nhóm 14 phương pháp gián tiếp

Đại học Nông lâm TP.HCM BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ MÔN: CÔNG NGHỆ SINH HỌC BÁO CÁO CHUYÊN NGÀNH TẾ BÀO HỌC ĐỘNG VẬT GV: Trần Thị Bích Liên Chủ đề: Nhận biết phát triển tế bào phương pháp gián tiếp Thành viên nhóm 1.Lê Nhật Tân 11126321 2.Lê Văn Vũ Linh 11126154 3.Nguyễn Lê Thụ Minh 11126164 4.Trần Thị Anh Thương 11126037 5.Đoàn Thị Mỹ Linh 11126016 6.Nguyễn Thị Kim Loan 11126155 Tháng 12,2012 Mục lục Đặt vấn đề Chương I Mở đầu I.1 Sự sinh trưởng tế bào I.2 Con đường sinh trưởng phát triển tế bào .5 Chương II Nội dung II.1 Định nghĩa phương pháp gián tiếp II.2 Các phương pháp vật lý II.3 phương pháp hóa học .18 II.4 Những nhân tố ảnh hưởng trình phát triển tế bào 21 Chương III Kết luận 23 Tài liệu tham khảo 24 Đặt vấn đề Xác định xác tăng trưởng tế bào điều quan trọng để theo dõi trình sinh lý động vật Trực tiếp phương pháp để xác định tế bào bao gồm đếm vi, điện tử đếm hạt, giám sát sinh khối, phân tích hình ảnh Những phương pháp làm việc đơn giản mẫu khối lượng cố định lấy từ bình ni cấy Đếm hiển vi thời gian dành lợi cho phép khả sống xác định loại thuốc nhuộm phù hợp Đếm hạt điện tử phương pháp nhanh chóng cho tái tạo mẫu, số biến dạng liệu xảy mẫu có tế bào lớn, mảnh vỡ tế bào cốt lõi Việc sử dụng đầu dò sinh khối phát tế bào tính chất điện mơi sử dụng hình liên tục tiến văn hóa Phân tích dựa hình ảnh việc sử dụng hình ảnh máy ảnh kỹ thuật số thơng qua kính hiển vi nâng cao nhanh chóng với sẵn có số gói phần mềm thương mại có sẵn Phương pháp gián tiếp xác định tế bào liên quan đến việc phân tích hóa học quy trình ni cấy, thành phần số hoạt động trao đổi chất Những phương pháp hữu ích khó khăn để có mẫu tế bào nguyên vẹn Tuy nhiên, mối quan hệ thông số số lượng tế bào khơng tính thơng qua giai đoạn q trình nuôi cấy tế bào Việc xác định axit nucleic (DNA) tổng số protein sử dụng ước tính sinh khối, suy giảm glucose sử dụng ước tính hoạt động tế bào Các trạng thái tồn tế bào đo việc phát hành loại enzyme lactate dehydrogenase (LDH) trực tiếp từ phí lượng tế bào adenylate từ tế bào lysates Ngồi ra, kỹ thuật phóng xạ sử dụng xác xác định tổng hợp protein tế bào Sự phát triển tế bào động vật có vú ni cấy giám sát số thông số liên quan đến gia tăng sinh khối tế bào theo thời gian Phương pháp đếm tế bào đơn giản cách đếm tế bào đặn nuôi cấy tương ứng với thời gian tăng gấp đơi theo ước tính tế bào động vật có vú Điều cho thấy sinh trưởng phát triển tế bào Hai phương pháp tế bào đếm trực tiếp sử dụng thường xuyên dựa kiểm tra trực quan thơng qua kính hiển vi điện tử đếm hạt Cả hai phương pháp phụ thuộc vào việc có mẫu hệ thống tế bào ổn định Vì vậy, vơ quan trọng để đảm bảo việc nuôi cấy trộn lẫn cách khuấy lắc trước lấy mẫu Phương pháp gián tiếp ước tính tăng trưởng tế bào dựa vào việc đo lường thành phần tế bào tế bào DNA protein hoặc, cách khác, thay đổi tế bào chẳng hạn suy giảm chất dinh dưỡng hoạt động enzyme phát hành tế bào Phương pháp gián tiếp dự toán tăng trưởng phụ thuộc vào mối quan hệ thông số đo nồng độ tế bào Tuy nhiên, điều quan trọng nhận mối quan hệ tuyến tính q trình ni cấy ghi dựng đường chuẩn Nó có ghi nhận tổng hàm lượng protein mức độ hoạt động enzyme cụ thể đo sở tế bào thay đổi đáng kể q trình ni cấy kết thay đổi tốc độ tăng trưởng thành phần môi trường nuôi cấy Trong số trường hợp xảy ra, ví dụ, phản ứng sinh học tế bào cho phép đo gián tiếp tăng trưởng tế bào lựa chọn Điều sử dụng để theo dõi phát triển q trình ni cấy Tuy nhiên, cần thực liệu sử dụng phân tích so sánh mơi trường ni cấy, khác biệt phản ánh thay đổi chuyển hóa làm nồng độ tế bào tăng đáng kể I) Mở đầu: I.1.Sự tăng trưởng tế bào Động vật nhiều loại sinh vật đa bào khác cấu tạo từ loại mô khác Các mô cấu tạo từ tế bào loại Như vậy, tế bào đơn vị cấu trúc nhỏ thể, đơn vị chức sống Việc nuôi cấy tế bào động vật thực sở điều khiển trình tổng hợp enzyme hoạt động enzyme, hai yếu tố định khả phát triển tế bào, khả tạo sản phẩm trao đổi chất tế