Đánh giá sự tương đồng trình tự ADN ribosom ITS giữa loài bạc căn với loài hà thủ ô trắng và sàng lọc tác dụng ức chế tế bào ung thư của bạc căn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ QUỲNH HOA ĐÁNH GIÁ SỰ TƯƠNG ĐỒNG TRÌNH TỰ ADN RIBOSOM ITS GIỮA LỒI BẠC CĂN VỚI LỒI HÀ THỦ Ơ TRẮNG VÀ SÀNG LỌC TÁC DỤNG ỨC CHẾ TẾ BÀO UNG THƯ CỦA BẠC CĂN LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI 2012 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ QUỲNH HOA ĐÁNH GIÁ SỰ TƯƠNG ĐỒNG TRÌNH TỰ ADN RIBOSOM ITS GIỮA LỒI BẠC CĂN VỚI LỒI HÀ THỦ Ơ TRẮNG VÀ SÀNG LỌC TÁC DỤNG ỨC CHẾ TẾ BÀO UNG THƯ CỦA BẠC CĂN LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH : HÓA SINH DƯỢC MÃ SỐ : 60 73 25 Người hướng dẫn khoa học: TS Phùng Thanh Hương Ths Hà Thu HÀ NỘI 2012 LỜI CẢM ƠN Với lòng kính trọng biết ơn sâu sắc, em xin phép gửi lời cảm ơn chân thành tới : TS Phùng Thanh Hương Ths Hà Thu Những người Thầy trực tiếp hướng dẫn tận tình, dìu dắt giúp đỡ em suốt q trình thực đề tài Xin nói lời cảm ơn chân thành tập thể Thầy, Cô trường Đại học Dược Hà Nội giúp em trang bị kiến thức cần thiết để hồn thành khóa học Thạc sĩ Cảm ơn phòng ban, đặc biệt Phòng sau đại học, giúp đỡ em nhiệt tình trình học tập Xin chân thành cảm ơn thầy, cô giáo, chị kỹ thuật viên - mơn Hóa sinh - trường Đại học Dược Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi giúp em hoàn thành luận văn Xin cảm ơn anh, chị, em cơng tác Phòng Vi sinh phân tử Viện Cơng nghệ sinh học Phòng Thử hoạt tính sinh học – Viện Hóa Học, Viện Khoa học Cơng nghệ Việt Nam hết lòng giúp đỡ em trình thực đề tài tốt nghiệp Xin cảm ơn gia đình, bạn bè ln ln động lực, nguồn cổ vũ giúp em hồn thành khóa học luận văn tốt nghiệp Học viên Nguyễn Thị Quỳnh Hoa MỤC LỤC Trang DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH ẢNH ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan ADN Ribosom ITS (ITS – rADN) 1.1.1 Cấu trúc ADN Ribosom ITS 1.1.2 Vai trò ADN Ribosom ITS 1.1.3 Ứng dụng ADN Ribosom ITS nghiên cứu thuốc 1.2 Bạc (Streptocaulon kleinii Wight &Arn) 1.2.1 Vài nét họ Thiên lí (Asclepiadaceae) 1.2.2 Vài nét chi Streptocaulon 10 1.2.3 Loài Bạc (Streptocaulon kleinii Wight &Arn) 13 1.2.4 Tình hình nghiên cứu sử dụng số thuốc thuộc phân họ Chu đằng, họ Thiên lý 13 1.2.5 Tình hình nghiên cứu sử dụng lồi Bạc (Streptocaulon kleinii Wight &Arn) 14 CHƯƠNG NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 126 2.1 Nguyên liệu nghiên cứu 16 2.1.1 Hóa chất, sinh phẩm 16 2.1.2 Trang thiết bị 18 2.2 Phương pháp nghiên cứu 19 2.2.1 Thu mẫu giám định tên khoa học 19 2.2.2 Phương pháp tách chiết ADN tổng số 20 2.2.3 Phương pháp khuếch đại ADN PCR 21 2.2.4 Phương pháp điện di ADN gel agarose 22 2.2.5 Phương pháp tách dòng 22 2.2.6 Phương pháp biến nạp ADN plasmid vào tế bào khả biến E.coli chủng TOP10F’ 24 2.2.7 Phương pháp tách chiết ADN plasmid từ vi khuẩn 26 2.2.8 Phương pháp cắt ADN enzym giới hạn 27 2.2.9 Phương pháp tinh ADN plasmid 27 2.2.10 Phương pháp giải trình tự ADN 28 2.2.11 Phương pháp so sánh trình tự ADN 30 2.2.12 Phương pháp đánh giá tác dụng ức