Nghiên cứu phân lập và tuyển chọn một số chủng vi khuẩn methylobacterium sp từ lá dương xỉ (marattiaceae)

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG ĐẶNG THỊ MỸ TRIỀU NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN METHYLOBACTERIUM SP TỪ LÁ DƯƠNG XỈ (MARATTIACEAE) Đà Nẵng – Năm 2018 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG ĐẶNG THỊ MỸ TRIỀU NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN METHYLOBACTERIUM SP TỪ LÁ DƯƠNG XỈ (MARATTIACEAE) Ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Cán hướng dẫn : TS PHẠM THỊ MỸ Đà Nẵng – Năm 2018 LỜI CAM ĐOAN Tơi cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nêu khóa luận trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Đà Nẵng, tháng năm 2018 Tác giả luận văn ĐẶNG THỊ MỸ TRIỀU LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Phạm Thị Mỹ người trực tiếp truyền đạt kinh nghiệm q báu động viên tơi suốt q trình thực khóa luận Xin cảm ơn thầy ThS Vũ Đức Hồng nhiệt tình hướng dẫn giúp đỡ tơi q trình thực Tơi xin chân thành cảm ơn thầy cô Khoa Sinh - Môi trường - Đại học Sư Phạm - Đại học Đà Nẵng tận tình giảng dạy, truyền đạt kiến thức cho em năm học Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè ln giúp đỡ động viên em suốt thời gian làm khóa luận Xin chân thành cảm ơn! Sinh viên thực Đặng Thị Mỹ Triều MỤC LỤC DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG BIỂU DANH MỤC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu đề tài Ý nghĩa đề tài CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 KHÁI QUÁT CHUNG VỀ METHYLOBACTERIUM SP 1.1.1 Lịch sử phát phân loại VK Methylobacterium sp .3 1.1.2 Đặc điểm phân bố 1.1.3 Đặc điểm hình thái, sinh hóa, sinh lí 1.1.4 Phương pháp phân lập định danh 1.1.5 Các loài vi khuẩn thuộc chi Methylobacterium 1.1.6 Một số ứng dụng chi Methylobacterium 1.2 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ VI KHUẨN METHYLOBACTERIUM SP TRONG NƯỚC VÀ TRÊN THẾ GIỚI 10 1.2.1 Một số nghiên cứu giới 10 1.2.2 Một số nghiên cứu nước 12 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU 15 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 15 2.1.2 Phạm vi nghiên cứu 15 2.1.3 Nội dung nghiên cứu 15 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 16 2.2.2 Phương pháp thu mẫu 17 2.2.3 Phương pháp phân lập 17 2.2.4 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái tế bào test sinh hóa chủng VK tuyển chọn 18 2.2.5 Phương pháp định danh chủng VK kỹ thuật sinh học phân tử 20 2.2.6 Phương pháp khảo sát số yếu tố ảnh hưởng đến khả sinh trưởng chủng VK tuyển chọn 22 2.2.7 Phương pháp xây dựng đường cong sinh trưởng chủng VK tuyển chọn 23 2.2.8 Phương pháp xử lý số liệu 24 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 25 3.1 PHÂN LẬP VI KHUẨN TỪ MẪU LÁ DƯƠNG XỈ 25 3.2 NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI TẾ BÀO VÀ CÁC TEST SINH HÓA CỦA CÁC CHỦNG VK ĐƯỢC TUYỂN CHỌN 27 3.3 ĐỊNH DANH CHỦNG VK T6, T12 BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ 32 3.3.1 Tách chiết khuếch đại gen 32 3.3.2 Giải trình tự đoạn gen 16S – rRNA định danh loài 33 3.4 KHẢO SÁT MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH SINH TRƯỞNG CỦA CHỦNG VK T6 VÀ T12 36 3.4.1 Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ methanol 36 3.4.2 Nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ 37 3.4.3 Nghiên cứu ảnh hưởng pH 38 3.5 NGHIÊN CỨU ĐƯỜNG CONG SINH TRƯỞNG