NGHIÊN cứu BIẾN đổi GEN CYP1A1 và mức độ STRESS OXY hóa ở NAM GIỚI vô SINH

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI BỘ Y TẾ BÙI THỊ NGA NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỔI GEN CYP1A1 VÀ MỨC ĐỘ STRESS OXY HÓA Ở NAM GIỚI VÔ SINH LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC HÀ NỘI - 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI BỘ Y TẾ BÙI THỊ NGA NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỔI GEN CYP1A1 VÀ MỨC ĐỘ STRESS OXY HĨA Ở NAM GIỚI VƠ SINH Chuyên ngành : Y Sinh học- Di truyền Mã số : 62720301 LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS LƯƠNG THỊ LAN ANH PGS.TS TRẦN ĐỨC PHẤN HÀ NỘI - 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận văn: “Nghiên cứu biến đổi gen CYP1A1 mức độ stress oxy hóa nam giới vô sinh” hướng dẫn PGS.TS Lương Thị Lan Anh PGS.TS Trần Đức Phấn hoàn toàn thực Các số liệu kết luận văn trung thực chưa công bố trước Hà Nội, ngày 10 tháng năm 2018 Bùi Thị Nga LỜI CẢM ƠN Trong suốt trình học tập, nghiên cứu hồn thành luận văn, nhận hướng dẫn quý báu, giúp đỡ nhiệt tình thầy cơ, anh chị, bạn bè gia đình Với lòng kính trọng biết ơn sâu sắc, xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới: Ban Giám hiệu trường Đại học Y Hà Nội, phòng Quản lí đào tạo Sau đại học, Bộ môn Y Sinh học - Di truyền trường Đại học Y Hà Nội thầy cô anh chị Bộ môn tạo điều kiện, giúp đỡ tơi tận tình học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn Đặc biệt, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Lương Thị Lan Anh - người hết lòng giúp đỡ, dạy bảo, dìu dắt, hướng dẫn tơi suốt trình làm luận văn trình nghiên cứu, học tập, truyền cho niềm say mê nghiên cứu khoa học Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn tới PGS.TS Trần Đức Phấn - Thầy đồng hướng dẫn, giúp đỡ tơi nhiệt tình q trình nghiên cứu Các Thầy hội đồng khoa học thông qua đề cương bảo vệ luận văn đóng góp nhiều ý kiến quý báu cho tơi q trình nghiên cứu hồn thành luận văn Xin cảm ơn bệnh nhân đồng ý tham gia vào nghiên cứu Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn tới gia đình ln động viên tơi, bạn bè giúp đỡ, chia sẻ khó khăn với tơi suốt q trình hồn thành luận văn Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng năm 2018 Bùi Thị Nga DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT AR : Androgen Receptor AZF : Azoospermia Factor CFTR : Cystic Fibrosis Transmembrance Conductance Regulator FSH : Follice Stimulating Hormone GnRH : Gonadotropin Releasing Hormone GTMTT : Giãn tĩnh mạch thừng tinh ITT : Ít tinh trùng KCTT : Khơng có tinh trùng LH : Luteinizing Hormone NST : Nhiễm Sắc Thể OS : Oxidative Stress RCS : Reactive Clo Species ROS : Reactive Oxygen Species WHO : World Health Organization (Tổ chức y tế Thế giới) MỤC LỤC TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI .1 BÙI THỊ NGA LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC HÀ NỘI - 2018 TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI .2 BÙI THỊ NGA Mã số : 62720301 LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC Người hướng dẫn khoa học: .2 