH KPH KPH 10 KPH KPH KPH 0,67 0,86 1,00 Tốc độ vô hoạt (log10 TCID50/giờ) KPH: khơng phát tế bào dương tính với PCV2 theo phương pháp nhuộm IPX Dịch vi-rút phân lập NAVET-DongNai2/2009 lần tiếp đời thứ dùng để xác định công thức vô hoạt Kết xác định hiệu giá vi-rút giảm theo thời gian vô hoạt cho thấy, nồng độ BEI cao thời gian khơng phát vi-rút độ pha lỗng thấp (10-1) mẫu lấy sau vô hoạt để đánh giá động học (kenetic) ngắn Cụ thể, nồng độ BEI mM hpi (hour post inactivation - sau bất hoạt), nồng độ BEI mM mM tương ứng hpi (Bảng 3.14) Tốc độ vô hoạt tương ứng với nồng độ BEI mM, mM mM 0,67; 0,86 1,00log10 TCID50/giờ Điều cho thấy có tương quan gia tăng nồng độ BEI tốc độ bất hoạt nhận định Aathi ctv (2004) Ismail ctv (2013) 17 Kết kiểm tra khả vơ hoạt vi-rút hồn tồn: Ở nồng độ BEI mM sau 24 vi-rút chưa vơ hoạt hồn tồn, chứng sau lần tiếp đời dịch phân lập từ mẫu vi-rút thu 24 hpi lơ có nồng độ BEI mM dương tính với ADN-PCV2 phát PCR dương tính IPX nhuộm tế bào Ngược lại, nồng độ BEI mM mM vi-rút vơ hoạt hồn tồn 3.5.2 Kết vơ hoạt ba chủng PCV2 phân lập với nồng độ BEI mM Kết xác định, hiệu giá vi-rút giảm theo thời gian vô hoạt, với nồng độ BEI mM, nhiệt độ 370C, thời gian không phát vi-rút nồng độ pha loãng 10-1 hai chủng NAVET-DongNai2/2009, chủng NAVET-vietnam3/2004 hpi hpi đối với chủng NAVET-LongAn2/2012 Tốc độ bất hoạt tương ứng với chủng 0,71; 0,86 1,33log10 TCID50/giờ tương ứng với chủng NAVET-vietnam3/2004, NAVET-DongNai2/2009 NAVETLongAn2/2012 Chủng NAVET-LongAn2/2012 có hiệu giá vi-rút trước vô hoạt cao nhất, thời gian khơng phát vi-rút nồng độ pha lỗng 10-1 lại ngắn nhất, kết tốc độ vô hoạt chủng cao so với chủng lại Điều cho thấy đặc điểm đề kháng PCV2 thay đổi tuỳ theo chủng Kết kiểm tra khả vi-rút bị vơ hoạt hồn tồn cho thấy nồng độ BEI mM, nhiệt độ 370C, sau 24 vơ hoạt hồn tồn chủng phân lập 3.6 Kết đánh giá an tồn hiệu lực vắc-xin PCV2 vơ hoạt nhũ dầu thử nghiệm chủng NAVET-DongNai2/2009 (PCV2b) 3.6.1 Thí nghiệm + An toàn: Biểu lâm sàng: Sau tiêm vắc-xin PCV2 thử nghiệm (2ml/heo, chứa lượng kháng nguyên 4,5log10 TCID50/liều) lần cách 21 ngày, heo lô thí nghiệm đối chứng (tiêm dịch chiết tế bào PK15A) ăn uống bình thường Thân nhiệt heo giao động từ 38,30C đến 40,50C Trong đó, heo 5TN2 sốt nhẹ (40,50C) thời điểm ngày sau vắc-xin lần thứ ngày sau vắc-xin lần hai Tại vị trí tiêm heo lơ tiêm vắc-xin có biểu sưng nhẹ vị trí tiêm lần tiêm vắc-xin thứ Khơng có khác biệt tăng trọng lô tiêm vắc-xin lô đối chứng đến kết thúc thí nghiệm + Đáp ứng miễn dịch Hiệu giá kháng thể IMPA lúc