chế tế bào ung thư loài Bạc Căn (Streptocaulon kleinii Wight &Arn) 30 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 34 3.1 Trình tự ADN ribosom vùng ITS loài Bạc Căn (Streptocaulon kleinii Wight &Arn) 34 3.1.1 Kết chiết tách ADN tổng số từ mẫu Bạc 34 3.1.2 Kết khuếch đại ADN PCR 34 3.1.3 Kết tạo dòng gen ITS-rADN 35 3.1.4 Kết tinh plasmid tái tổ hợp 37 3.1.5 Kết xác định trình tự ADN ribosom vùng ITS loài Bạc Căn (Streptocaulon kleinii Wight &Arn) 38 3.1.6 Kết so sánh trình tự ITS-rADN lồi Bạc với trình tự lồi Hà thủ trắng 39 3.2 Kết đánh giá tác dụng ức chế tế bào ung thư loài Bạc Căn (Streptocaulon kleinii Wight &Arn) 40 CHƯƠNG BÀN LUẬN 48 4.1 Về quy trình xác định trình tự ITS-rADN loài Bạc 48 4.2 Về tương đồng trình tự ITS-rADN lồi Bạc lồi Hà thủ trắng 49 4.3 Về tác dụng ức chế tế bào ung thư loài Bạc Căn (Streptocaulon kleinii Wight &Arn) 51 KẾT LUẬN 56 ĐỂ XUẤT 56 DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT A,T,G,C Adenin, Thymin, Guanin, Cytosin ADN Acid deoxyribonucleic ADNr ADN mã hóa cho ARN ribosom ATCC American Type Culture Collection bp Base pair DMEM Dulbecco’s modified Eagle’s medium DMSO Dimethylsulfoxid dNTP Deoxyribonucleotid triphosphat E.coli Escherichia coli EDTA Ethylen diamin tetra acetic acid EtBr Ethidium Bromid FBS Foetal Bovine serum Huyết bào thai bò HepG2 Hepatocellular carcinoma Tế bào ung thư gan người ITS Internal Transcribed Spacer Vùng phiên mã nội ITS- rADN Trình tự ADN ribosom đoạn ITS IPTG Isopropyl β-D-1thiogalactopyranosid Kb Kilo base KB Human epidermic carcinoma Tế bào ung thư biểu mô người LB Lauria Bertani Lu Human lung carcinoma Tế bào ung thư phổi người MCF7 Human breast carcinoma Tế bào ung thư vú người MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5diphenyl tetrazolium bromid PCR Polymerase Chain Reaction RPMI Roswell Park Memorial Institute SDS Sodium Dodecyl Sulphat TAE Tris - Acetic acid - EDTA Taq Thermus aquaticus X-gal 5-bromo-4-Chloro-3-Indolyl-β-DGalactosid DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1.1 Kích thước phần trăm G+C vùng ITS1 ITS2 số loài thực vật hạt kín Bảng 2.1 Cặp mồi dùng phản ứng PCR 16 Bảng 3.1 Tỉ lệ % tế bào bị ức chế cao chiết rễ Bạc nồng độ 5µg/mL dòng tế bào KB 41 Bảng 3.2 Tỉ lệ % tế bào bị ức chế cao chiết rễ Bạc nồng độ 5µg/mL dòng tế bào HepG2 41 Bảng 3.3 Tỉ lệ % tế bào bị ức chế cao chiết rễ Bạc nồng độ 5µg/mL dòng tế bào Lu 41 Bảng 3.4 Tỉ lệ % tế bào bị ức chế cao chiết rễ Bạc nồng độ 5µg/mL dòng tế bào MCF7 41 Bảng 3.5 Tỉ lệ % tế bào bị ức chế cao chiết rễ Bạc dòng tế bào KB 43 Bảng 3.6 Tỉ lệ % tế bào bị ức chế cao chiết rễ Bạc dòng tế bào HepG2 44 Bảng 3.7 Tỉ lệ % tế bào bị ức chế cao chiết rễ Bạc dòng tế bào Lu 45 Bảng 3.8 Tỉ lệ % tế bào bị ức chế cao chiết rễ Bạc dòng tế bào MCF7 46 Bảng 3.9 Tổng hợp kết thử độc tính tế bào cao chiết rễ Bạc dòng tế bào ung thư khác 47 DANH MỤC HÌNH ẢNH Trang Hình 1.1 Cấu trúc vùng ADN ribosom ITS Hình 1.2 Bạc (Streptocaulon kleinii Wight & Arn) Hà thủ ô 12 trắng (Streptocaulon juventas (Lour.) Merr) Hình 2.1 Vector tách dòng PCR 2.1 23 Hình 2.2 Phản