PGS.TS LƯƠNG THỊ LAN ANH .2 PGS.TS TRẦN ĐỨC PHẤN HÀ NỘI - 2018 ĐẶT VẤN ĐỀ Chương .4 TỔNG QUAN 1.1 Tình hình nghiên cứu vô sinh vô sinh nam giới 1.1.1 Khái niệm vô sinh vô sinh nam giới 1.1.2 Tình hình vơ sinh vô sinh nam giới 1.1.3 Tình hình vô sinh vô sinh nam Việt Nam 1.2 Các nguyên nhân dẫn đến vô sinh nam 1.2.1 Phân loại nguyên nhân gây vô sinh nam giới Vô sinh nam giới nhiều nguyên nhân khác nhau, hầu hết dẫn đến hậu người nam tinh trùng tinh trùng suy giảm mức độ khác nhau, bất thường hình thái tinh trùng 1.2.1 Nguyên nhân ảnh hưởng đến số lượng tinh trùng 1.2.2 Nguyên nhân ảnh hưởng đến chất lượng tinh trùng tinh dịch 12 1.3 Gốc tự stress oxy hóa 13 1.3.1 Khái niệm phân loại gốc tự 13 1.3.2 Stress oxy hóa ảnh hưởng lên hệ sinh sản nam 15 1.3.3 Vai trò gốc kháng oxy hóa điều trị vơ sinh nam .17 1.3.4 Các phương pháp xác định mức độ stress oxy hóa tinh dịch .19 1.4 Gen chuyển hóa gốc tự CYP1A1 thể 19 1.4 Kỹ thuật sinh học phân tử xác định biến đổi gen 21 1.5.1 Khái niệm PCR 21 1.5.2 Nguyên lý kỹ thuật PCR 22 1.5.3 Một số phương pháp PCR đặc hiệu .23 1.5.4 Kỹ thuật ARMS-PCR 25 Chương 27 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.1 Đối tượng nghiên cứu 27 2.2 Số bệnh nhân số mẫu 27 2.3 Quy trình nghiên cứu .28 2.4 Thiết bị dụng cụ 28 2.5 Phương pháp nghiên cứu 28 2.5.1 Loại hình nghiên cứu 28 2.5.2 Cách tiến hành nghiên cứu .29 2.5.3 Thu thập kết xét nghiệm tinh dịch đồ xác định mức độ stress oxy hóa kit Oxisperm .30 2.5.4 Tách chiết DNA 31 2.5.5 Nhân đoạn gen sử dụng phương pháp ARMS-PCR .31 2.5.6 Điện di .32 2.5.7 Xử lí số liệu 33 2.6 Các tiêu nghiên cứu 34 2.7 Đạo đức nghiên cứu .34 Chương 35 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 35 3.1 Đặc điểm chung đối tượng nghiên cứu 35 3.1.1 Độ tuổi trung bình nhóm bệnh nhóm chứng .35 3.1.2 Đặc điểm nhóm bệnh phân loại theo mật độ tinh trùng 35 Dựa vào mật độ tinh trùng tinh dịch, chúng tơi phân loại nhóm bệnh thành nhóm nhỏ: Vơ tinh thiểu tinh .35 3.1.3 Kết phân tích tinh dịch đồ hai nhóm đối tượng nghiên cứu Tính chất lý hóa tinh dịch 36 3.2 Kết xác định đa hình A2455G gen CYP1A1 nam giới thiểu tinh vô tinh 39 3.2.1 Kết chạy điện di .39 3.2.2 Kết đa hình A2455G gen CYP1A1 .40 CYP1A1 A2455G 42 Nhóm bệnh 42 (n=45) 42 Nhóm chứng 42 (n=45) 42 p 42 OR 42 (95%CI) 42 Số lượng 42 Tỉ lệ 42 (%) 42 Số lượng 42 Tỉ lệ 42 (%) 42 Alen A 42 61 .42 67,8 42 76 .42 84,4 42 0,016 42 0,49 42 (0,14 - 0,96) .42 Alen G 42 29 .42 32,2 42 14 .42 15,6 42 2,96 42 (1,15 - 6,64) .42 Tổng 42 90 .42 100 .42 60 .42 100 .42 - 42 - 42 Nhận xét: 42 Kết bảng 3.5 cho ta thấy: 42 Ở nhóm bệnh, tỉ lệ alen A 67,8%, tỉ lệ alen G 32,2% 42 Ở nhóm chứng, tỉ lệ alen A 84,4%, tỉ lệ alen G 15,6% 42 Alen G nhóm bệnh cao gấp 2,96 lần nhóm chứng với p = 0,016 42 3.3 Mức stress oxy hóa tinh dịch nam giới vô sinh 43 Tiến hành lấy ngẫu nhiên 18 mẫu tinh dịch nhóm bệnh 18 mẫu tinh dịch nhóm chứng sau tiến hành đo mức độ stress oxy hóa tinh dịch Phân loại mức độ stress oxy hóa thành nhóm 44 Ta có bảng: 44 Mức stress .44 oxy hóa 44 Nhóm bệnh 44 Nhóm chứng 44 P 44 Số lượng 44 Tỉ lệ (%) 44 Số lượng 44 Tỉ lệ (%) 44 