tiêm vắc-xin lần 6,64 log2; sau tiêm vắc-xin lần hiệu giá kháng thể heo thí nghiệm giảm dần Tuy nhiên, có chuyển đổi huyết sau tiêm vắc-xin lần thứ hai, lúc ngày sau hiệu giá kháng thể IPMA tăng dần đến 28 ngày hiệu giá kháng thể IPMA đạt cao 11,31  0,58log2 Điều cho thấy có đáp ứng miễn dịch nhớ heo tiêm vắc-xin vắc-xin PCV2 vơ hoạt nhũ dầu có khả gây đáp ứng miễn dịch heo Trong đó, heo đối chứng hiệu giá IPMA giảm dần từ lúc đầu thí nghiệm 9,64log2 đến kết thúc thí nghiệm 5,64log2 (Bảng 3.17) 18 Bảng 3.17 Diễn biến kháng thể chống PCV2 heo thí nghiệm KH heo Lô Chỉ tiêu Sau tiêm vắc-xin lần (ngày) Trước tiêm Sau tiêm vắc-xin lần (ngày) 14 21 14 21 28 5,64 0,39 6,64 0,35 6,64 0,34 4,64 0,49 4,64 0,30 5,64 0,49 0 0,59 4,64 0,34 5,64 0,73 7,64 0,63 8,64 0,96 8,64 0,74 8,64 1,20 9,64 0,80 9,64 1,03 9,64 1,13 10,64 0,77 10,64 1,27 10,64 1,11 11,64 0,88 11,64 1,45 4,98 ± 0,58 0,43 ± 0,11 3,43 ± 3,01 0,55 ± 0,20 8,31 ± 0,58 4,00 ± 3,61 0,78 ± 0,17 9,31 ± 0,58 4,67 ± 4,04 1,01 ± 0,20 8,64 0,68 8,64 0,59 7,64 0,66 8,64 0,49 6,64 0,60 6,64 0,43 6,64 0,58 6,64 0.37 6,64 0,44 6,64 0,31 5,64 0,47 5,64 0,40 8,64 ± 8,00 ± 0,63 ± 0,07 8,14 ± 0,71 7,50 ± 0,71 0,58 ± 0,12 6,64 ± 6,50 ± 0,71 0,51 ± 0,12 6,64 ± 3,00 ± 4,24 0,48 ± 0,15 6,64 ± 0 0,37 ± 0,10 5,64 ± 0 0,44 ± 0,05 (7 tuần tuổi) 5TN2 TN2 (tiêm vắc-xin) 9TN2 11TN2 𝐱̅ ± SD 14ĐC2 ĐC2 (đối chứng) 15ĐC2 𝐱̅ ± SD IPMA VNT50 OD IgG IPMA VNT50 OD IgG IPMA VNT50 OD IgG IPMA VNT50 OD IgG IPMA VNT50 OD IgG IPMA VNT50 OD IgG IPMA VNT50 OD IgG 6,64 0,44 6,64 0,23 6,64 0,33 6,64 ± 6,31 ± 0,58 0 0,33 ± 0,10 0,36 ± 0,03 9,64 0,91 9,64 0,76 8,64 0,87 8,64 0.62 9,64 ± 8,64 ± 9,00 ± 8,50 ± 0,71 0,83 ± 0,11 0,74 ± 0,17 10,31 ± 0,58 11,31 ± 0,58 6,33 ± 1,15 6,33 ±0,58 1,06 ± 0,26 1,15 ± 0,29 19 Tương tự kháng thể tổng cộng, khơng có chuyển đổi kháng thể trung hòa heo sau tiêm vắc-xin lần Sau tiêm vắc-xin lần hai ngày có chuyển đổi kháng thể trung hòa lơ tiêm vắc-xin đạt 6,33  1,15log2 21dpv (Bảng 3.17).Kết kiểm tra kháng thể IgG chống PCV2 cho thấy lô tiêm vắc-xin bắt đầu có gia tăng trung bình mật độ quang (OD) 14 ngày sau tiêm vắc-xin (day post vaccination - dpv) lần từ 0,33  0,10 (0 dpv) lên 0,43  0,11 (14 dpv), tiếp tục tăng cao đến kết thúc thí nghiệm (Bảng 3.18) Giải thích kết đáp ứng kháng thể thí nghiệm trình bày chung thảo luận thí nghiệm 3.6.2 Thí nghiệm + An toàn: Từ – 28 ngày sau tiêm vắc-xin, tất heo lơ thí nghiệm (tiêm vắc-xin PCV2 thử nghiệm, với liều ml/heo, chứa lượng kháng nguyên 6log10 TCID50/liều), heo lô đối chứng (tiêm dịch chiết tế bào PK15A) khỏe