ứng chuyển MTT thành formazan 31 Hình 2.3 Các giếng tế bào sau xử lí với MTT 31 Hình 3.1 Ảnh điện di sản phẩm tách chiết ADN tổng số 34 Hình 3.2 Ảnh điện di sản phẩm PCR 35 Hình 3.3 Ảnh điện di thể plasmid tách từ dòng tế bào E.coli 36 sau biến nạp Hình 3.4 Ảnh điện di thể sản phẩm cắt plasmid enzym giới 37 hạn EcoRI Hình 3.5 Ảnh điện di thể sản phẩm tinh plasmid mang gen 38 ITS-rADN Hình 3.6 Trình tự nucleotid đoạn ITS-rADN lồi Bạc 39 Hình 3.7 So sánh trình tự đoạn ITS-rADN lồi Bạc lồi 40 Hà thủ trắng cơng cụ BLAST Hình 3.8 Khả ức chế phát triển cao chiết rễ Bạc nồng độ 5µg/mL dòng tế bào ung thư 42 cho phân loại dựa đặc điểm hình thái, theo đó, hai lồi thuộc chi Streptocaulon, phân họ Chu đằng Trong đó, lồi khác thuộc phân họ Chu đằng Ẩn lân, thuộc chi Cryptolepis, có mức độ tương đồng 77% so sánh với loài Bạc Một nghiên cứu so sánh trình tự ITS-rADN hai lồi Zanthoxylum schinifolium Zanthoxylum piperitum cho thấy mức độ tương đồng 92% [45] Trong thực tế, lúc phân loại dựa đặc điểm hình thái thực vật cho kết xác Nhờ sử dụng trình tự ITS-rADN, mối quan hệ bậc phân loại thực vật tổ chức lại số trường hợp Ví dụ như: lồi N columnaris vốn xếp vào chi Notechidnopsis dựa đặc điểm hình thái, dựa liệu trình tự ITS cho thấy mức độ tương đồng với loài Tromotriche ruschiana loài Tromotriche longipes thuộc họ Thiên lí (Asclepiadaceae) 95%, loài xếp lại vào chi Richtersveldia, thuộc họ Thiên lý (Asclepiadaceae) [35] Để làm rõ mối quan hệ tiến hóa lồi thuộc phân họ Chu đằng Việt Nam, sử dụng liệu trình tự ITS-rADN cơng bố ngân hàng gen giới liệu chưa công bố Viện Sinh thái tài nguyên sinh vật, với trợ giúp phần mềm Paup 4.0, nhằm xây dựng quan hệ tiến hóa số lồi thuộc phân họ Chu đằng Kết thể hình 4.1 Hình 4.1 Biểu đồ thể quan hệ tiến hóa số lồi thuộc phân họ Chu đằng (Periplocoideae) Việt Nam 50 Nguyễn Thị Quỳnh Hoa - Hóa sinh dược - 2012 Thơng qua so sánh trình tự nucleotid đoạn ITS-rADN, thấy phân họ Chu đằng, Bạc có tương đồng di truyền cao với lồi Hà thủ trắng, thể mối quan hệ gần gũi mặt tiến hóa Sự tương đồng di truyền giúp giải thích tương tự hình thái bên ngồi hai lồi Mặt khác, tương đồng di truyền mở triển vọng tương đồng thành phần hóa học tác dụng sinh học Bạc với Hà thủ ô trắng, lồi thuốc với nhiều cơng dụng có giá trị Do đó, cần có nghiên cứu đánh giá tác dụng sinh học Bạc để làm sở cho việc khai thác loài thảo dược điều trị bệnh 4.3 Về tác dụng ức chế tế bào ung thư loài Bạc Căn (Streptocaulon kleinii Wight &Arn) Một hướng nghiên cứu để phòng chữa ung thư nghiên cứu tìm hợp chất tự nhiên có khả ngăn chặn hình thành phát sinh ung thư hay tiêu diệt, ức chế phát triển tế bào ung thư Đã có nhiều hoạt chất tách chiết từ thực vật có tác dụng hỗ trợ điều trị bệnh ung thư ngăn chặn phát triển khối u tìm thấy như: vincristin, vinblastin, podophyllin, taxol, thaliblastin, etoposid, teniposid, elsidin [19], [23], [30], [36] Các nghiên cứu số thuốc có thành phần kể trên: Dừa cạn (Catharanthus roseus) thuộc họ Trúc đào (Apocynaceae), từ Dừa cạn chiết alcaloid chữa ung thư vinblastin, vincristin, dẫn chất bán tổng hợp