Thấp .44 44 38,9 44 14 44 77,8 44 < 0,05 .44 Cao 44 11 44 61,1 44 44 22,2 44 Tổng44 18 44 100 44 18 44 100 44 - 44 Nhận xét: .44 Ở nhóm bệnh, mức OS thấp có bệnh nhân (chiếm 38,9%), 11 bệnh nhân có mức OS cao (chiếm 61,1%) .44 Ở nhóm chứng, mức OS thấp có 14 người (chiếm 77,8%), có người có mức OS cao (chiếm 22,2%) 44 61 KIẾN NGHỊ Cần thực thêm nghiên cứu với cỡ mẫu lớn phân tích mối liên quan đa hình A2455G gen CYP1A1 đối tượng người Việt Nam để khẳng định thêm kết luận nghiên cứu Từ sử dụng xét nghiệm xác định đa hình A2455G gen CYP1A1 cơng cụ chẩn đốn ngun nhân vơ sinh Cần thực thêm nghiên cứu tương tác gen - mơi trường liên quan đến tính nhạy cảm cá nhân mang đa hình trên, ví dụ mức độ phơi nhiễm với khói thuốc lá, lạm dụng rượu, số khối thể BMI,…Xác định yếu tố có liên quan mức độ đến vơ sinh nam, từ đưa lời tư vấn di truyền đối tượng nam giới mang đa hình gen Nên sử dụng xét nghiệm xác định mức độ stress oxy hóa tinh dịch marker độc lập chẩn đốn vơ sinh nam, nam giới có kết tinh dịch đồ bình thường TÀI LIỆU THAM KHẢO Jungwirth A et al (2013) Guilines on male infertility European Association of Urology WHO (1999), WHO laboratory manual for the examination of human semen and sperm - cervical mucus, 4th ed Cambridge University Press Cooper T.G., Noonan E., Von Eckardstein S et al (2010) World Health Organization reference values for human semen characteristics Update, 16 (3), 231-245 World Health Organization (2000), WHO manual for the standardilized investigation, diagnosis and management of the infertile male Cambridge University Press Wu G.J., Ma S., Zheng L.W., Xu Y., Meng F.H., Dai X.W (2018) A complex chromosome translocation with male infertility of karyotype analysis and literature review Beijing Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban 50(4), 729-731 World Health Organization (1991) Infertility: a tabulation of available data on prevalence of primary and secondary infertility, Geneva, WHO, Programme on Maternal and Child Health and Family Planning, Division of Family Health, 67-76 Kildea S., Bowden F.J (2000) Reproductive health, infertility and sexual transmitted infections in indigenous women in a remote community in the Northern Teritory Aust N Z J Public Health, 24 Chandra A., Copen E.C., Stephen E.H (2013) Infertility and Impaired Fecundity in the United States, National Survey of Family Growth, 67 Irvine D.S (2002) Male infertility: Causes and management Medical progress 10 Mittal R.D (2004) Y - chromosome microdeletion in idiopathic infertility from Northern India Ann Genet 47, 331-337 11 Ali H (2006) Y chromosome microdeletion in infertile men with idiopathic oligo-azoos, Journal of Experimental & Clinical Assisted reproduction 3, 1043-1050 12 Ceylan G.G., Ceylan C and Elyas H (2009) Genetic anomalies in patients with severe oligozoospermia and azoospermia in eastern Turkey: A prospective study Genetics and Molecular Research 8, 915-922 13 Takahashi K., Uchida A and Kitao M (1990) Hypoosmotic Swelling Test of Sperm Systems Biology in Reproductive Medicine, 25(3), 225-242 14 Colpi G.M., Francavilla