mạnh, ăn uống bình thường, khơng có gia tăng thân nhiệt (vượt q 400C) Khơng có phản ứng cục hay phản ứng tồn thân xảy sau tiêm lơ + Hiệu lực lâm sàng Tăng trọng bình quân hàng ngày (TTHN): Từ – 28 dpv nhóm heo đối chứng có TTHN trung bình 452,68  76,67 g cao so với nhóm heo tiêm vắc-xin 445,83  49,87 g Ngược lại, từ – 28 dpc, nhóm heo tiêm vắc-xin PCV2 có TTHN (714,29  162,88 g) cao vượt trội so nhóm đối chứng TTHN có 562,50  283,29 g Tuy nhiên qua xử lý thống kê cho thấy, khơng có khác biệt TTHN nhóm heo thí nghiệm nhóm heo đối chứng 28 ngày sau tiêm vắc-xin 28 ngày sau công cường độc + Hiệu lực cận lâm sàng Đáp ứng miễn dịch Từ – 28 dpv: Ở nhóm heo tiêm vắc-xin, chuyển đổi kháng thể IgG lô heo tiêm vắc-xin xảy sớm dpv Tiếp đó, có chuyển đổi kháng thể tổng cộng từ 6,48  0,41log2 dpv lên 8,98  0,82log2 lúc 14 dpv lên đến 10,31  0,52log2 28 dpv Trong đó, đến 21 dpv mới xuất chuyển đổi kháng thể trung hòa từ 3,83  2,75log2 lên 5,50  0,55log2 (Bảng 3.20) Sau công cường độc, lô heo tiêm vắc-xin, kháng thể IPMA IgG chống PCV2 tăng mạnh dpc Kháng thể IPMA tiếp tục tăng trì mức cao từ 12,81  0,98log2 đến 15,48  0,41log2 đến kết thúc thí nghiệm lúc 28 dpc Tương tự, có gia tăng đáng kể kháng thể NA với HGKT trung bình lên đến 10,50  1,22log2 28 dpc Điều heo tiếp xúc với kháng nguyên PCV2 lần nên đáp ứng miễn dịch diễn nhanh mạnh Ở lô đối chứng, bắt đầu có chuyển đổi kháng thể tổng 20 Bảng 3.20 Diễn biến kháng thể chống PCV2 heo thí nghiệm Lơ KH heo 1TN3 2TN3 TN3 (tiêm vắcxin) 3TN3 4TN3 5TN3 7TN3 Chỉ tiêu Trước tiêm vắcxin (4 tuần tuổi) Sau tiêm vắc-xin (ngày) Sau công cường độc (ngày) 14 21 28 14 21 28 IPMA 6,64 6,64 8,64 9,64 10,64 11,64 13,64 14,64 15,64 VNT50 OD IgG IPMA VNT50 OD IgG IPMA VNT50 OD IgG IPMA VNT50 OD IgG IPMA VNT50 OD IgG IPMA VNT50 OD IgG 0,42 6,64 0,38 6,64 0,37 6,64 0,37 5,64 0,23 6,64 0,36 0,34 6,64 0,85 6,64 0,79 6,64 0,41 5,64 0,27 6,64 1,09 0,75 964 1,73 9,64 1,51 8,64 0,97 9,64 0,50 7,64 1,61 1,07 10,64 1,92 9,64 1,30 9,64 0,87 8,64 0,59 7,64 1,48 0,98 10,64 1,72 10,64 1,38 9,64 0,67 9,64 0,70 10,64 1,39 2,03 12,64 10 2,30 13,64 1,93 11,64 1,19 13,64 2,08 13,64 2,44 2,07 13,64 2,21 13,64 10 1,80 15,64 1,50 15,64 11 2,11 15,64 2,23 11 2,02 12,64 10 1,92 15,64 11 1,98 15,64 1,24 15,64 10 2,02 15,64 2,22 11 2,06 14,64 1,94 15,64 11 1,87 15,64 1,28 15,64 12 2,03 15,64 11 2,16 21 KH heo Lô TN3 𝐱̅ ± SD 6ĐC3 ĐC3 (đối chứng) 8ĐC3 9ĐC3 10ĐC ĐC3 𝐱̅ ± SD Chỉ tiêu Trước tiêm vắcxin (4 tuần tuổi) IPMA 6,48 ±0,41a 6,48±0,41a 8,98±0,82a 9,31±1,03a 10,31 ± 0,52a VNT50 3,83±0,41a 3,83±0,41a 