từ vinblastin vinorelbin eldisin [15] Từ Podophyllum peltatum L (Berberidaceae) chiết chất podophyllotoxin [17], từ Bán chi liên (Scutelaria barbata) chiết chất scutebarbatin, clerodanolid có tác dụng chữa ung thư [9], [12] Cây thông đỏ (Taxus wallichiana zucc) thuộc họ Thanh tùng (Taxaceae)., từ thông đỏ chiết xuất chất 10-deacetylbaccatin II, chuyển hóa thành taxol có tác dụng chữa ung thư [25] Do đó, chắn 51 Nguyễn Thị Quỳnh Hoa - Hóa sinh dược - 2012 thiên nhiên tiềm ẩn hoạt chất có tác dụng chống ung thư chờ người khám phá Theo y học cổ truyền, dịch trích nước rễ Hà thủ ô trắng dùng giải độc, chữa cảm sốt, trị vết sưng đau, vết thương rắn cắn…[4], [11] Các thử nghiệm hoạt tính kháng ung thư cho thấy cao chiết rễ Hà thủ trắng có độc tính chọn lọc năm dòng tế bào ung thư tế bào ung thư tử cung người Hela, tế bào ung thư phổi người A549, tế bào ung thư chuột colon 26L5, tế bào ung thư phổi chuột LLC tế bào ung thư ruột kết chuột B16-BL6 chuột [34], [42], [43] Từ kết nghiên cứu tương đồng hình thái trình tự ADN Hà thủ trắng Bạc căn, nhằm hướng tới mục tiêu sàng lọc nghiên cứu chế chống ung thư thuốc Việt Nam, đề tài tiến hành thử hoạt tính gây độc tế bào cao chiết methanol, rễ Bạc Trước hết tiến hành khảo sát nồng độ 5µg/mL cao chiết rễ Bạc dòng tế bào ung thư để đánh giá khả ức chế phát triển tế bào cao chiết Kết cho thấy nồng độ 5µg/mL cao chiết rễ Bạc căn, khả ức chế phát triển dòng tế bào ung thư dòng tế bào KB, HepG2, Lu, MCF7 49,64%, 83,76%, 13,68%, 15,93% (tính theo tỷ lệ số tế bào sống sót) Điều chứng tỏ dòng tế bào KB giá trị IC50 khoảng xấp xỉ 5µg/mL, dòng tế bào HepG2 giá trị IC50 cao 5µg/mL, hai dòng tế bào Lu, MCF7 giá trị IC50 thấp 5µg/mL Để khẳng định chắn điều này, tiếp tục tiến hành khảo sát dãy nồng độ khác dòng tế bào Kết cho thấy cao chiết rễ Bạc có hoạt tính gây độc tế bào dòng tế bào ung thư KB, HepG2, Lu, MCF7 với giá trị IC50 5,04; 13,02; 2,0 2,0 µg/mL Phương pháp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào Likhiwitayawuid cộng áp dụng Viện nghiên cứu ung thư quốc gia Hoa Kỳ (NCI) qui định IC50 mẫu thơ phải ≤ 20µg/mL 52 Nguyễn Thị Quỳnh Hoa - Hóa sinh dược - 2012 mẫu tinh khiết phải ≤ 5µg/mL chất coi có hoạt tính gây độc tế bào có khả ức chế phát triển diệt tế bào ung thư [33] Kết thu dòng tế bào Lu MCF7 thấp 10 lần dòng tế bào KB thấp lần, HepG2 thấp 1,54 lần so với qui định Điều chứng tỏ cao chiết rễ Bạc có hoạt tính ức chế tế bào cao dòng tế bào ung thư thử nghiệm Ellipticin (5,11-dimethyl-6Hpyrido[4,3-b]carbazole) (Hình 4.2.) alcaloid chiết tách từ khác thuộc họ Trúc đào (Apocyanaceae) như: Ochrosia borbonica, Excavatia coccinea, phân lập lần vào năm 1959 từ Ochrosia elliptica Các nghiên cứu từ trước đến cho thấy ellipticin dẫn xuất (9-hydroxyellipticin, 9-hydroxy-N2-methylellipticinium, 9chloro-N2-methylellipticinium 9-methoxy-N2-methylellipticinium) có tác dụng ức chế tế bào ung thư vú, ung thư thận, ung thư não [40] Do ellipticin chất có khả chống ung thư mạnh thường dùng chất đối chứng dương thử nghiệm độc tính tế bào Chất đối chứng dương ellipticin nghiên cứu