bào, khả phân chia tế bào Trong trình phát triển tế bào, có hai vấn đề ảnh hưởng định đến kết quả: - Bản chất tự nhiên tế bào, hay nói cách khác nguồn gốc tế bào - Những yếu tố môi trường định đặc trưng riêng biệt tế bào Khả phân chia tốc độ tăng trưởng tế bào động vật chậm Do đặc điểm di truyền, tế bào vi khuẩn thường phân chia với tốc độ nhanh, khoảng 20-50 phút Ở động vật thực vật, chu kỳ tế bào thường kéo dài 20-70 (Nguyễn Đức Lượng Lê Thị Thủy Tiên, 2002) Nếu điều kiện đó, loại tế bào thể đa bào lại tăng số lượng cách bất thường, thể chuyển sang trạng thái bệnh lý Lưu ý: Khi nuôi cấy tế bào động vật cần giá đỡ q trình phát triển, nhân đơi Trừ tế bào máu số giai đoạn tế bào sinh dục, hầu hết mô tế bào động vật cần bám vào giá đỡ để sống phân chia Tế bào ngừng phân chia hình thành lớp đơn liên tục bề mặt dụng cụ nuôi Tuy vậy, số dòng tế bào tế bào ung thư dòng tế bào kiên tục từ mơ bình Hình 1.Các bào quan gồm: (1)hạch nhân, (2) nhân, (3) ribosome, 4) túi tiết,(5) mạng lưới nội chất (ER) hạt, (6) máy Golgi, (7) khung xương tế bào, (8) ER trơn, (9) ty thể, (10) không bào, (11) tế bào chất, (12) lysosome, (13) trung thể I.2.Con đường sinh trưởng phát triển tế bào Pha ức chế Pha ức chế pha đầu tiên, phụ thuộc nhiều yếu tố thành phần, mật độ, trạng thái ban đầu tế bào Pha xảy sớm, không tăng số luợng tế bào (số lượng tế bào giảm) Nếu mật độ ni cấy khả sống tế bào nuôi cấy thấp pha kéo dài Pha phát triển (pha lag) Sau – ngày nuôi cấy, số lượng tế bào bắt đầu tăng lên nhanh chóng Trong chẩn đốn, thường sử dụng bình tế bào phủ 80% bề mặt bình (ở pha phát triển) Pha lag (hoặc pha tĩnh khởi đầu tiềm tàng) thời kỳ khởi đầu q trình ni cấy, suốt thời kỳ thay đổi số lượng tế bào không không đáng kể Mặc dù số lượng tế bào không tăng lên, Pha ổn định Mật độ tế bào không tăng, tốc độ chết tốc độ sinh trưởng Sự sinh trưởng tế bào bị hạn chế do: Hết dinh dưỡng Các sản phẩm trình trao đổi chất ức chế phát triển tế bào Tế bào phủ kín chất nền, nên khơng chỗ bám khơng thể sinh sản tiếp Pha tĩnh hay pha chết: Số lượng tế bào chết tăng, mật độ tế bào sống giảm Sinh trưởng quần thể tế bào thường bị hạn chế sử dụng hết toàn chất dinh dưỡng có sẵn tích lũycác sản phẩm độc trao đổi chất Kết tốc độ sinh trưởng giảm sinh trưởng cuối dừng lại Ở thời điểm nuôi cấy gọi pha tĩnh Giai đoạn chuyển tiếp pha hàm mũ pha tĩnh bao gồm thời kỳsinh trưởng không cân suốt thời kỳ thành phần khác tế bào tổng hợp tốc độ không Kết tế bào pha tĩnh có thành phần hóa học khác với tế bào pha hàm mũ Pha tĩnh thường pha chết mà thể quần thể bị chết Sự chết xuất suy yếu việc bảo quản lượng tế bào, tích lũy sản phẩm độc tố Giống sinh trưởng, chết hàm mũ Trong số trường hợp, thể không chết mà phân hủy, q trình gọi phân giải Chính việc quan sát phát triển tế bào thường gắn với giai đoạn ổn định II) Nội dung: II.1.Định nghĩa phương pháp gián tiếp gì? Là phương pháp khơng cần sử dụng kính hiển vi ni cấy tế bào động vật phương pháp đếm trực tiếp nhận biết phát triển tế bào Phương pháp thường ứng dụng cho nhà máy việc tính tốn tế bào tốn thời gian cần có phương pháp ước lượng mật độ tế bào phát triển để vào sản xuất II.2 Các phương pháp nhận biết phát triển tế bào phương pháp vật lý 2.1 Phương pháp đo độ đục dinh dưỡng để xác định số lượng tế bào Phương pháp nhanh hơn, mẫn cảm dùng phương pháp đo độ đục nhờ tán xạ ánh sáng Mức độ tán xạ ánh sáng tỷ lệ thuận với nồng độ tế bào Lúc nồng độ tế bào đạt đến 107 tế bào/ml dịch nuôi cấy vẩn đục, nồng độ tăng độ đục tăng theo làm cản trở ánh sáng qua dịch ni Có thể đo độ tán xạ ánh sáng quang phổ kế (spectrophotometer) Ở mức độ hấp thụ ánh sáng thấp, nồng độ tế bào giá trị hấp thụ ánh sáng có quan hệ tuyến tính (hình 9) Chẳng hạn, thu tế bào thể tích định dịch nuôi cấy, rửa đo tổng lượng protein hay tổng lượng nitrogen, thấy tăng lượng tế bào phù hợp với tăng tổng lượng protein (hay N) Cũng tương tự vậy, việc xác định tổng lượng chlorophyll dùng để đo sinh khối tảo; đo hàm lượng ATP biết sinh khối vi