4,00±0,63a 5,50±0,55a 7,00±0,89a 8,67±1,03a 9,50±0,84a 9,83±1,17a 10,50±1,22a OD IgG 0,35±0,07a 0,62±0,33a 1,18±0,51a 1,21±0,47a 1,14±0,43a 2,00±0,44a 1,99±0,28a 1,90±0,34a 1,89±0,32a IPMA VNT50 OD IgG IPMA VNT50 OD IgG IPMA VNT50 OD IgG IPMA VNT50 OD IgG 6,64 0,40 6,64 0,41 6,64 0,22 6,64 0,22 6,64 0,27 6,64 0,30 5,64 0,20 6,64 0,19 4,64 0,14 4,64 0,22 5,64 0,15 5,64 0,14 4,64 0,14 4,64 0,23 5,64 0,20 5,64 0,17 9,64 0,80 9,64 0,91 6,64 0,60 7,64 0,35 10,64 1,01 10,64 1,22 7,64 0,67 8,64 0,54 11,64 1,42 12,64 1,66 8,64 0,98 10,64 11 1,05 IPMA 6,64±0a 6,39±0,50a 5,89±0,50b 5,39±0,96b 5,14±0,58b 5,14±0,58b 8,39±1,50b 9,39±1,50b 10,89±1,71b VNT50 2,75±1,89a 2,25±1,50a 1,00±1,15b 0b 0b 4,25±2,87b 5,75±2,87b 7,75±3,40a OD IgG 0,31±0,11a 0,24±0,05a 0,20±0,05b 0,20±0,05b 0,16±0,04b 0,18±0,04b 0,66±0,25b 0,86±0,31b 1,27±0,32b a, b: khác biệt thống kê với P < 0,05 Sau tiêm vắc-xin (ngày) 14 5,64 0,18 5,64 0,28 5,64 0,17 6,64 0,17 21 4,64 0,17 4,64 0,28 5,64 0,16 6,64 0,17 0b Sau công cường độc (ngày) 28 14 21 28 12,81±0,98a 14,64± 1,10a 14,98±1,21a 15,48±0,41a 22 cộng, kháng thể trung hòa IgG chống PCV2 xảy vào thời điểm 14 dpc, sau HGKT tiếp tục tăng khơng tăng nhanh mạnh lô tiêm vắc-xin (Bảng 3.20) Kết xử lý thống kê so sánh HGKT tổng cộng IPMA OD (ELISA phát IgG) cho thấy, khơng có khác biệt HGKT IPMA OD lơ thí nghiệm lơ đối chứng thời điểm dpv (P > 0,05) Tuy nhiên, có khác biệt có ý nghĩa HGKT IPMA OD phát IgG lô từ thời điểm 14 dpv đến kết thúc thí nghiệm lúc 28 dpc (P < 0,01) Ngồi ra, khơng có khác biệt trung bình hiệu giá kháng thể NA lô tiêm vắcxin lô đối chứng thời điểm dpv, dpv 28 dpc (P > 0,05) Các thời điểm lại có khác biệt có ý nghĩa trung bình hiệu giá kháng thể NA lô (P < 0,05) So sánh với thí nghiệm thí nghiệm heo tiêm vắc-xin lần; vào 28 ngày tuổi có chuyển đổi kháng thể IgG, tổng cộng kháng thể trung hòa vào ngày 7, 14 21 dpv Trong đó, thí nghiệm 1, phải đến ngày sau tiêm vắc-xin lần mới xuất chuyển đổi kháng thể tổng cộng kháng thể trung hòa Điều lượng vi-rút kháng nguyên vắc-xin thử nghiệm thí nghiệm có 4,5log10 TCID50/liều, thí nghiệm 2, vắc-xin thử nghiệm chuẩn bị với hàm lượng vi-rút kháng nguyên lên đến 6,0log10 TCID50/liều Điều cho thấy lượng kháng nguyên có liều vắc-xin ảnh hưởng đến đáp ứng miễn dịch sau tiêm phòng vắc-xin PCV2 Sự diện ADN-PCV2 Ở thời điểm trước tiêm vắc-xin trước công cường độc tất heo lô tiêm vắc-xin lơ đối chứng âm tính với ADN-PCV2 huyết thanh, mẫu ngoáy mũi mẫu ngoáy trực tràng Sau cơng cường độc, nhóm heo tiêm vắc-xin tình trạng vi-rút huyết qua