thể hoạt tính gây độc dòng tế bào ung thư với giá trị IC50 khoảng từ 0,22µg/mL – 0,89µg/mL Giá trị phù hợp với tài liệu công bố trước [32], [39] Kết thu cao chiết rễ Bạc dòng tế bào ung thư cao so với giá trị IC50 chất đối chứng dương ellipticin Điều giải thích cao chiết rễ Bạc mẫu thơ gồm nhiều chất khác nhau, chưa tách chiết chất tinh khiết có tác dụng ức chế dòng tế bào ung thư nên nồng độ chất tinh khiết thấp, giá trị IC50 cao chất đối chứng dương ellipticin điều hợp lí Mặt khác, chế tác dụng chất có tác dụng ức chế tế bào ung thư Bạc khác với chế tác dụng điều trị ung thư ellipticin Trong dòng tế bào, cao chiết rễ Bạc nhạy cảm với dòng tế bào ung thư phổi 53 Nguyễn Thị Quỳnh Hoa - Hóa sinh dược - 2012 Lu ung thư vú MCF7, sau dòng tế bào ung thư biểu mơ KB nhạy cảm với dòng tế bào ung thư gan HepG2 Ellipticin Hình 4.2 Ellipticin [40] Theo nghiên cứu Nguyễn Văn Hùng cộng thành phần hóa học hoạt tính sinh học Bán chi liên (Scutelaria barbata) phân lập chất scutebarbatin có tác dụng chữa ung thư với giá trị IC50 dòng tế bào KB Lu 21,77µg/mL 10,86µg/mL [9] So sánh giá trị với giá trị IC50 dòng tế bào KB Lu 5,04µg/mL 2,0µg/mL cao chiết rễ Bạc rõ ràng hoạt tính ức chế phát triển tế bào ung thư Bạc cao Một nghiên cứu khác Trần Thị Thanh Hương Chè xanh (camellia sinensis) cho thấy chất polyphenol chiết từ Chè xanh ức chế phát triển dòng tế bào Lu HepG2 với giá trị IC50 39,1µg/mL 38,41µg/mL [10], giá trị cao giá trị IC50 tương ứng 2,0µg/mL 13,02µg/mL Bạc Theo Singh Pragya chất podophyllotoxin có giá trị IC50 dòng tế bào KB MCF7 8,5µg/mL; 3,5µg/mL [38] Trong kết nghiên cứu cho thấy giá trị IC50 cao chiết rễ Bạc dòng tế bào KB MCF7 5,04µg/mL; 2,0µg/mL thấp giá trị IC50 podophyllotoxin Như vậy, cao chiết rễ Bạc có tác dụng ức chế phát triển tế bào ung thư in vitro Kết nghiên cứu mở triển vọng tác dụng điều trị ung thư Bạc Kết thử hoạt tính gây độc tế bào sở khoa học cho nghiên cứu dược lý, thành phần hóa học chế 54 Nguyễn Thị Quỳnh Hoa - Hóa sinh dược - 2012 tác dụng chất cao chiết rễ Bạc để sử dụng làm thuốc chữa bệnh 55 Nguyễn Thị Quỳnh Hoa - Hóa sinh dược - 2012 KẾT LUẬN Đã xác định trình tự đoạn ITS-rADN loài Bạc (Streptocaulon kleinii) Việt Nam Trình tự đoạn ITS-rADN Bạc tương đồng 92% so với trình tự đoạn ITS-rADN lồi Hà thủ ô trắng (Streptocaulon juventas) công bố ngân hàng gen giới Đã đánh giá độc tính tế bào cao chiết rễ Bạc với khả ức chế dòng tế bào ung thư KB, HepG2, Lu, MCF7 (giá trị IC50 5,04; 13,02; 2,0 2,0 µg/mL) ĐỀ XUẤT Nghiên cứu thành phần hóa học tác dụng sinh học Bạc theo định hướng tương đồng với Hà thủ ô trắng để làm sở ứng dụng loài thảo dược điều trị 56 Nguyễn Thị Quỳnh Hoa - Hóa sinh dược - 2012 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Trần Thế Bách (2005), Asclepiadaceae.R.Br.1810 - Họ Thiên lí, Danh mục lồi thực vật Việt Nam, tr.58-75, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội Trần Thế Bách (2007), Nghiên cứu phân loại họ Thiên lí (Asclepiadaceae.R.Br.) Việt Nam, Luận án Tiến sĩ, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam - Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật Bộ môn Thực vật (2005), Thực vật học, Trường đại học Dược Hà Nội Võ Văn Chi (1996), Từ điển thuốc Việt Nam, Nhà xuất Y học, Thành phố Hồ Chí Minh Võ Văn Chi (2002), Từ điển thực vật thông dụng II, Nhà xuất KHKT, Thành phố Hồ Chí Minh Hồ Huỳnh Thuỳ Dương (1997), Sinh học Phân tử, NXB Giáo Dục Bùi Xuân Hào, Nguyễn Thị Hồng Yến, Nguyễn Minh Đức, Trần Lê Quan (2009), “Thành phần hóa học rễ Hà thủ trắng”, Tạp chí phát tiển KH&CN, 12(10), tr.72-77 Phạm Hồng Hộ (1999), Cây cỏ Việt Nam, Nhà xuất trẻ Nguyễn Văn Hùng (2009), “Nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học Bán chi liên Scutellaria barbata D.Don”, Tạp chí hóa học, 47(6B), tr.192-198 10 Trần Thị Thanh Hương (2006), “Bước đầu nghiên cứu tác dụng polyphenol chè xanh (Camellia sinensis) số dòng tế bào ung thư ni cấy”, Tạp chí nghiên cứu Y học, 42(3), tr.1-5 11 Đỗ Tất Lợi (1995), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội 12 Đỗ Thị Thảo, Trịnh Thị Thanh Vân, Nguyễn Quyết Chiến, Nguyễn Văn Hùng, Đỗ Khắc Hiếu (2005), “Nghiên cứu in vitro hoạt chất kháng ung thư Bán chi liên (Scutellaria barbata D.Don)”, Tạp chí Dược học, 11, tr.10-13 Tiếng Anh 13 Alan W.M, David J.L, Jason R.C (2003), “Phylogeny and biogeography of Crinum L (Amaryllidaceae) inferred from nuclear and limited plastid non-coding DNA sequences”, Botanical Journal of the Linnean Society, 141, pp.349–363 14 Alvarez I, Wendel J.F (2003), “Ribosomal ITS sequences and plant phylogenetic inference”, Molecular Phylogenetics and Evolution, 29(3), pp.417– 434 15 Aslam J, Khan S H, Siddiqui Z H (2010), “Catharanthus roseus (L.) G Don An importnant drug: It’s applications and production”, Pharmacie Globale (IJCP), 1(4), pp.1-16 16 Baldwin B.G, Sanderson M.J, Porter J.M, Wojciechowski M.F, Campbell C.S, DonoghueM.J (1995), “The ITS region of nuclear ribosomal DNA: A valuable source of evidence on angiosperm phylogeny”, Ann Missouri Bot Gard, pp.247 – 277 17 Canel C, Rita M.M, Franck E.D, Ferreirab D (2000), “Podophyllotoxin”, Phytochemistry, 54, pp.115-120 18 Chen S et al (2010), “Validation of the ITS2 Region as a Novel DNA Barcode for Identifying Medicinal Plant Species”, PLos one, 5(1), pp.e8613 19 Cragg G.M, Newman D.J (1999), “Discovery and development of antineoplastic agents from natural sources”, Cancer Invest., 17(2), pp.153-63 20 Dominic A.S, Robert H.S, Kenneth D.P (1988), “Evaluation of a Soluble Tetrazolium/Formazan Assay for Cell Growth and Drug Sensitivity in Culture Using Human and Other Tumor Cell”, Cancer research, 48, pp.4827-4833 21 Ghadaa B, Olfaa S (2008), “Sequence analysis of the internal transcribed spacers (ITSs) region of the nuclear ribosomal DNA (nrDNA) in fig cultivars (Ficus carica L.)”, Scientia Horticulturae, 120(1), pp.34 - 40 22 Gretchen M.I (2009), Phylogeny reconstruction of Periplocoideae (Apocybaceae) based on morphological and molecular characters and a taxonomic revision of Decalepis, PhD thesis, University of Florida 23 Han R (1994), “Highlight on the studies of anticancer drugs derived from plants in China”, Stem