S., Haidl G., et al (2018) European Academy of Andrology guideline Management of oligo-astheno-teratozoospermia Andrology 6(4), 513-524 15 Nguyễn Khắc Liêu (2003) Chẩn đốn điều trị vơ sinh Nhà xuất Y học 16 Phan Văn Quyền (2000) Khám làm bệnh án cặp vợ chồng vô sinh, lớp vô sinh hỗ trợ sinh sản khóa 4, 1-20 17 Trần Thị Phương Mai (2001) Tình hình điều trị vơ sinh kỹ thuật cao Báo cáo Hội thảo “Tình hình điều trị vơ sinh thụ tinh ống nghiệm”, Bộ Y tế UNFPA, Đà Nẵng, 11/2001 18 Trần Thị Trung Chiến, Trần Văn Hanh, Phạm Gia Khánh cs (2002) Nghiên cứu số vấn đề vô sinh nam giới lựa chọn kỹ thuật lọc rửa, lưu trữ tinh trùng để điều trị vô sinh, Đề tài cấp Nhà nước 19 Nguyễn Viết Tiến, Ngơ Huy Tồn, Bạch Huy Anh (2009) Nghiên cứu thực trạng vô sinh Việt Nam theo vùng sinh thái, Bệnh viện Phụ sản Trung ương, Đại học Y Hà Nội, Hà Nội 20 World Health Organization (1999) WHO laboratory manual for the examination of human semen and sperm-cervical mucus, 4th edition, Cambridge University Press 21 Tran Duc Phan (2010) Health status and reproductive health surveillance in Viet Nam 9th annual scientific congress of Asia Pacific association of medical toxicologycollaboration against poisoning from regional experience to global vision, 45 22 World Health Organization (2010) Laboratory manual for the examination and processing of human semen, Cambridge University Press, New York 23 Lê Hoàng Anh Hồ Mạnh Tường (2012) Phân tích kết 4.060 tinh dịch đồ theo tiêu chuẩn WHO 2010 cặp vợ chồng khám muộn, Hội nghị khoa học thường niên HOSREM lần VIII, 2012 24 Damke E., Kurscheidt F.A., Irie M.M.T., Gimenes F., Consolaro M.E.L (2018) Male Partners of Infertile Couples With Seminal Positivity for Markers of Bacterial Vaginosis Have Impaired Fertility Am J Mens Health 64, 125-129 25 Yoshiyoki K et al (2001) Molecular analysis of hypospadias in a boy with dicentric Y Chromosome The Journal of urology 385, 1244-1245 26 Nguyễn Bửu Triều, Trần Quán Anh (2002) Vơ sinh nam giới, Bệnh học giới tính nam, Nhà xuất Y học, 240-271 27 Van Rijn S (2018) Salivary testosterone in relation to social cognition and social anxiety in children and adolescents with 47,XXY (Klinefelter syndrome) PLoS One 13(7): e0200882 doi: 10.1371.pone.0200882 28 Phùng Huy Tuân (2005) Bất thường di truyền vô sinh nam, Sức khoẻ sinh sản, 10-15 29 Trần Đức Phấn (2003) Tình hình vơ sinh vùng có nguy nhiễm chất độc hố học chiến tranh, bước đầu phân tích nguyên nhân tình trạng đó, Báo cáo tổng kết đề tài nhánh 30 Poogothai J., Gopenath T.S., Maronnayaki S (2009) Genetics of human male infertility Singaporemed J 50 (4), 336-347 31 Nguyễn Xuân Bái (2002) Nghiên cứu đặc điểm tinh dịch đồ 1000 cặp vợ chồng vô sinh, Luận văn thạc sỹ y học, Trường Đại học Y Hà Nội 32 Erenpresis J., Spano M., Erenpreisa J et al (2006) Sperm chromatin structure and male fertility: biological and clinical aspects Asian J Androl 8, 11-29 33 Trần Thị Thu Hoài (2015) Đánh giá tỉ lệ đứt gãy DNA tinh trùng nam giới vơ sinh, Khóa luận tốt nghiệp bác sĩ y khoa, Trường Đại học Y Hà Nội 34 Barry H (2010) Food-Derived Antioxidants: How to evaluate their importance in food and invivo Handbook of Antioxidant, Chapter 01, 07-27 35 Fabio F.P et al (2008) Semen quality and oxidative stress scores in fertile and infertile patients with varicocele Fertility and Sterility Vol 89 36 Ross C., Morriss A., Khairy M et al (2010) A systematic review of the effect of oral antioxidant on male infertility Reprod Biomed Online 20(6), 711-23 37 Gharagozloo P., Aitken R.J (2011) The role of sperm oxidative stress in male infertility and the significance of oral antioxidant therapy, Hum reprod 26(7), 1628-40 38 Gaikovitch E.A., Cascorbi I., Mrozikiewicz P.M., Brocmoller J et al (2003), Polymorphisms of drug-metabolizing enzyme CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 CYP1A1, NAT2 AND of P-glycoprotein in a Russian population European Journal of Clinical Pharmacolog 59(4), 303-312 39 Ramgir S.S., Sekar N., Jindam D (2017) Association of CYP1A1*2A Polymorphism with Idiopathic Non-Obstructive Azoospermia in A South Indian Cohort Int J Fertil Steril 11(3), 142-147 40 Aydos S.E., Taspinar M., Sunguroglu A., Aydos K (2009), Association of CYPlAl ADN glutathione S-transferase polymorphisms with male factor infertility Fertility and Sterility 92(2), 541-547 41 Newton C R., Graham A., Heptinstall L E et al (1989) Analysis of any point mutation in DNA The amplification refractory mutation system (ARMS) Nucleic Acids Research 17(7), 2503-2516 42 Sergey L Yarosh., Elena V Kokhtenko., Nina I S et al (2013) Smoking Status Modifies the Relation Between CYP1A1*2C Gene Polymorphism and Idiopathic Male Infertility: The Importance of Gene-Environment Interaction Analysis for Genetic Studies of the Disease Reproductive Sciences 20(11), 1302-1307 43 O H Roshdy., T M Hussein., N H Zakaria (2014), Glutathione Stransferrase Mu-1 gene polymorphism in Egyptian patients with idiopathic male infertility First international Journal of Andrology andrologia 44 Wang T., Hu T., Zhen J et al (2017) Association of MTHFR, NFKB1, NFKBIA, DAZL and CYP1A1 gene polymorphisms with risk of idiopathic male infertility in a Han Chinese population Int J Clin Exp Pathol 10(7), 7640-7649 45 Lê Đình Hồng (2016) Đánh giá tác dụng Spermotrend bệnh nhân vô sinh nam tinh trùng yếu từ tháng 11/2014 - 8/2015 Bệnh Viện Phụ sản Trung Ương Tạp chí Y học thực hành số 1005/2016, tr 139 - 146 46 Nguyễn Đức Nhự (2015) Nghiên cứu bất thường nhiễm sắc thể phát đoạn AZFabcd nam giới vô tinh thiểu tinh nặng Luận văn Tiến Sĩ Y học, 2015 47 Erin P Madeen and David E Williams (2016) Environmental PAH exposure and male idiopathic infertility: a review on early life exposures and adult diagnosis Rev Environ Health 48 World Health Organization (1999) WHO laboratory manual for the examination of human semen and sperm-cervical mucus, 4th edition, Cambridge University Press 49 Trần Đức Phấn, Trịnh Văn Bảo, Hoàng Thu Lan (2002) Đặc điểm tinh dịch người nam giới cặp vợ chồng thiểu sinh sản Y học thực hành 407(1), 38-41 50 World Health Organization (2010) Laboratory manual for the Examination and processing of human semen, 5th ed