sinh vật sống Thông qua việc đo độ hấp thụ ánh sáng xác định sinh khối Khi số lượng tế bào tăng lên dẫn đến việc tăng độ đục, mức độ tán xạ ánh sáng nhiều quang phổ kế đo mức độ tăng lên trị số hấp thụ ánh sáng Trên quang phổ kế có hai thang chia độ: phía trị số hấp thụ ánh sáng, phía mức độ thấu quang Khi trị số hấp thụ ánh sáng tăng lên mức độ thấu quang hạ xuống 2.2 Định lượng DNA để xác định lượng tế bào phương pháp quang phổ: Một giao thức thường sử dụng liên quan đến việc điều trị tế bào có khả hòa tan với thuốc thử huỳnh quang liên kết với DNA Phát huỳnh quang cung cấp cao nhạy cảm với thuốc thử Hoechst 33.258 (8) 4e,6-diamidino-2-phenyl-indol (DAPI, 9) từ Sigma Chemical Co 1.Nguyên tắc: dựa vào hấp thụ mạnh ánh sáng tử ngoại bước sóng 260 nm base purine pyrimidine Giá trị mật độ quang bước sóng 260 nm (OD260 nm – Optical Density260 nm) mẫu đo cho phép xác định nồng độ ADN mẫu dựa vào tương quan sau : Một đơn vị OD260 nm tương ứng với nồng độ : - 50 μg/ml cho dung dịch ADN sợi đôi - 40 μg/ml cho dung dịch ADN hay ARN sợi đơn Hàm lượng DNA xác định công thức: [DNA] = OD260 x 50 x X (μg) Trong X số lần pha loãng từ dung dịch DNA gốc ban đầu Phương pháp đơn giản, nhanh, có hạn chế giá trị đọc độ hấp thụ bị ảnh hưởng mẫu chứa RNA protein Trong thực tế phương pháp thường dùng để định lượng mẫu DNA tinh khiết Độ DNA xác định tỉ số OD260/ OD280 Nếu tỉ số > 1,8 dung dịch DNA đem đo coi Khái niệm lượng protein lại dung dịch DNA tách OD260nm: Giá trị mật độ quang mẫu bước sóng 260 nm OD280nm: Giá trị mật độ quang mẫu bước sóng 280 nm n: Độ pha loãng (thường n = 100) - Thực hiện: Dùng dung dịch TE 1X để tạo đường chuẩn Pha lỗng dung dịch DNA đến nồng độ thích hợp để đo (thường pha loãng 100 lần) với dung dịch TE 1X: hút µl dung dịch DNA hòa tan với 495 µl TE 1X Cho vào cuvet để tiến hành đo OD 2.Vật liệu, hóa chất, dụng cụ - Dung dịch DNA - Dung dịch pha loãng DNA (TE) - Nước cất - Pipet - Ống đong - Máy quang phổ phân tích DNA / RNA - Bếp cách thủy 3.Tiến hành - Pha loãng dung dịch ADN 50, 100 lần từ dung dịch gốc 50 μl ADN - Cho ml dung dịch ADN pha loãng vào cuvet tiến hành đo giá trị OD bước sóng 260 nm 280 nm ghi kết thu - Lấy ml dung dịch ADN vào ống effpendof đun cách thủy nhiệt độ 90 – 1000C (đun nước sơi cho ống vào, đun khoảng -5 phút) để làm biến tính ADN II.2.2Phương pháp đếm gián tiếp cách đo điện trở Phương pháp gián tiếp để xác định sinh khối tế bào dựa phép tính hệ số tỷ lượng tồn phần (overall stoichiometry) cho sinh trưởng tạo thành sản phẩm, trình bày dạng chung sau: nguồn carbon+ nguồn nitrogen + phosphate + O2 → sinh khối tế bào + CO2+ H2O + sản phẩm Sự thay đổi sinh khối tế bào kiểm soát gián tiếp cách xác định tiêu thụ chất dinh dưỡng, tạo thành sản phẩm,các thành phần tế bào, giải phóng nhiệt tính chất vật lý khác dịch nuôi cấy tế bào Biểu đồ 2.2 thể mối quan hệ với điện trở nhiệt độ phát triển tế bào Máy đếm Coulter Máy đếm Coulter thiết bị chuyên dùng cho việc đếm đo kích thước hạt mơi trường điện giải Nó sử dụng cho loại tế bào, vi khuẩn, tế bào prokaryotic virus Một máy đếm Coulter điển hình có hay nhiều vi kênh (microchannels) phân cách hai buồng chứa dung dịch điện giải Khi dung dịch chứa hạt chứa tế bào qua vi kênh nhỏ này, hạt gây nên thay đổi ngắn điện trở dung dịch kênh Máy đếm phát thay đổi điện trở - Nguyên lý Coulter Nguyên lý Coulter hạt qua lỗ, với dòng điện, tạo điện trở kháng tỉ lệ với kích thước hạt qua lỗ Sự thay đổi trở kháng xuất phát từ việc hạt chen vào dung dịch điện giải Nguyên lý Coulter đặt theo tên người sáng tạo, Wallace H Coulter Ngun lý có nhiều thành cơng cơng nghiệp y dược, đặc biệt lĩnh vực huyết học, lĩnh vực mà áp dụng để đếm đo kích thước nhiều loại tế bào làm nên máu Tế bào, hạt dẫn điện kém, làm thay đổi tính dẫn điện vi kênh Nếu hạt dẫn điện so với dung dịch xung quanh, điện trở kênh tăng, làm cho dòng điện qua kênh giảm Bằng cách quan sát thay đổi dòng điện, số lượng hạt lượng chất lỏng định đếm Mức độ thay đổi dòng điện liên