CỦA CHỦNG VK T6 VÀ T12 38 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40 KẾT LUẬN 40 KIẾN NGHỊ 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO 41 CTAB CMS: CFU: IAA: MMS: NCBI PCR: PHB: PPFM: PTN VK: UV: VSV: DANH MỤC BẢNG BIỂU Kí hiệu bảng 1.1 2.1 3.1 3.2 DANH MỤC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ Số hiệu Tên hình ản 2.1 Lá dương xỉ 2.2 Sơ đồ bố trí 2.3 Phương pháp 2.4 Chu trình nh 3.1 3.2 3.3 Hình thái kh dương xỉ Hình thái kh Tế bào T6, T7, T8, T 3.4 Thử nghiệm 3.5 Test Urease 3.6 Sinh khối củ 3.7 Sản phẩm PC 3.8 Tìm kiếm trì 3.9 3.10 3.11 3.12 3.13 Tìm kiếm Ảnh hưở chủng Ảnh hưởng c T6 T12 Ảnh hưởng c T12 Đường cong 120h nuôi cấ MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Chi Methylobacterium bao gồm nhiều lồi vi khuẩn (VK) có sắc tố hồng dinh dưỡng methyl tuỳ ý (pink-pigmented facultatively methylotrophic, PPFM) Chúng cư ngụ chủ yếu vùng lá, đơi tìm thấy đất nước Chúng sử dụng methanol từ thực vật làm nguồn carbon chủ yếu đồng thời sinh tổng hợp chất điều hòa tăng trưởng thực vật (auxin, cytokinin, salicylic acid), vitamine (B12) enzyme (urease, ACC deaminase) để tác động ngược trở lại thực vật, nhóm VK có ích nên chúng sử dụng để tăng suất lúa [35], kích thích sinh trưởng mía, bơng vải hay gia tăng tính kháng bệnh đậu phộng [9], [23], [36] Bên cạnh đó, Methylobacterium sp có khả sử dụng đa dạng hợp chất hữu khác nhau, từ chất không độc chất độc sinh vật hay chất gây ô nhiễm môi trường (methyl bromine, methyl chloride, methane, trinitrotoluent, Hg, Ni, Cd ) chúng có nhiều tiềm để ứng dụng xử lý ô nhiễm môi trường [46] M radiotolerans, M extorquens, M fujisawaense có khả kháng mạnh với chất phóng xạ, chúng tồn liều chiếu xạ 20kGy Vì thế, nhóm VK sử dụng làm vi sinh vật thị cho khả vô trùng vật dụng dùng ngành công nghiệp thực phẩm, y tế xử lý vô trùng công nghệ chiếu xạ [45] Do sử dụng hợp chất carbon làm nguồn lượng nên VK Methylobacterium sp VK kiểu mẫu đầy tiềm việc sử dụng nguồn nguyên liệu rẻ tiền để sản xuất sản phẩm có giá trị chẳng hạn như: βcarotene, vitamine B12, Q10, amino acid…[23], [46] Ngày nay, nhiều cơng trình tập trung nghiên cứu vào việc thiết kế hệ thống vector tái tổ hợp nhằm biểu protein ngoại lai tế bào vi khuẩn Methylobacterium sp., hai cơng trình bật hướng nghiên cứu biểu bacteriocin tinh thể độc tố diệt sâu [23] Đặc biệt, hướng tiếp cận nhiều nhà khoa học giới quan tâm hướng sử dụng protein đơn bào từ vi sinh vật làm nguồn 42 tích lũy PHB chủng Methylobacterium radiotolerans H2T, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 8(3B): 1551-1556 [11] - Phạm Thị Kim Ngọc (2014), Ứng dụng phương pháp vi sinh, hóa sinh giải trình tự vùng gen 16S – rRNA để định danh VK Lactic có khả sinh Protease trình lên men mắm mực, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 30, số 6S: 703-708 [12] Lê Xn Phương (2008), Giáo trình vi sinh vật học mơi trường, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội [13] TCVN 8551:2010 - Tiêu chuẩn Việt Nam trồng – phương pháp lấy mẫu chuẩn bị mẫu [14] Lê Lý Thùy Trâm, Kiều Nam Phương, Bùi Văn Lệ (2006), Thu nhận poly-β hydroxybutyrate- loại nhựa sinh học dễ phân hủy từ VK methylobacterium sp phân lập Việt Nam, Tạp chí KH CN Đại học Đà Nẵng, số 1(13), Tr 47-52 [15] Khuất Bửu Thanh (2003), Cơ sở di truyền phân tử kỹ thuật gen, NXB Khoa học kỹ thuật TÀI LIỆU TIẾNG ANH [16] Ackermann J.U., muller s., Losche A., Bley T., Babel W.