Cambridge University Press 51 Li W., Tan H., Liu J et al (2018) Comparative analysis of testis transcriptomes associated with male infertility in triploid cyprinid fish Reprod Fertil Dev 2018 Aug doi: 10.1071/RD18034 52 Singh K., Jaiswal D (2011) Human male infertility: a complex multifactorial phenotype Reprod Sci 18(5), 418-425 53 Burkina V., Sakalli S., Zlabek V., Zamaratskaia G (2018) CYP1A1 activity in rainbow trout is inhibited by the environmental pollutant p-cresol Environ Toxicol Pharmacol 62, 199-202 54 Luo H., Li H., Yao N., Hu L., He T (2014) Association between T3801C Polymorphism of CYP1A1 and Idiopathic Male Infertility Risk: A Systematic Review and Meta-Analysis PLoS ONE 9(1): e86649 55 Nejati M and Karimian M (2016) The rs4646903 gene transition and idiopathic male infertility: A systematic literature review and metaanalysis Bioscience Biotechnology Research Communications 9(4), 718-724 56 Aydos S.E., Taspinar M., Sunguroglu A., Aydos K (2009) Association of CYP1A1 and glutathione S-transferase polymorphisms with male factor infertility Fertil Steril 92(2), 541-547 57 Jianzheng Fang., Shangqian Wang., et al (2013) The Cytochrom P4501A1 gene polymorphism and idiopathic male infertility risk: A meta-analysis Gene 535, 93-96 58 Ningxia Lu., Bin Wu., Yankai Xia., et al (2007) Polymorphism in CYP1A1 gene are associated with male infertility in a Chinese population International Journal of Andrology 59 Parada Bustamante A., Molina C., et al (2017) Disturbed testicular expression of the estrogen-metabolizing enzymes CYP1A1 and COMT in infertile men with primary spermatogenic failure: possible negative implications on Sertoli cells Andrology 5(3), 486-494 60 Sengupta D., Guha U., Mitra S., Ghosh S., Bhattacharjee S., Sengupta M (2018) Meta-Analysis of Polymorphic Variants Conferring Genetic Risk to Cervical Cancer in Indian Women Supports CYP1A1 as an Important Associated Locus Asian Pac J Cancer Prev 19(8), 2071-2081 61 Akgul S., Derman O., Alikasifoglu M., Aktas D (2011) CYP1A1 polymorphism in adolescents with polycystic ovary syndrome Int J Gynaecol Obstet 112 (1), 8-10 62 Siddarth M., Datta S.K., Ahmed R.S., Banerjee B.D., Kalra O.P et al (2013) Association of CYP1A1 gene polymorphism with chronic kidney disease: a case control study Environ Toxicol Pharmacol 36 (1), 164-170 63 Taspinar M., Aydos S., Sakiragaoglu O., Duzen I.V., Yalcinkaya A et al (2012) Impact of genetic variations of the CYP1A1, GSTT1, and GSTM1 genes on the risk of coronary artery disease DNA Cell Biol 31 (2):211218 doi:10.1089/dna.2011.1252 64 Zhang J., Deng J., Zhang C., Lu Y., Liu L et al (2010) Association of GSTT1, GSTM1 and CYP1A1 polymorphisms with susceptibility to systemic lupus erythematosus in the Chinese population Clin Chim Acta 411 (11-12):878-881 65 Aitken, R J., Clarkson, J S and Fishel S (1989): Generation of reactive oxygen species, lipid peroxidation and human sperm function Biol Reprod 40:183 66 Aitken R J., Buchngham D and Harkiss D (1993): Use of a xanthine oxidase free radical generating system to investigate the cytotoxic