quan tới kích thước hạt, cho phép việc đo phân bổ kích thước hạt, điều tương quan đến việc tính chuyển động, điện tích bề mặt, nồng độ hạt.Máy đếm Coulter phận quan trọng phòng thí nghiệm bệnh viện Nhiệm vụ phân tích nhanh xác việc đếm tồn máu (thường gọi CBC) CBC sử dụng để xác định số lượng bạch cầu hồng cầu thể Trước đây, tiến trình thường liên quan đến việc chuẩn bị nhuộm tế bào máu đếm thủ cơng loại tế bào kính hiển vi, q trình thường nửa Máy đếm Coulter có nhiều ứng dụng bao gồm sơn, ceramic, thủy tinh, luyện kim sản xuất thức ăn Chúng thường sử dụng việc quản lý chất lượng.Máy đếm Coulter đóng vai trò quan trọng phát triển máy phân loại tế bào đầu tiên, có liên quan đến ngày đầu việc phát triển máy đếm tế bào dòng chảy (flow cytometry) Thậm chí đến ngày hơm nay, số máy đếm tế bào dòng chảy sử dụng nguyên lý Coulter để cung cấp thơng tin xác kích thước số tế bào II.2.3 máy đếm tế bào theo nguyên lý dòng chảy 2.3.1 Hệ thống tạo dòng chất lỏng (fluidics system) Hệ thống tạo dòng chất lỏng phận máy đếm tế bào dòng chảy Hệ thống tạo dòng chất lỏng gồm có vùng chất lỏng có áp lực khác Dòng dịch lỏng bên ngồi (sheath fluid) gọi dung dịch tạo dòng bao: có tác dụng “nắn chỉnh” dòng dịch lỏng chứa mẫu bên (core fluid) gọi dòng lõi thành dòng hẹp tới mức tế bào/hạt vật chất mẫu qua khe hẹp từ giúp tập trung tế bào/vật thể nhỏ có mẫu thành dòng tế bào đơn vận chuyển dòng tế bào đơn qua hệ thống quang học với tốc độ cao, khoảng 1000 tế bào/giây Điều chỉnh mức độ chênh lệnh áp lực dòng bao dòng lõi mở rộng thu hẹp tiết diện dòng lõi, phù hợp với u cầu phân tích (ví dụ phân tích tế bào máu cần dòng lõi lớn, phân tích ADN cần dòng lõi hẹp) Nhờ chế hệ thống phân tích đồng thời nhiều đặc tính tế bào cách xác, giảm yếu tố nhiễu Dịch dùng tạo dòng sheath thường phải đáp ứng yêu cầu: (1) không gây ảnh hưởng tới tế bào (không làm tan tế bào); (2) không làm ảnh hưởng đến độ chiết quang độ huỳnh quang hệ thống Ở số dòng máy người ta sử dụng ống vi mao thay cho dòng bao 10 Hình 2.3.1 Hệ thống dòng chất lỏng buồng mẫu (flow cell) 2.3.2 Hệ thống quang học Bao gồm nguồn phát tia sáng (thường đèn laser đèn hồ quang), hệ thống kính lọc kênh thu tín hiệu quang học tính hiệu huỳnh quang (FSC – Forward Scatter Chanel, dùng thu nhận tín hiệu ánh sáng tán xạ góc thẳng; SSC – Side Scatter Chanel, dùng thu nhận tín hiệu ánh sáng tán xạ góc bên, FL (Fluoressen Light), dùng thu nhận tín hiệu ánh sáng huỳnh quang từ kênh màu huỳnh quang số kênh màu huỳnh quang dao động t đến 18 FL tùy dòng máy; PMT – Photo Multiplier Tube, ống nhân quang tương ứng với kênh màu huỳnh quang có vai trò khuếch đại tín hiệu ánh sáng huỳnh quang) Khi tế bào hay vật thể qua nguồn sáng, ánh sáng nguồn sáng tương tác với vật thể tạo ánh sáng tán xạ (tán xạ góc thẳng tán xạ góc bên) tế bào/vật thể nhuộm màu huỳnh quang, kích thích nguồn sáng, chất màu huỳnh quang phát ánh sáng huỳnh quang Sau tia sáng qua hệ thống kính lọc (đó 11 thấu kính cho phép tia sáng có bước sóng định xun qua) Với hệ thống kính lọc tia sáng tán xạ ánh sáng huỳnh quang phân chia đến hệ thống thu nhận tín hiệu cách xác Hình 2.3.2Hệ thống quang học 2.3.3 Hệ thống điện tử (electronics system) Hệ thống điện tử chất hệ thống có máy, tín hiệu ánh sáng tán xạ tín hiệu huỳnh quang sau khuếch đại PMT hệ thống điện tử chuyển thành tín hiệu số đo đếm biểu dạng biểu đồ cột, biểu đồ mật độ hay biểu đồ điểm máy tính thơng qua phần mềm chuyển đổi chuyên dụng theo máy 12 Hình 2.3.3 Hệ thống quang học hệ thống điện tử thu nhận tín hiệu 2.3.4 Cơ chế nhuộm kháng nguyên bề mặt tế bào trình thu nhận tín hiệu 2.3.4.1 Cơ chế nhuộm kháng nguyên bề mặt Trên bề mặt tế bào đích có kháng nguyên đặc trưng cho quần thể tế bào Ví dụ: trường hợp tế bào T-CD4 có kháng nguyên đặc trưng CD3 CD4 Thông qua việc xác định diện kháng nguyên bề mặt tế bào này, người ta xác định có mặt số lượng phần trăm tế bào đích tương ứng quần thể tế bào phân tích Thơng thường, người ta sử dụng kháng thể đơn dòng có gắn