Báo cáo đồ án hóa sinh

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ CẦN THƠ CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM – CÔNG NGHỆ SINH HỌC BÁO CÁO THỰC TẬP HỌC PHẦN: HÓA SINH Lớp: CNTP0116 Giáo viên hướng dẫn ThS.Đỗ Dương Phương Nam TS.Nguyễn Xuân Nhóm Trần Kim Anh Đậu Minh Châu Minh Châu CẦN THƠ 03/2019 MỤC LỤC Bài CARBOHYDRATE I Mục tiêu II Thiết bị, dụng cụ, hóa chất, nguyên vật liệu III Nội dung Phân biệt monosaccharide disaccharide (phản ứng Barfoed) Định lượng Monosaccharide phương pháp so màu với thuốc thử DNS Định lượng amylose amylopectin Bài PROTEIN Mục tiêu I Thiết bị, dụng cụ, nguyên vật liệu, hóa chất II III Kết tủa protein Kết tủa thuận nghịch Kết tủa bất thuận nghịch: Tiến hành thí nghiệm: Định lượng protein theo phương pháp Biuret 10 Bài LIPID 12 I Mục đích 12 II Thiết bị, dụng cụ, hóa chất, nguyên vật liệu 12 III Nội dung 12 Xác định số peroxyde 12 Chỉ số acid 13 Khảo sát đặc tính Lecithin 14 Bài VITAMIN 16 I Mục tiêu: 16 II Thiết bị, dụng cụ, hóa chất, nguyên vật liệu: 16 III Nội dung: 16 Định lượng vitamin B1 phản ứng với thuốc thử diazo: 16 Định lượng vitamin C 17 Bài ENZYME 20 I Mục tiêu 20 II Thiết bị, dụng cụ, nguyên vật liệu, hóa chất 20 III Xác định hoạt tính enzyme amylase 20 3.1 Đo hoạt tính enzyme amylase 20 3.2 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ chất lên tốc độ thủy phân enzyme 22 3.3 Khảo sát enzyme urease bột đậu nành 23 Bài CARBOHYDRATE I Mục tiêu - Phân biệt monosaccharide disaccharide (phản ứng Barfoed) - Định lượng monosaccharide phương pháp so màu với thuốc thử DNS - Định lượng amylose amylopectin II Thiết bị, dụng cụ, hóa chất, nguyên vật liệu Thiết bị Bếp đun Dụng cụ Ống nghiệm Máy ly tâm Ống nghiệm có nắp Bếp cách thủy Bình tam giác 100 ml Máy đo UV- VIS Bình định mức 100 ml Cốc thủy tinh 50 ml Cốc thủy tinh 100 ml Ống đong 100ml Micropipet 10- 100 𝜇𝑙, 100 1000𝜇𝑙, 1000 – 5000 𝜇𝑙 Pipet 10 ml Hóa chất Nguyên vật liệu Dung dịch glucose 1% Bột gạo Dung dịch Maltose 1% Dưa hấu Dung dịch Sucrose 1% Thuốc thử Barfoed Dung dịch Fehling Thuốc thử DNS Amylose tinh khiết Glucose tinh khiết Dung dịch trichloro acetic acid (TCA) 0.6% Dung dịch NaOH 1N Ethanol Dung dịch iod 0,01N Cồn 90o Một số thiết bị thường dùng phòng thí nghiệm khác III Nội dung Phân biệt monosaccharide disaccharide (phản ứng Barfoed) a) Nguyên tắc: Khả khử monosaccharide lớn nhiều khả khử disaccharide nên thay đổi môi trường base môi trường acid yếu để phân biệt monosaccharide disaccharide b) Tiến hành: Chuẩn bị ống nghiệm, ống chứa ml thuốc thử Barfoed ống chứa ml thuốc thử Fehling Sau cho ml dung dịch đường vào ống theo bảng sau: Ống nghiệm Thuốc thử Barfoed (A) Fehling (B) Glucose (2ml) Glucose (2ml) Maltose (2ml) Maltose (2ml) Sucrose (2ml) Sucrose (2ml) Đun cách thủy ống nghiệm phút, 75oC Làm lạnh, quan sát ống có trầm đỏ Đun tiếp phút, quan sát ống có trầm đỏ c) Kết thí nghiệm a Thuốc