effects of reactive oxygen species on human spermatozoa J Reprod Fer., 97:441 67 Ilter Alkan., Ferruh Simsek et al (1997) Reactive oxygen species production by the spermatozoa of patients with idiopathic infertility: Relationship to seminal plasma antioxidants American Urological Association 157, 140-143 68 Vũ Thị Huyền, Trần Đức Phấn, Nguyễn Thị Trang (2018) Mức độ stress oxy hóa đứt gãy tinh trùng nam giới vơ sinh Tạp chí nghiên cứu Y học 69 Ashok Agarwal., Rakesh Sharma et al (2006) Reactive oxygen species as an independent marker of male factor infertility Fertility and Sterility 70 Kumar N., Singh A.K (2018) Reactive Oxygen Species in Seminal Plasma as a Cause of Male Infertility J Gynecol Obstet Hum Reprod 16 pii: S2468-7847(18)30240 71 Subramanian V., Ravichandran A., Thiagarajan N., et al (2018) Seminal reactive oxygen species and total antioxidant capacity: Correlations with sperm parameters and impact on male infertility Clin Exp Reprod Med 45(2), 88-93 72 Aditi Singh., Bidhan Chandra Koner., Prakash Chandra Ray et al (2016) Effect of CYP1A1 gene polymorphism and psychological distress on seminal analysis parameters Reproductive Health PHỤ LỤC MẪU BỆNH ÁN NGHIÊN CỨU TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI BỘ MÔN Y SINH HỌC - DI TRUYỀN BỆNH ÁN ID : Ngày tháng năm 20 Chồng Họ tên:………………………… Tuổi:……… Nghề nghiệp:…………… Địa chỉ:………………………………………………………………………… Năm kết hơn:…………………………… ĐT:……………………………… Tiếp xúc phóng xạ, hóa chất (nếu có ghi rõ loại):…………………………… Bị thương phận sinh dục: ……………………………………………… Bị bệnh:……………………………………………………………………… Thuốc lá: ……………điếu/ngày Bia: ……cốc/lần,……lần/tuần Lần xuất tinh gần nhất:……… Thuốc lào: ……………điếu/ngày Rượu: ………chén/lần,… lần/tuần Số lần giao hợp/tuần:……………… Có mộng, di tinh: ……………… lần/tháng Kết tinh dịch đồ Vợ Họ tên: ……………………………Tuổi: ……… Nghề nghiệp:………… Có kinh năm ……tuổi Chu kì:………ngày PARA: ………… Các bệnh mắc:…………………… Phả hệ Đều/Khơng PHỤ LỤC PHIẾU KẾT QUẢ MỨC ĐỘ STRESS OXY HĨA Số phiếu: I THƠNG TIN MẪU Tên bệnh nhân: Tuổi: Giới: Địa chỉ: Chẩn đoán: Xét nghiệm: Kiểm tra mức độ stress oxy hóa tinh dịch (ROS) Ngày làm xét nghiệm: II KẾT QUẢ Mức độ stress oxy hóa • KẾT LUẬN Hà Nội, ngày tháng năm 20 Bác sĩ trả lời kết PHỤ LỤC QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT DNA BẰNG KT DNA-EXPRESS + Lấy 1ml máu tươi chống đông EDTA + Ly tâm 1.300 vòng/phút, nhiệt độ thường (20 0C) phút + Loại bỏ dịch pipet (200 µl), không hút vào lớp bạch cầu + Ủ nhiệt độ -20 0C 40 phút + Rã đông nhiệt độ thường + Cho thêm thể tích kit tách thể tích máu (1 ml ADN-express = ml máu) + Tiến hành votex thời gian 10 giây + Ủ 99oC 25 phút + Ly tâm 1300 vòng/phút 15 đến 20 phút + Hút dịch sang eppendorf Bảo quản -20 oC PHỤ LỤC QUY TRÌNH THỰC HIỆN KT ARMS-PCR + Cho 17,5 µl buffer + 0,2 µl Taq vào ống, trộn + Nhỏ hỗn hợp vào eppendorf + Thêm vào 2,5 µl mồi (kit) vào eppendorf trộn + Cho µl DNA bệnh phẩm vào eppendorf Thu hỗn hợp + Nhỏ thêm 25 µl dầu, sau cho vào máy ly tâm + Tiến hành PCR PHỤ LỤC KẾT QUẢ KIỂU GEN CỦA ĐỐI TƯỢNG THAM GIA NGHIÊN CỨU STT Nhóm BN 1 Mã BN A1691 A1692 C1611 