chất phát huỳnh quang có khả gắn đặc hiệu với kháng nguyên bề mặt tế bào Khi ủ với mẫu phân tích, kháng thể đơn dòng có gắn chất phát huỳnh quang gắn đặc hiệu với kháng nguyên tương ứng chúng có bề mặt tế bào Hình 2.3.4.1 Kháng thể đơn dòng có gắn chất phát huỳnh quang gắn vào kháng nguyên tương ứng nằm tế bào đích q trình ủ 13 2.3.4.2 Q trình thu nhận tín hiệu Tế bào/vật thể nhỏ di chuyển qua nguồn sáng tương tác với tia laser sinh tín hiệu sáng: Ánh sáng tán xạ góc thẳng thu nhận qua kênh FSC (Forward Scatter Chanel) Do thu nhận thẳng góc (song song) với trục ánh sánh nguồn, ánh sáng tán xạ góc thẳng phản ánh kích thước tế bào/vật thể phân tích (hình minh họa) Ánh sáng tán xạ góc bên thu nhận qua kênh SSC (Side Scatter Chanel) Do thu nhận góc bên (90 độ) theo trục ánh sáng nguồn, ánh sáng tán xạ góc bên phản ánh độ phức tạp nhân bào tương tế bào Nếu tế bào có kích thước lớn, số FSC thu lớn Tế bào nhiều hạt khoang bào tương, nhân quận, chia múi số SSC cao Như vậy, thành phần bạch cầu thấy số SSC quần thể tế bào lympho thấp nhất, quần thể mono cao quần thể lympho, SSC quần thể bạch cầu hạt đa nhân lớn 14 Hình 2.3.4.2a Đồ thị chiều SSC FSC mẫu máu toàn phần ly giải hồng cầu cho thấy quần tế bào bạch cầu phân tách thành quần thể rõ rệt theo kích thước mức độ phức tạp cấu trúc bên tế bào Các tín hiệu màu huỳnh quang (FL-Fluoressent Light) từ phức hợp kháng thể kháng nguyên bề mặt tế bào đích thu nhận theo kênh màu huỳnh quang khuếch đại ống nhân quang PMTs (photomultipliers tube) Khi tia laser chiếu vào chất phát huỳnh quang tạo ánh sáng huỳnh quang sau tín hiệu sáng thu nhận, chuyển đổi thành tín hiệu điện tử biểu thị dạng biểu đồ gồm quần thể dương tính âm tính với huỳnh quang tương ứng với kháng nguyên cần khảo sát Hình 2.3.4.2b Hiển thị tín hiệu huỳnh quang máy tính phân tích Các tế bào khơng gắn gắn với kháng thể đơn dòng biểu thành cột âm tính (góc trái) , quần thể tế bào gắn nhiều kháng thể đơn dòng biểu thành cột dương tính (góc phải) có đơi chút khác biệt Điều cần ý liên quan đến việc lựa chọn phối hợp màu huỳnh quang phân tích đa màu Tổng hợp tín hiệu ánh sáng tán xạ góc thẳng, ánh sáng tán xạ góc bên tín hiệu ánh sáng huỳnh quang tương ứng tế bào giúp phân biệt tế bào với nhóm tế bào khác quần thể Ngồi ra, việc khoanh vùng (gating) quần thể mong muốn giúp thực thống kê tiếp tục phân tích sâu 2.3.5 Đếm tế bào lympho T-CD4 kỹ thuật đếm tế bào dòng chảy 15 Ứng dụng nguyên lý tế bào dòng chảy dùng việc xác định số lượng tuyệt đối phần trăm số lượng tế bào l ympho T-CD4 máu tồn phần gọi xét nghiệm đếm tế bào lympho T-CD4 Để xác định quần thể tế bào lympho T-CD4 máu toàn phần, hãng khác sử dụng chiến lược tạo cổng, kháng thể cách thức tính số lượng tuyệt đối tế bào khác để xác định số lượng phần trăm tế bào lympho T-CD4 có máu tồn phần Số lượng tuyệt đối lympho T-CD4 máu tồn phần thường xác định thông qua việc sử dụng hạt bi với số lượng xác định đo xác thể tích mẫu phân tích xác Với nguyên lý đo thể tích, thơng thường nhà sản xuất thiết kế máy có khả đo xác lượng thể tích định, sau số tế bào thực tế đếm được, độ pha lỗng thể tích mẫu máu ban đầu cho vào để tính tốn số lượng tuyệt đối lympho T-CD4/µl Số lượng tế bào đếm x Tổng thể tích mẫu sau xử lý T-CD4 tuyệt đối/µl = Thể tích mẫu hút máy x Thể tích mẫu máu Trong đó, với ngun lý xác định thể tích dựa bi chuẩn Ban đầu nhà sản xuất hay người sử dụng cho lượng bi chuẩn với số lượng biết trước vào ống tuýp xử lý mẫu Sau trộn với mẫu máu, hỗn dịch tế bào máu bi chuẩn xem đồng Trong trình đếm, máy đếm lượng nhỏ xác định bi chuẩn tế bào máu Từ thơng số trên, máy tính tốn giá trị số lượng tuyệt đối lympho T-CD4: Số lượng tế bào đếm x Tổng số bi chuẩn ban đầu T-CD4 tuyệt đối/µl = Số bi chuẩn đếm máy x Thể tích mẫu máu ban đầu Các máy đếm tế bào lympho T-CD4 chuyên biệt cho giá trị phần trăm giá trị tuyệt đối tế bào lympho T -CD4 máu tồn phần hay gọi hệ thống máy Tuy nhiên, trường hợp ghi nhận giá trị phần trăm lympho T-CD4 số lượng tuyệt đối