Cells, 1(12), pp.53-63 24 Ionta GM (2007), “Phylogenetic relationships in Perilocoideae (Apocynaceae) and insights into the origin of Pollinia”, Annals of the Missouri Botanical Garden”, 94(2), pp.360-375 25 Jennewein S, Croteau R (2001), “Taxol: biosynthesis, molecular genetics, and biotechnological applications”, Appl Microbiol Biotechnol, 57, pp.13–19 26 Jin Q, Yi S, Yong HD (2009), “Internal Transcribed Spacer Region of rDNA in Common Wheat and Its Genome Origins”, Acta Agron Sin, 35(6), pp.1021–1029 27 Kaul A, Bani S, Zutshi U, Suri KA, Satti NK, Suri OP (2003), “Immunopotentiating properties of Cryptolepis buchanani root extract”, Phytother Res, 17(10), pp.1140-1144 28 Laupattarakasem P, Houghton PJ, Hoult JR, Itharat A (2003), “An evaluation of the activity related to inflammation of four plants used in Thailand to treat arthritis”, J Ethnopharmacol, 85(2-3), pp.207-215 29 Laupattarakasem P, Wangsrimongkol T, Surarit R, Hahnvajanawong C (2006), “In vitro and in vivo anti-inflammatory potential of Cryptolepis buchanani”, J Ethnopharmacol., 108(3), pp.349-354 30 Lee K.H (1999), “Novel antitumor agents from higher plant”, Med Res Rev, (19), pp.569-596 31 Lee S.K (2006), DNA phylogenetic and chemical studies of phyllanthus spp and effects of various components on liver fibrosis model, PhD thesis, City university of Hongkong 32 Leewanich P, Worachartcheewan A, Prachayasittikul S, Prachayasittikul V (2011), “Anticancer and Antioxidative Activities of Stephania venosa”, European Journal of Scientific Research, 51, pp.150-156 33 Likhitwtayawuid K, Angerhofer C.K, Cordell G.A, Pezzuto J.M (1993), “Cytotoxic and antimalarial bisbenzylisoquinoline alkaloids from Stephania erecta”, J Nat Prod., 56(1), pp.30-38 34 Liu Z (2008), "Studies on the chemical constituents of the vines of Streptocaulon juventas (Lour.) Merr.", Asian Journal of Traditional Medicines, 3(5) 35 Meve U, Liede S (2002), “A molecular phylogeny and generic rearrangement of the stapelioid Ceropegieae (Apocynaceae- Asclepiadoideae)”, Plant Syst Evol., 234, pp.171-209 36 Pezzuto J.M (1997) “Plant-derived anticancer agents”, Biochem Pharmacol, 53(2), pp.121-33 37 Sambrook J, Fritsch E.F, Maniatis (1989), Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor laboratory Press & Cold Spring Harbor 38 Singh P, Faridi U, Srivastava S (2010), “Design and Synthesis of CRing Lactone- and Lactam-Based Podophyllotoxin Analogues as Anticancer Agents”, Chem Pharm Bull, 58(2), pp.242-246 39 Stiborova M, Poljakova J (2011), “Ellipticine cytotoxicity to cancer cell lines- a comparative study”, Interdiscip Toxicol, 4(2), pp.98–105 40 Stiborova M, Rupertovaa M, Heinz H Schmeiserb, Frei E (2006), “Molecular mechanisms of antineoplastic action of an anticancer drug ellipticine”, Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub, 150(1), pp.13–23 41 Tran LQ (2003), “In vitro antiplasmodial activity of antimalarial medicinal plants used in Vietnamese traditional medicine”, Journal of Ethnopharmacology, 86(2), pp.249 - 252 42 Ueda J, Tezuka Y, Arjun H.B, Tran