15.32 XÁC ĐỊNH NITROGEN TRONG VẮC XIN VÀ SINH PHẨM Nguyên lý Phương pháp dựa vào tính chất thuốc thử Nessler cho phản ứng màu với ion amoni (NH 4+) tạo thành sau vơ hố chất protein Phương pháp tiến hành a Chuẩn bị mẫu thử: Cho 1ml chế phẩm 1ml dung dịch acid tricloracetic 20% (TT) vào ống ly tâm 10ml, để nhiệt độ đến oC 10 đến 12 Sau ly tâm 3500 vòng/phút giờ, loại bỏ nước Rửa tủa 2ml dung dịch acid tricloracetic 5%, tiếp tục ly tâm 3500 vòng/phút giờ, loại bỏ nước Thêm vào cặn 0,2ml acid sulfuric đậm đặc (TT) đem vơ hố bếp cát dung dịch màu Để tăng tốc độ phản ứng cho vài giọt dung dịch oxy già (H2O2) đậm đặc vào ống đốt sau làm nguội Khi chế phẩm vơ hố hồn tồn, dung dịch màu, thêm nước cất lần vào đủ 10ml, thu dung dịch A Lấy 1ml dung dịch A vào ống nghiệm, thêm 8,5 ml nước cất lần 0,5ml thuốc thử Nessler, mẫu thử b Song song tiến hành làm mẫu trắng gồm: 9,5ml nước cất lần 0,5ml thuốc thử Nessler c Song song tiến hành dựng đường chuẩn: Hút dung dịch amoni sulfat chuẩn có hàm lượng 0,05 mg nitrogen/ml vào ống nghiệm theo thứ tự sau: 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7 ml Thêm nước cất lần vừa đủ 9,5 ml 0,5 ml thuốc thử Nessler Lắc ống nghiệm Đo mật độ quang (Phụ lục 4.1) bước sóng 420 nm Vẽ đồ thị đường chuẩn Lượng nitrogen protein chế phẩm tính theo cơng thức sau: ax 6,25 x10 X (mg / ml ) ax0,0625 1,0 x1,0 x1000 Trong đó: a: Lượng nitrogen tìm đường chuẩn (g) 6,25: Hệ số chuyển đổi nitơ thành protein 10: Độ pha lỗng dung dịch vơ hóa (ml) 1,0: Lượng mẫu thử đem so màu (ml) 1,0: Lượng mẫu thử đem tủa vơ hóa (ml) 1000: Hệ số chuyển g thành mg Cách pha dung dịch amoni sulfat chuẩn có hàm lượng nitrogen 0,05mg/ml Cân 0,2375g amoni sulfat (đã sấy khơ bình hút ẩm silicagel đến trọng lượng khơng đổi), hồ tan vào vừa đủ 500 ml nước cất lần Dung dịch vừa pha có hàm lượng nitrogen 0,1mg/ml, trước dùng pha lỗng gấp đơi nước cất lần Tiêu chuẩn cho phép Hàm lượng nitrogen protein vắc xin sinh phẩm tùy theo yêu cầu loại mẫu thử