tế bào lympho T-CD4 máu toàn phần, người ta kết hợp với giá trị tổng lympho bào máu thu nhận từ máy huyết học để xác định thơng số lại Trong trường hợp sửdụng kết hợp máy đếm tế bào lympho T-CD4 máy huyết học, người ta gọi phương pháp hai máy Cách tính giá trị phần trăm lympho T-CD4 có giá trị số lượng tế bào lympho T-CD4 tổng lympho bào: 16 2.3.6 Ứng dụng phân tích lượng glucose Một thay đổi hệ thống xét nghiệm glucose oxidase sử dụng máy phân tích chẳng hạn mơ hình YSI 27 công nghiệp Analyzer (Instrument Co, Inc) Công cụ cung cấp với màng khác có chứa enzyme cố định thích hợp để đo chất phân tích đặc biệt ví dụ glucose axit lactic Mẫu tiêm vào màng , mà chuyển đổi glucose thành hydrogen peroxide , xác định cảm biến hệ thống dựa điện cực Clark Sau bao gồm điện cực bạch kim, mà biện pháp hydrogen peroxide amperometrically H2O2 2H + + O2 + 2e (1) AgCl + e Ag + Cl (2) Dòng chảy cực dương bạch kim tuyến tính tỷ lệ thuận với vùng nồng độ hydrogen peroxide Điện cực trì mức 0,7 V bạc / bạc clorua tham chiếu điện cực,khả xác định phương trình Các tín hiệu tỷ lệ thuận với số lượng glucose tiêm, chuyển đổi thành điện áp thiết bị điện tử II.3 phương pháp hóa học II.3.1Phương pháp định lượng protein Đây phương pháp gián tiếp xác định tế bào Có số phương pháp đo màu dựa phép đo thành phần tế bào Đây phương pháp tương đối đơn giản phù hợp với nhiều mẫu Tuy nhiên, thành phần tế bào thay đổi đáng kể ni cấy 17 Ví dụ, protein enzyme thành phần tế bào cao thời gian phát triển tăng trưởng nential thấp giai đoạn trễ pha tĩnh Protein tổng số tế bào sử dụng biện pháp sinh khối (tổng cộng hàm lượng tế bào) Hàm lượng protein tế bào động vật có vú thường 100-500 pg / tế bào Các đo lường hữu ích việc xác định hoạt động enzyme cụ thể, thường thể tối đa đo vận tốc phản ứng loại enzyme tổng số protein tế bào Các xét nghiệm đo màu phổ biến phương pháp Lowry Bradford Trong số này, xét nghiệm Bradford ưa chuộng tốc độ, nhạy cảm, can thiệp đáng kể từ thành phần tế bào khác Bằng phương pháp ly giải tế bào thêm vào thuốc thử, Coomassie màu xanh Màu xanh phát triển 10 phút đo máy đo màu quang phổ kế so sánh với protein tiêu chuẩn - Phản ứng biuret Peptide đặc biệt chứa từ liên kết peptide trở lên có khả tạo phức cho màuMận chin với dịch kiềm chứa CuSO4 nhờ tạo lien kết coordinate gọi liên kết cua nguyên tử N tham gia liên kết với Cu+2 Nồng độ peptide protein dung dịch tỷ lệ với độ đậm đặc màu Người ta thương sử dụng albumin máu bò BSA để dựng đường chuẩn đo giá trị OD bước sóng 540nm, đối chứng dịch biuret đệm nước Một số tác dụng gây cản trở phản ứng đệm amino acid đệm Tris Phương pháp biuret có ưu điiểm cho kết ổn định với loại protein khác dễ dàng thực Nhược điểm: chủ yếu độ nhạy phương pháp thấy - Xác định nồng độ protein hoà tan theo Lowry a Nguyên tắc Là phương pháp nhạy (đạt tới 5µl).Phương pháp dựa sở phức chất đồng protein khử hỗn hợp photphomolipden – photphovonphramat (thuốc thử Folin – ciocalteu) tạo phức chất mầu xanh da trời có độ hấp thụ cực đại bước sóng 660nm Cường độ mầu hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ protein phạm vi định Dựa vào mức độ hấp thụ quang học protein chuẩn, ta xác định hàm lượng protein mẫu nghiên cứu b Hoá chất cần dùng - Dung dịch A: 4g NaOH (0,1M) 20g Na2CO3 (2%) pha 1000ml nước cất - Dung dịch B: 0,5g CuSO4.5H2O (0,5%) pha dung dịch Natri Xitrat (1%) 18 dung dịch Natri, Kali Tactơrat 1% - Dung dịch C: Hỗn hợp hai dung dịch A B theo tỉ lệ 49:1 (pha trước dùng) - Thuốc thử folin, trước dùng pha loãng hai lần cho độ axit 1N - Albumin huyết bò 1mg/ml c Cách tiến hành - Mẫu thí nghiệm: lấy xác 0,5ml dịch chứa protein với hàm lượng thích hợp cho vào ống nghiệm, thêm vào 2ml dung dịch C, lắc để yên 10 phút Sau thêm vào hỗn hợp ống nghiệm 0,25ml folin pha loãng lần, lắc để yên 30 phút, mầu vàng hỗn hợp chuyển sang mầu xanh da trời đạt đến cường độ mầu cực đại Đem so mầu hỗn hợp máy so mầu quang điện bước sóng 660nm Xác định trị số mật độ quang học dung dịch nghiên cứu