thời điểm khảo sát sau: dpc với tỉ lệ 66,67% (4/6 heo), đến 14 dpc không phát diện ADN-PCV2 huyết (0/6 heo), 21 dpc 16,67% (1/6 heo) 28 dpc 33,33% (2/6 heo) (Bảng 3.22) Tỉ lệ dương tính ADN-PCV2 mẫu ngốy mũi lô heo tiêm vắcxin cao lúc dpc với 4/6 heo chiếm tỉ lệ 66,67%, sau tỉ lệ giảm dần 16,67% (1/6 heo) lúc 28 dpc So với mẫu ngốy mũi mẫu ngốy trực tràng có tỉ lệ dương tính ADN-PCV2 thấp với tỉ lệ cao 50% lúc 14 dpc đến 28 dpc khơng phát ADN-PCV2 mẫu ngốy trực tràng Trong nhóm heo đối chứng, 100% (4/4 heo) dương tính với ADN-PCV2 mẫu ngốy mũi mẫu ngoáy trực tràng vào thời điểm 7, 14 21 dpc, đến 28 dpc tỉ lệ giảm xuống 50% (2/4 heo) Điều cho thấy vắc-xin thử nghiệm có khả làm giảm tỉ lệ heo thải vi-rút qua mũi qua phân sau công cường độc heo tiêm vắc-xin 23 so với nhóm heo đối chứng khơng tiêm vắc-xin Kết phù hợp với nhận định số tác Fort ctv (2009b), Seo ctv (2014b) Bảng 3.22 Phát ADN-PCV2 huyết thanh, mẫu ngoáy mũi mẫu ngoáy trực tràng heo sau cơng cường độc thí nghiệm KH heo Lô TN3 (tiêm vắc-xin) ĐC3 (đối chứng) 1TN3 2TN3 3TN3 4TN3 5TN3 7TN3 Tổng (+) 6ĐC3 8ĐC3 9ĐC3 10ĐC3 Tổng (+) Sau công cường độc (ngày) 14 21 H M P H M P H M - - - - - - - + + - - - + - + + - - + + - + + + + - + + - + + + + - + - - - - - - - - + + H M - - - - - - - P H - + + - - + - + 28 M + - P - P - 0 4 3 2 - - - + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + - 0 4 4 4 4 2 H: huyết thanh, M: ngốy mũi, P: ngốy trực tràng Bệnh tích: Kết khảo sát bệnh tích đại thể cho thấy, heo 4TN3 7TN3 nhóm tiêm vắc-xin khơng có biểu bệnh tích Trong đó, heo 9ĐC3 nhóm đối chứng có biểu bệnh tích hạch bẹn sưng, nhạt màu, thủy thủng, hạch phổi sưng lớn xuất huyết, hạch màng treo ruột sưng, viêm phổi kẽ, phổi dai khơng xẹp; heo 6ĐC3 có hạch bẹn sưng phổi có đốm nâu Kết khảo sát bệnh tích vi thể cho thấy, hai heo 4TN3 7TN3 tiêm vắc-xin sau cơng độc khơng có biểu bệnh tích mơ bạch huyết hạch bẹn cạn, hạch ruột, hạch phổi, lách phổi Trong đó, heo đối chứng 6ĐC3 9ĐC3 có biểu bệnh tích nốt bạch huyết có suy giảm bạch cầu thay mơ bào mức trung bình (heo 6ĐC3), đến nặng (heo 9ĐC3), hạch bẹn cạn, hạch phổi, hạch ruột, a-mi-đan, lách, với diện tế bào đa nhân khổng lồ nang bạch huyết, viêm phổi kẽ Đây xem bệnh tích vi thể điển hình heo mắc PMWS (Opriessnig ctv, 2007; Segalés, 2012) Kết hợp kết thu thể trạng, tăng trọng, diện vi-rút kết hợp với bệnh tích đặc trưng 28 dpc cho thấy heo lô đối chứng mắc PMWS theo tiêu chí đánh giá Sorden (2000) Như tỉ lệ heo mắc PMWS sau công độc lô vắc-xin 0/6 lô đối chứng 1/4 24 