Họ tên Nguyễn Mạnh T Trần Đăng N Hoàng Anh Q Tuổi 36 30 28 KG AG AG AA 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 2 2 2 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 C1612 C1613 C1614 C1615 C1616 C1617 A17115 A17132 A17135 O17160 O1705 C1701 C1702 C1703 C1704 C1705 C1706 C1707 C1708 C1709 C1710 C1711 C1712 C1713 C1714 C1715 C1716 C1717 C1718 C1719 O1701 Ngơ Văn D Hồng Phúc T Chu Huy L Nguyễn Văn K Đinh Ngọc L Phạm Văn D Nguyễn Mạnh H Cao Thế A Đặng Ngọc H Trần Thanh T Đồn Đình H Ngơ Minh T Nguyễn Minh T Nguyễn Văn T Phạm Văn T Nguyễn Bùi C Lâm Phúc C Bùi Quang H Hoàng Văn H Nguyễn Tiến C Vũ Công B Phùng Quang T Bùi Xuân N Vũ Xuân S Đặng Hồng T Nguyễn Văn T Nguyễn Thanh T Nguyễn Văn D Nguyễn Văn V Đào Duy T Nguyễn Duy T 36 34 28 34 31 38 30 26 28 32 24 34 42 46 27 34 27 33 31 35 32 33 43 39 30 37 33 34 30 28 29 AG AA AA AG AG AG AG AG AA AA AA AA AA AA AG AA AG AA AA AG AA AA AG AA AG AA AA AA AA AG AG 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 1 11 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 1 1 O1702 O1703 O1704 O1705 O1706 O1707 O1708 O1709 O1710 O1711 O1712 O1713 O1714 O1715 O1716 O1717 O1718 O1719 O1720 O1721 O1722 O1723 C1720 C1721 C1722 C1723 C1724 X1809 X1810 X1811 X1812 Nguyễn Minh H Lê Văn T Nguyễn Tiến C Nguyễn Phúc T Nguyễn Văn T Nguyễn Huy H Phan Đình T Hà Thu T Đàm Đình H Nguyễn Quang H Lò Anh M Từ Tuấn V Trần Hữu H Nguyễn Xuân C Dương Minh L Nguyễn Bá T Nguyễn Văn C Hoàng Thu C Nguyễn Hải H Nguyễn Hữu H Nguyễn Duy H Nguyễn Ngọc Đ Lê Trung D Ngô Mạnh T Nguyễn Văn M Chu Huy N Kiều Văn S Dương Văn N Nguyễn Tuấn Đ Hoàng Khương D Vũ Khánh T 32 32 44 32 30 23 29 32 25 33 24 29 28 21 30 30 31 30 41 28 42 40 34 34 36 32 26 34 30 34 30 AG AA AA AG AG AG AA AG AG GG AG AG AA AG AG AA AA AG AG AA AG AA AA AA AG AA AG AA AG AG AG 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 X1813 X1814 X1815 X1816 X1817 X1818 X1819 X1820 X1821 X1822 X1823 C1739 C1740 C1741 C1742 C1743 C1744 C1745 C1746 C1747 C1748 C1749 C1750 C1751 C1752 Nguyễn Văn H Nguyễn Việt C Vũ Văn Đ Nguyễn Văn Tuấn A Bùi Văn T Vương Duy C Đỗ Hải L Đào Huy D Trần Đình Đ Ngơ Đình C Bùi Huy B Đỗ Văn P Nguyễn Tuấn Đ Bùi Văn M Đào Công H Nguyễn Văn H Nguyễn Trọng T Vũ Văn T Trần Hồng M Đỗ Việt H Mai Thanh T Thân Đức C Hồ Đình T Trần Ngọc H Hà Văn T Hà Nội, ngày Xác nhận GVHD 30 34 26 22 35 25 31 30 27 32 44 30 33 28 34 23 33 31 27 41 32 36 31 29 24 tháng AA GG AG AG AA AG AG AG AA AG AG AA AG AA AG AG AA AA AG AA AA AA AA AG AA năm 2018 Xác nhận lãnh đạo Trung tâm ... nam giới, tiến hành đề tài Nghiên cứu biến đổi gen CYP1A1 mức độ stress oxy hóa nam giới vô sinh với mục tiêu: Xác định biến đổi A2455G gen CYP1A1 nam giới thiểu tinh vô tinh Xác định mức độ stress. .. hình nghiên cứu vơ sinh vơ sinh nam giới 1.1.1 Khái niệm vô sinh vô sinh nam giới 1.1.2 Tình hình vơ sinh vơ sinh nam giới 1.1.3 Tình hình vơ sinh vơ sinh nam Việt Nam. .. stress oxy hóa tinh dịch nam giới vơ sinh 3 Chương TỔNG QUAN 1.1 Tình hình nghiên cứu vơ sinh vơ sinh nam giới 1.1.1 Khái niệm vô sinh vô sinh nam giới Theo tổ chức y tế giới (WHO), vô sinh tình