Đo máy lần lặp lại lấy trị số trung bình - Mẫu đối chứng: 0,5ml đệm cho vào ống nghiệm, thêm vào 2ml dung dịch C bước tiến hành mẫu thí nghiệm d Xây dựng đường đồ thị chuẩn Hàm lượng protein tan dung dịch xác định theo phương pháp Lowry, dùng albumin huyết bò (BSA) làm chất chuẩn Cân 0,01g (10mg – albumin huyết bò) hồ tan 10ml nước, ta dung dịch gốc có nồng độ 1mg/ml Sau pha lỗng dung dịch gốc nước cất với nồng độ 20, 40, 60, 80, 100, 120 g/ml để tiến hành xây dựng đồ thị chuẩn - Mẫu thí nghiệm: lấy xác 0,5ml dung dịch BSA nồng độ pha loãng cho vào ống nghiệm, thêm vào ống 2ml dung dịch C để nhiệt độ phòng 10 phút, sau cho 0,25ml thuốc thử folin (1N) đem so mầu với bước sóng 660nm - Mẫu đối chứng: lấy 0,5 ml nước cất cho vào ống nghiệm, thêm vào 2ml dung dịch C bước tiến hành mẫu thí nghiệm Thứ tự việc thực giống với phương pháp biuret, độ nhạy phương pháp cao khoảng 100 lần nhiên có ảnh hưởng đệm Tris, (NH4)2SO4 nồng độ > 15% Glycine nồng độ >0,5% mercaptan Ngoài protein có hàm lượng tysosine tryptophan khaccs cho kết khác - Phương pháp Braford Khắc phục hạn chế phương pháp đầu nhờ sử dụng chất màu gắn protein( Braford, 1976, Biorad, 1984) Chất màu Coomassie gắn với protein dung dịch có tính acid làm thay đổi đỉnh hấp thụ từ 465nm coomassie lên 595nm Thường sử dụng globulin albumin máu bò làm protein chuẩn Pháp đo tiện sử dụng loại chất màu xuất gần phút ổn định gần Độ nhạy phương pháp cao đạt tới 1-20µg, nhạy phương pháp lowry, phương pháp Braford cho kết khác loại protein khác 3.2 Xác định tế bào nhờ định lượng glucose 19 Huyết dùng môi trường nuôi cấy khơng đắt tiền mà nguồn nhiễm bẩn virus mycoplasma Do chất hóa học huyết chưa xác định đầy đủ nên số trường hợp ảnh hưởng xấu đến kết nuôi cấy Sự diện nhiều protein khác huyết làm phức tạp trình phân tách tinh đầu (downstream processing) Vì lý đó, nhiều nghiên cứu thực để xây dựng công thức môi trường khơng có huyết Những cơng thức chứa hormone nhân tố sinh trưởng tinh để thay cho huyết Trong mơi trường có khoảng 5- 10% glucose Như bảng môi trường : Chính mơi trường ni tế bào động vật có chứa glucose Để biết tế bào động vật tiêu thụ glucose hay không tiêu thụ vào nhiêu người ta tiến hành: - Glucose xác định thơng qua xét nghiệm đo màu sử dụng hai enzyme, glucose oxidase peroxidase : D-glucose + H2O + O2 axit D-gluconic + H2O2 (1) H2O2 + 2H2O giảm o-dianisidine + oxy hóa o-dianisidine (màu nâu) (2) Oxy hóa o-dianisidine (màu nâu) + H2SO4 oxy hóa o-dianisidine (màu hồng) (3) Phương trình xúc tác glucose oxidase (GOD) phương trình peroxidase (POD) Thuốc nhuộm, o-dianisidine hydrochloride, giảm hydrogen peroxide để sản phẩm có màu hồng diện acid sulfuric (3) dùng đo màu Bộ glucose oxidase từ công ty Sigma Chemical Co 20 - Glucose đo enzym hai phản ứng sau xúc tác hexokinase (HK) glucose 6-phosphate dehydrogenase ( G6PDH) : D- glucose + ATP  glucose-6- P + ADP (1) Glucose-6- P + NAD  phosphogluconate + NADH + H + (2) HK chuyển đổi glucose thành glucose 6-phosphate diện ATP (1) Glucose -6- P chuyển đổi thành phosphogluconate G6PDH (2) Sự hình thành liên kết NADH giám sát thay đổi hấp thụ 340 nm , tỷ lệ thuận với nồng độ glucose ban đầu Bộ HK từ công ty Sigma Chemical Co chứa thuốc thử HK/G6PDH Bộ bao gồm giải pháp tiêu chuẩn đường (1 mg / ml ) II.4 Những ảnh hưởng đến sinh trưởng tế bào 4.1 Sự tiêu thụ chất dinh dưỡng Cần chọn chất dinh dưỡng mà chất không sử dụng để tổng hợp sản phẩm trao đổi chẩt Phosphate, sulfate magnesium chọn lựa tốt Khi sinh khối tế bào sản phẩm chính, nồng độ nguồn carbon lại mơi trường đo để đánh giá sinh khối tế bào 4.2 Tạo thành sản phẩm Điều quan trọng cần kiểm tra sản phẩm tạo thành có kết hợp với sinh trưởng hay không Một số sản phẩm tạo thành sau sinh khối tế bào đạt tới pha tĩnh (stationary phase) chu kỳ sinh trưởng thế, khơng kết hợp với sinh trưởng Sự giải phóng CO2 xác định có quan hệ tỷ lượng sinh trưởng tế bào Một sản phẩm hoàn toàn chung cho phản ứng lên men ion H+ Lượng kiềm bổ sung vào dịch lên men