(1995), “Methylobacterium rhodesianum cells tend to double the DNA content under growth limitations and accumulate PHB” Journal of Biotechnology, Vol.39, pp 9-20 [17] Araujo w L., Maccheroni w Jr., Aguilar-Vildoso c L, Barroso p A V., Saridakis H o., Azevedo J L (2001), “Variability and interractions between endophytic bacteria and fungi isolated from leaf tissues of citrus rootstocks”, Canadian Journal of Microbiology, Vol 47, pp 229-236 [18] Araujo w L., Marcon J., Maccheroni w Jr., Van Elsas J D., Van Vuurde J w L., Azevedo J L (2002), “Diversity of endophytic bacterial populations and their interaction with Xyllella fastidiosa in citrus plants”, Applied and Enviromental Microbiology, Vol 68, No 10, pp 4906-4914 43 [19] Bergey D.H.; Noel R.K.; John G.H (1989), Bergey’s manual of sytematic bacteriology, Publisher: Baltimore, MD: Williams & Wilins [20] Bousfied, I J Green, P N (1985), “Eclassification of Bacteria of the Genus Protomonas Urakami and Komagata 1984 in the Genus Methylobacterium (Patt, Cole, and Hanson) Emend Green and Bousfield 1983”, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, Vol 35, pp 209 [21] Doronina N V., Trotsenko Y A., Kuzentsov B B., Tourova T p., Salkinoja- Salonen M s (2002b), “Methylobacterium suomiense spp nov and Methylobacterium lusitanum spp nov., aerobic, pink-pigmented, facultatively methylotrophic bacteria”, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, Vol 52, pp 773-776 [22] Feinberg L.A, Burr G, Tlusty M, Rhyne A, Szczebak JT, Bourque B, Bowen JL, Marx CJ (2017), “Multidisciplinary approach to validating a single-cell protein as an alternative protein source in aquaculture feed”, eCollection 2017, pp 7710- 7717 [23] Green P N (1992) “The Genus Methylobacterium”, In Balows A., Troper H G., Dworkin M., Harder V., Schleifer K H (ed.) The Prokaryote, 2nd ed., Springer-Verlag, Berlin, pp 2342-2345 [24] Gallego V., Garcisa T M.Ventosa A (2005a), “Methylobacterium hispanicum spp and Methylobacterium aquaticum spp nov., isolated from drinking water”, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, Vol.55, pp 281-287 [25] Gawel N J., Jarret R L (1991), “A modified CTAB DNA extraction procedure for Musa and Ipomoea”, Plant Molecular Biology Reporter 9, pp.262-266 [26] Holland M A., Polacco J C (1994) “PPFMs and other coveư contaminants: is there more to plant physiology than just plant?”, Plant Physiology, Vol 45, pp 197-209 [27] Hiraishi A., Furuhata K., Matsumoto A., Koike K A., Fukuyama M., Tabuchi K (1995), “Phenotypic and genetic diversity of chrorine-resistant 44 Methylobacterium strains isolated from various environment”, Applied and Enviromental Microbiobiology, Vol 61, No 6, pp 2099-2107 [28] Homschuh M., Grotha R., Kutschera u (2002), “Epiphytic bacteria associated with the bryophyte Funaria hygrometrica: effects of Methylobacterium strains on protonema development”, Plant biol (Stuttg) Vol.4, pp 682-687 [29] Kang Y s., Kim J.7 Shin H D., Nam Y D., Bae J w., Jeon c o., Park w (2007), “Methylobacterium platani spp nov., isolated from a leaf of the tree Platanus orientalis”, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, Vol 57, pp 2849-2853 [30] Koenig R L., Morris R O., Polacco J C (2002) “tRNA is the source of lowlevel trans-zeatin production in Methylobacterium sp”, Journal of bacteriology, Vol 184, No 7, pp 1832-1842 [31] Korotkova N., Lidstrom