thử barfoed b Thuốc thử fehling Hình Kết thí nghiệm sau đun 75oC  Theo kết ta thấy: thuốc thử Barfoed có ống nghiệm chứa glucose (1A) xuất trầm đỏ, thuốc thử Fehling có ống nghiệm xuất trầm đỏ ống chứa glucose ống chứa maltose (1B 2B) ⟶ Giải thích tượng:  Với thuốc thử Barfoed Trong thành phần thuốc thử Barfoed có chứa Cu2+, đường tác dụng với ion Cu2+ có thuốc thử tạo thành phức màu xanh + Ở ống nghiệm chứa glucose ống nghiệm chứa maltose xuất kết tủa đỏ gạch Trong phân tử glucose có chứa nhóm chức CHO phản ứng với ion Cu2+ tạo kết tủa màu đỏ gạch (Cu2O) bám thành ống đáy ống nghiệm + Ở ống nghiệm chứa maltose sau thủy phân tạo thành gốc glucose phản ứng với Cu2+ tạo kết tủa màu đỏ gạch (Cu2O) + Sucrose disaccharide có cấu tạo từ hai monosaccharide glucose fructose liên kết với từ hai nhóm OH glucoside nên khơng có tính khử khơng khử Cu2+ thành Cu2O nên màu dung dịch giữ nguyên  Thuốc thử Fehling: + Ở ống 1B, Glucose khử khử Cu2+ thuốc thử Fehling thành Cu+ (màu đỏ gạch) + Ở ống 2B, Vì Maltose disaccharide có chứa hai góc 𝛼 – Glucopiranose liên kết với nhóm OH vị trí C1 C4 nên phân tử nhóm OH Glycoside mà có tính khử, khử Cu2+ thuốc thử Fehling thành Cu+ có màu đỏ gạch (trong môi trường base) + Ở ống 3B, Sucrose khơng có tính khử nên khơng tạo lớp trầm (Cu+) đáy ống nghiệm Định lượng Monosaccharide phương pháp so màu với thuốc thử DNS a) Nguyên tắc Phương pháp dựa sở phản ứng tạo màu đường khử với thuốc thử acid dinitrosalicylic (DNS) Cường độ màu hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ đường khử phạm vi định So màu tiến hành bước sóng 540 nm Dựa theo đồ thị đường chuẩn glucose tinh khiết với thuốc thử DNS tính hàm lượng đường khử theo mẫu nghiên cứu b) Tiến hành - Cân lượng mẫu định, giã nhuyễn cho vào cốc 100 ml Thêm vào cốc 10 ml cồn 90o Đun sơi lần, sau lấy phần nước Cho bay hết phần cồn dung dịch cách cô cạn Rồi thêm vào 30 ml nước cất Cho tồn dung dịch vào bình định mức 100 ml, thêm ml chì acetate ml natri sunfat Dùng nước cất định mức vạch lọc Ta có dịch đường phân tích - Xây dựng đường chuẩn  Chuẩn bị dung dịch Glucose gốc 10 mg/ml  Chuẩn bị dung dịch bảng sau: Bước Ống nghiệm Dung dịch Nước cất Glucose (ml) (ml) 0,0 1,0 0,2 0,8 0,4 0,6 0,6 0,4 0,8 0,2 1,0 0,0 Thuốc thử DNS (ml) Bước Nước cất (ml) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 Nồng độ glucose (mg/ml) 10 Sau hoàn thành chất bước đun sơi phút làm nguội Khi dung dịch ống nghiệm nguội cho tiếp ml nước cất bước đo độ hấp thu dãy dung dịch chuẩn bước sóng 540 nm để đường chuẩn - Đo mẫu tính toán kết quả: cho vào ống nghiệm ml dịch đường chuẩn bị ml thuốc thử DNS Đun sôi hỗn hợp phút, để nguội Thêm ml nước cất, đo độ hấp thu bước sóng 540 nm so sánh với đường chuẩn để nồng độ đường phân tích - Cơng thức tính hàm lượng đường khử (mg%) = 𝑋×100×100 𝑚 Với: X: Hàm lượng đường khử từ kết đo (mg/ml) m: Khối lượng mẫu (g) c) Kết thực nghiệm  Hàm