trì độ pH thích hợp cho sinh trưởng 4.3 Các thành phần tế bào Đối với nuôi cấy trải qua sinh trưởng cân bằng, thành phần tế bào thuộc nhóm đại phân tử protein, RNA DNA xác định thay cho sinh khối tế bào Tuy nhiên, cần phải thận trọng tỷ lệ nguyên liệu tế bào thay đổi theo thời gian nuôi cấy không trải qua sinh trưởng cân 4.4 Giải phóng nhiệt 21 Sự sinh trưởng tế bào phát nhiệt Lượng nhiệt phát tùy thuộc vào hiệu suất sử dụng lượng carbon Vì thế, việc xác định nhiệt độ hệ lên men kết hợp gián tiếp với sinh trưởng tế bào Tuy nhiên, lượng nhiệt tồn phần tích lũy hệ lên men phụ thuộc vào hiệu phối hợp nguồn sinh nhiệt nhiệt khác như: nhiệt từ trình khuấy bay hơi, nhiệt tiêu hao xung quanh thành hệ lên men nhiệt nhạy (sensible heat) luồng khơng khí Vì thế, để xác định sinh trưởng giải phóng nhiệt, cần phải thiết lập cân lượng hệ lên men công việc không dễ dàng 4.5 Độ nhớt Sinh trưởng thể hệ sợi (nấm) tạo thành polysaccharide làm tăng độ nhớt dịch lên men (fermentation broth) Vì thế, việc xác định độ nhớt dịch lên men hữu ích q trình lên men quy mơ cơng nghiệp Độ nhớt biểu kiến đo tốc độ dịch chuyển cố định dùng để đánh giá nồng độ tế bào nồng độ sản phẩm III Kết luận Xu hướng nuôi cấy tế bào nhân lên tế bào khơng có thực vật mà ở động vật, việc người tác động vào tế bào ảnh hưởng phần không nhỏ phát triển tế bào Các phương pháp nêu thấy khả đo lượng nồng độ tế bào động vật nhờ mà khoa học tiến tới nhiều tri thức Một sản phẩm tinh từ nuôi cấy tế bào động vật có vú khơng thể có 100% hoạt tính sinh học mà tùy thuộc vào biến đổi kiểu glycosylation thóai biến phân 22 giải protein Hai thông số chịu ảnh hưởng điều kiện môi trường Phương thức glycosyl hóa thay đổi phản ứng với nhiều nhân tố kiểu nuôi cấy, pha sinh trưởng nuôi cấy mẻ, dù tế bào sinh trưởng microcarrier dịch huyền phù, nồng độ glucose, nồng độ ammonium, hiệu hormone môi trường, diện huyết thanh, hàm lượng protein lipid môi trường, pH nồng độ O hòa tan Vì vậy, việc chọn điều kiện sinh lý thích hợp q trình sản xuất quan trọng để có glycosyl hóa xác protein dược phẩm Không chất lượng sản phẩm động vật có vú mà tồn hiệu suất ni cấy tế bào động vật có vú bị ảnh hưởng nhiều thông số pH, nồng độ ion ammonia/ammonium lactate, nồng độ serum, phương pháp nuôi cấy, tuổi nuôi cấy, lượng mẫu cấy gây thành phần môi trường Do phức tạp sinh lý tế bào động vật có vú, phối hợp với môi trường phương pháp nuôi cấy khác sử dụng, thường khó khăn việc tách riêng ảnh hưởng nhân tố đặc trưng Tuy nhiên, thơng số có ảnh hưởng rõ rệt lên hiệu suất đặc trưng sản phẩm tế bào động vật có vú tốc độ sinh trưởng.Cả hai động học sản xuất kết hợp có sinh trưởng khơng sinh trưởng xảy IV Tài liệu tham khảo Trang web http://giaoan.violet.vn/present/same/entry_id/1905803 http://luanvan.co/luan-van/thi-nghiem-cong-nghe-sinh-hoc-2197/ Sách tham khảo 23 Trần Văn Nhân Ngơ Thị Nga 2002 Giáo trình Cơng nghệ xử lý nước thải NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Trần Thị Thanh 2003 Công nghệ vi sinh NXB Giáo dục, Hà Nội Nguyễn Văn Uyển Nguyễn Tiến Thắng 1999 Những kiến thức công nghệ sinh học.NXB Giáo dục, Hà Nội Arora M 1998 Biological Control of Environmental Pollution Vol 1, Anmol Publications PVT, Ltd New Delhi, India Ratledge C and Kristiansen B 2002 Basic Biotechnology.Cambridge University Press, UK Đái Duy Ban.2002 Công nghệ sinh học trồng vật nuôi & bảo vệ môi trường 24 ... dung: II.1.Định nghĩa phương pháp gián tiếp gì? Là phương pháp khơng cần sử dụng kính hiển vi ni cấy tế bào động vật phương pháp đếm trực tiếp nhận biết phát triển tế bào Phương pháp thường ứng dụng... phương trình Các tín hiệu tỷ lệ thuận với số lượng glucose tiêm, chuyển đổi thành điện áp thiết bị điện tử II.3 phương pháp hóa học II.3. 1Phương pháp định lượng protein Đây phương pháp gián tiếp. .. bào tốn thời gian cần có phương pháp ước lượng mật độ tế bào phát triển để vào sản xuất II.2 Các phương pháp nhận biết phát triển tế bào phương pháp vật lý 2.1 Phương pháp đo độ đục dinh dưỡng