LQ, Tran KQ, Saiki I, Kadota S (2003), “Antiproliferative Activity of Cardenolides Isolated from Streptocaulon juventas”, Biol Pharm Bull, 26, pp.1431-1435 43 Ueda J, Tezuka Y, Arjun H.B, Tran QL, Tran QK, Saiki I, Kadota S (2003), “Constituents of Vietnamese Medicinal Plant Streptocaulon juventas and their Antiproliferative Activity against the Human HT-1080 Fibrosarcoma Cell Line”, J Nat Prod, 66, pp.1427 -1433 44 Wen L, Zimmer E.A (1996), “Inference from ITS sequences of nuclear ribosomal DNA”, Mol Phylogen Evol, 6, pp.166 – 177 45 Yan-Lin S, Wan-Geun P, Oh-Woung K, Soon-Kwan H (2010), “The internal transcribed spacer rDNA specific markers for identification of Zanthoxylum piperitum “, African Journal of Biotechnology Vol, 9(37), pp.6027- 6039 46 Zhang L, A.L Demain (2005), Natural products: Drug discovery and therapeutic medicine, Humana Press 47 Zindand A, Sonnance G (2003), “ITS sequence analysis and phylogenetic inference in the genus Lens Mill”, Annal of Botany, 91, pp.49-54 PHỤ LỤC Streptocaulon kleinii: Internal transcribed spacer 1, 5.8S ribosomal RNA gene, and internal transcribed spacer 2, complete sequence GenBank: JQ086329.1 AUTHORS Phung,T.H., Nguyen,Q.H., Ha,T.T., Dong,V.Q and Tran,T.B TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (29-NOV-2011) Dept of Biochemistry, Hanoi University of Pharmacy, 13-15 Le Thanh Tong Str., Hanoi 10000, Viet Nam FEATURES source Location/Qualifiers 716 /organism="Streptocaulon kleinii" /mol_type="genomic DNA" /db_xref="taxon:1136151" /tissue_type="leave" /country="Viet Nam" /collection_date="10-Dec-2010" /note="authority: Streptocaulon kleinii Wright & Arn" misc_RNA 716 ORIGIN ggaagtaaaa gtcgtaacaa ggtttctgta tgtgaacctg cggaaggata ttatcgaatc 61 ctacaaaaga aaatgactag tgaacatgtg ttttcaatta gggaggtggg tagtttggtt 121 caaacctttt tgcctatctc tccttcggtc gattggtgcc ttgtatggtt cctgattgca 181 tcgaataaca aattaaaaat ccggcatggg aagcgactct cggcaacata tatctagggt 241 tgtcaaggtt aaggctctat taaaatctaa acgactctcg acaacagata tctaggctct 301 tgcatcgatg aagaacatag caaactacga tacttagtgt gaattgtaga atcttgtgaa 361 ccatcgagtg tttgaacaca agttgtgcct gaagccacta ggctgagggc acgtctgcct 421 gggcatcaca agatgtgttg tcccctcgca actcgcctcg tacgggacga gtgttgctaa 481 tggggggtgg agaatggcct cccacgtata ggtgcggccg gcctaaatgg gagtccctta 541 tcgtgggggt cacatcaagt ggtggttgaa aagctcaaac aagttgtgaa caccatgcga 601 tggaggtaac gttttagacg ctaaagcgat tcccctatag agaaaggctc gtgacgactg 661 cgaccccagg tttagcgggc tacccactga gtttacgcat atcaataagc ggagga // ...BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ QUỲNH HOA ĐÁNH GIÁ SỰ TƯƠNG ĐỒNG TRÌNH TỰ ADN RIBOSOM ITS GIỮA LỒI BẠC CĂN VỚI LỒI HÀ THỦ Ơ TRẮNG VÀ SÀNG LỌC TÁC DỤNG ỨC CHẾ... Bạc có tác dụng chữa bệnh giống Hà thủ ô trắng hay không? Xuất phát từ vấn đề nêu trên, tiến hành đề tài: Đánh giá tương đồng trình tự đoạn ADN ribosom ITS loài Bạc với loài Hà thủ ô trắng sàng. .. vùng ITS loài Bạc Căn (Streptocaulon kleinii Wight &Arn) 38 3.1.6 Kết so sánh trình tự ITS- rADN lồi Bạc với trình tự lồi Hà thủ trắng 39 3.2 Kết đánh giá tác dụng ức chế tế bào ung