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Xác định genotype phân tích tương đồng di truyền PCV2 PCV2 lưu hành 13 tỉnh thành Việt Nam bao gồm genotype PCV2b, PCV2d PCV2-Re (2h), phổ biến PCV2b (24/48) PCV2d (16/48), đặc biệt lưu hành vượt trội PCV2d-2 (15/16) Có lưu hành đồng thời nhiều genotype PCV2 địa phương Các chủng PCV2 xếp genotype có mức độ tương đồng nucleotide ORF2 cao từ 98,7% - 100% đối với PCV2b, từ 98,5 - 100% đối với PCV2d-2 từ 98,7% đến 100% đối với PCV2-Re (2h) Khoảng cách di truyền genotype cao, biến động từ 0,0595 ± 0,0096 đến 0,0663 ± 0,0102 Phân lập khảo sát đặc tính sinh học số chủng PCV2 Phân lập 18 chủng PCV2 từ 21 mẫu bệnh phẩm dương tính PCV2 thu nhận từ heo có biểu triệu chứng bệnh tích bệnh circovirus (PCVD) Hiệu giá vi-rút phân lập đạt dao động từ 1,67 đến 5,50log10 TCID50/ml lần tiếp đời thứ Phân lập PCV2 từ mẫu hạch đạt tỉ lệ dương tính cao so với loại mẫu bệnh phẩm khác PCV2 thuộc genotype khác chủng NAVET-DongNai2/2009 (PCV2b), NAVET-LongAn2/2012 (PCV2d) NAVET-vietnam3/2004 (PCV2-Re (2h)) có tương đồng kháng nguyên cao (R >70%) Nghiên cứu thử nghiệm vắc-xin PCV2 Binary ethylenimine (BEI) với nồng độ mM, nhiệt độ 370C vơ hoạt hồn tồn PCV2 sau 24 giờ, với tốc độ vô hoạt khác tùy chủng Có chuyển đổi kháng chống PCV2 heo thời điểm 14 - 21 ngày sau tiêm vắc-xin vắc-xin vô hoạt nhũ dầu thử nghiệm từ chủng phân lập NAVET-DongNai2/2009 (PCV2b) Vắc-xin PCV2 thử nghiệm đạt u cầu an tồn, có khả kích thích đáp ứng miễn dịch bảo hộ heo mặt lâm sàng chống lại PCV2b, làm giảm nhân lên thải PCV2 heo tiêm vắc-xin công cường độc Đề nghị Tiếp tục nghiên cứu đánh giá hiệu lực vắc-xin vô hoạt nhũ dầu từ chủng NAVET-DongNai2/2009 (PCV2b) thực địa Nếu có điều kiện nên nghiên cứu khả gây đáp ứng miễn dịch trung gian tế bào heo vắc-xin vô hoạt nhũ dầu từ chủng NAVETDongNai2/2009 (PCV2b) Tiếp tục nghiên cứu chế tạo vắc-xin PCV2 đa giá chứa lúc nhiều chủng PCV2 nhiều genotype khác  ... Loại heo Sau cai sữa Sau cai sữa Sau cai sữa Sau cai sữa Sau cai sữa Sau cai sữa 16 tuần Sau cai sữa Nái Nái Thai Sau cai sữa Thai 12 tuần Sau cai sữa Sau cai sữa Cai sữa Sau cai sữa Sau cai sữa. .. VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân tích di truyền phân lập PCV2 số tỉnh thành Việt Nam 3.1.1 Phân tích phát sinh chủng loại dựa ORF2 PCV2 Kết phân tích phát sinh chủng loại dựa ORF2 48 mẫu PCV2 thu thập từ. .. truyền PCV2 số tỉnh thành miền Nam Việt Nam (2) Khảo sát đặc tính sinh học chủng PCV2 phân lập (3) Nghiên cứu chế tạo vắc- xin PCV2 vơ hoạt nhũ dầu (4) Khảo sát tính an tồn hiệu lực vắc- xin PCV2