M E (2001), “Connection between PolyHydroxybutyrate biosynthesis and growth on Cl and C2 compounds in the methylotrop Methylobacterium extorquens AMi”, Journal of Bacteriology, Vol 183, No 3, pp 1038-1046 [32] Kato Y., Asahara M., Goto K., Kasai H., Yokota A (2008), “Methylobacterium persicinum spp nov., Methylobacterium komagatae spp nov., Methylobacterium brachiatum spp nov., Methylobacterium tardum spp nov and Methylobacterium gregans spp nov., isolated from freshwater”, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, Vol 58, pp 1134-1141 [33] Listrom M E., Crowth G J (2008) “Formate as the main branch point formethylotrophic metabolism in Methylobacterium extorquens AM1.”, Journal of Bacteriology, Vol 184, No 7, pp 1832-1842 [34] Madhaiyan M., Ponguzhali S., Senthilkumar M., Seshdri S., Chung H., Yang J., Sundaram S, SA T (2004) “Growth promotion and induction of systemic resistance in rice cultivar Co-47 (Oryza satva L.) by Methylobacterỉum sp.” Bot Bull Acad Sin., Vol 45, pp 315-324 45 [35] Madhaiyan M., Poonguzhali S., Sundaram S.P., Tongmin Sa, (2002), “ A new insight into foliar applied methanol influencing phylloplane methylotrophic dynamics ang growth promotion of cotton (Gossypium hirsutum L.) and sugarcane (Saccharum ofticinarum L.)” Environmental and Experimental [36] Maliti C M (2000) “Physiological and biochemical effects of Methylobacterium sp Strains and foliar-applied methanol on growth and development of rice Oryza satival L”, Ph.D thesis, the city University of New [37] Mercan N., Aslime B., Yuksekdag Z.N., Beyatli Y (2002), “Production of Poly-B-Hydroxybutyrate (PHB) by Some Rhizobium Bacteria” Turk Biol 26pp.215-219 [38] Mly M., Chen H (2004), “Effect of intensive insulin therapy on beta-cell function and glycaemic control in patients with newly diagnosed type diabetes: a multicentre randomised parallel-group trial”.MPMI Vol 12, No 9, pp 829-832 [39] Omer Z S., Tombolini R., Broberg A., Gerhardson B (2004a) “Indole-3acetic acid production by pink-pigmented facultative methylotrophic bacteria”, Plant Growth Regulation, Vol 43, pp 93-96 [40] Omer Z S., Tombolini R., Gerhardson B (2004b) “Plant colonization by pink- pigmented facultative methylotrophic bacteria (PPFMS)”, FEMS Microbiology Ecology, Vol 47, pp 319-326 [41] Patt T E., Cole G C., Hanson R S (1976), “Methylobacterium, a New Genus of Facultatively Methylotrophic Bacteria”, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, Vol 26, pp 226- 229 [42] Penalvera c G N., Morin D., Canteta F., Saurel o., Alain M., Vorholt J A (2006), “Methylobacterium extorquens AMi produces a novel type of acylhomoserine lactone with a double unsaturated side chain under methylotrophic growth conditions” FEBS Letters, Vol 580, pp 561-567 [43] Saiki R.K., Scharf S., Faloona F., Mullis K., Horn G., Erlich H., Arnheim N., (1985), "Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and 46 restriction site analysis for diagnosis anemia" Science 230 (4732): pp.1350–1354 of sickle cell [44] Stepnowski p., Blotevogel K H., Jastor B (2004), “Extraction of carotenoid produced during methanol waste biodegradation”, International Biodeterioration & Biodegradation, Vol 53, pp 127 - 132 [45] Van Aken B., Peres C M., Doty S L., Yoon J M., Schnoor J L (2004a), “Methylobacterium populi sp nov., a novel aerobic, pink- pigmented, facultatively methylotrophic, methane-utilizing”, Applied and Environmental Microbiology, Vol 60, No 1, pp 308-317 [46] Van Aken B., Yoon J M., and Schnoor J L (2004b) “Biodegradation of notrosubstituted explosives 2,4,6-trinitrotoluene, hexahydro-1,3,5-trinitro-1,3,5- triazine, and octahydro-1,3,4,5-tetranitro-1,3,4-tetrazocine by a phytossymbiotic Methylobacterium sp Associated with poplar tissues (Populus deltoids_nigra DN34)” Applied and Environmental Microbiology, Vol 70, No 1, pp 508-517 [47] Verhoef R., De Waard p., Schols H A., Siika-aho M., Voragen A G J (2003), “Methylobacterium spp isolated from a finnis paper machine produces highly pyruvated galactan exopolysaccharide”, Carbohydrate Research, Vol 338, pp 1851-1859 [48] Weon H Y., Kim B Y., Joa J H., Son J A., Song M H., Kwon s w., Go s J., Yoon s H (2008), “Methylobacterium iners spp nov and Methylobacterium aerolatum spp nov., isolated from air samples in Korea”, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, Vol 58, pp 93-96 [49] Zhang L L., Chen J M., Fang F (2008), “Biodegradation of methyl t-butyl ether by aerobic granules under a cosubstrate condition”, Appl Microbiol Biotechnol, Vol 78, pp 543-550 47 WEBSITE [50] https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi ( 20/4/2018) [51] https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi (20/2/2018) PHỤ LỤC  Thành phần môi trường CMS KNO3 NH4NO3 CaCl2.2H2O KH2PO4 MgSO4.7H2O FeSO4.7H2O Na2EDTA CoCl2.6H2O CuSO4.5H2O H3BO3 HI2 MnSO4 Na2MoO4.2H2O ZnSO4.7H2O Glycine Sucrose Vitamin B1 Meso inositol Cao thịt Casein hydrolyase pH ∗ Thành phần môi trường MRS Peptone Bột Lab-Lemco Bột chiết nấm men Glucose Sorbitan mono-oleate K2HPO4 Sodium acetate 3H2O Triammonium citrate MgSO4.7H2O Agar Nước cất pH cuối (25ºC)  Thành phần môi trường MMS K2HPO4 KH2PO4 CaCl2.6H2O MgSO4.7H2O NaCl FeCl3.6H2O (NH4)2SO4 CuSO4.5H2O MnSO4.5H2O Na2MoO4.2H2O H3BO3 ZnSO4.7H2O CoCl2.6H2O Nước cất pH Agar Methanol [a] o [a]: bổ sung sau hấp 121 C 15 phút PHỤ LỤC  Kết giải trình tự chủng vi khuẩn T6  Kết giải trình tự chủng T12 PHỤ LỤC KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG NỒNG ĐỘ METHANOL ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TRƯỞNG CỦA HAI CHỦNG T6 VÀ T8 (Đơn vị: 10 CFU/ml) Chủng VK % Methanol KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA NHIỆT ĐỘ ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TRƯỞNG CỦA HAI CHỦNG T6 VÀ T8 (Đơn vị: 10 CFU/ml) KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA pH ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TRƯỞNG CỦA HAI CHỦNG T6 VÀ T8 (Đơn vị: 10 CFU/ml) Chủng VK pH KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG ĐƯỜNG CONG SINH TRƯỞNG HAI CHỦNG T6 VÀ T12 (Đơn vị: 10 CFU/ml) Chủng VK Số ... Nghiên cứu phân lập tuyển chọn số chủng VK Methylobacterium sp từ dương xỉ (Marattiaceae) Mục tiêu đề tài Đề tài thực với mục tiêu phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn Methylobacterium sp từ dương. .. SƯ PHẠM KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG ĐẶNG THỊ MỸ TRIỀU NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN METHYLOBACTERIUM SP TỪ LÁ DƯƠNG XỈ (MARATTIACEAE) Ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Cán hướng... loài vi khuẩn thuộc chi Methylobacterium 1.1.6 Một số ứng dụng chi Methylobacterium 1.2 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ VI KHUẨN METHYLOBACTERIUM SP TRONG NƯỚC VÀ TRÊN THẾ GIỚI 10 1.2.1 Một số