lượng đường khử đo mẫu g có nồng độ 1,645 (mg/ml)  Hàm lượng đường khử đo mẫu g có nồng độ 0,9326 (mg/ml) Phương trình đường chuẩn: y = a + bx = 2,491x R2 = 0,963 - Tính tốn  Mẫu g Hàm lượng đường khử = 𝑋×100×100 𝑚 = 1,645×100×100 1,019 = 16143 (mg%)  Mẫu 2g Hàm lượng đường khử = 𝑋×100×100 𝑚 = 0,9326×100×100 2,063 = 4532,6 (mg%) Định lượng amylose amylopectin a) Nguyên tắc: Dựa tạo phức màu xanh amylose với iod môi trường acid Sau đó, đem đo độ hấp thụ bước sóng 620 nm Do thành phần tinh bột chủ yếu amylose amylopectin (chiếm từ 96,1 đến 97%) nên tính hàm lượng amylopectin từ hàm lượng tinh bột hàm lượng amylose mẫu b) Tiến hành: - Xây dựng đường chuẩn với nồng độ khác amylose Pha dung dịch amylose gốc với nồng độ mg/ml dung dịch NaOH 1N Từ dung dịch gốc, pha dãy dung dịch có nồng độ từ – mg/ml Bố trí thí nghiệm sau: Ống nghiệm Nồng độ dung dịch amylose (mg/ml) Thể tích dung dịch amylose gốc (𝜇𝑙) Thể tích nước cất (𝜇𝑙) Thể tích dung dịch TCA 0,6% (ml) Thể tích dung dịch Iod 0,01(𝜇𝑙) 0 100 150 0,4 20 80 150 0,8 40 60 150 50 50 150 1,4 70 30 150 1,8 90 10 150 100 150 Lắc ống nghiệm, để yên 20 phút đo bước sóng 620 nm Vẽ đồ thị tương quan độ hấp thụ nồng độ amylose Xác định ẩm độ mẫu (bột gạo) Chuẩn bị mẫu: cân xác 15 mg mẫu bột gạo Thêm ml dung môi (etanol) để trích ly chất béo Đun cách thủy 60oC 30 phút Ly tâm 6000 vòng/phút 15 phút, lấy phần cặn lắng Lặp lại bước trích ly trích béo lần Phần cặn lắng thêm ml NaOH 1N ml nước Đun cách thủy 95oC 30 phút - Tiến hành đo: dùng micropipette hút 100 𝜇𝑙 dung dịch mẫu chuẩn bị cho vào ống nghiệm, thêm ml dung dịch TCA 0,6 % 150 𝜇𝑙 dung dịch Iod 0,01 N, lắc ống để yên 20 phút Đo bước sóng 620 nm c) Tính tốn kết quả: - - Hàm lượng amylose (%) = 𝑋×6×100 𝑚 Với: X: nồng độ amylose suy từ đồ thị chuẩn (mg/ml) m: khối lượng gạo (theo khơ) - Kết thực nghiệm: Phương trình đường chuẩn: y = 7,127x R2 = 0,9387 Nồng độ amylose đo 0,6175 (mg/ml) Vậy hàm lượng amylose = 𝑋×6×100 𝑚 = 0,6175×6×100 16,5 = 22,45 (%) Bài PROTEIN I Mục tiêu - Quan sát, ghi nhận, nhận xét giải thích tượng kết tủa protein - Định lượng protein phương pháp quang phổ II Thiết bị, dụng cụ, nguyên vật liệu, hóa chất Thiết bị Dụng cụ Hóa chất Nguyên vật liệu - Bếp cách thủy - Ống nghiệm - (NH4)2SO4 bão - Lòng trắng trứng - Máy đo quang hòa bán bão hòa phổ - H2SO4 đậm đặc - NaOH đậm đặc - Dung dịch acid sulfosalicylic 10% - Dung dịch NaCl 10% NaCl bão hòa - Dung dịch BSA III Kết tủa protein Kết tủa thuận nghịch Nguyên tắc: hòa tan protein phụ thuộc vào pH, dung môi nhiệt độ Khi thay đổi điều kiện này, độ hòa tan protein bị thay đổi, kết tủa thuận nghịch kết tủa bất thuận nghịch Kết tủa thuận nghịch: số tác nhân thêm vào dung dịch keo protein có khả kết tủa protein mà khơng hoạt tính loại bỏ tác nhân này, protein lại có khả hòa tan vào dung dịch tạo keo Hiện tượng gọi kết tủa thuận nghịch ứng dụng để chiết tách, thu nhận enzyme protein Kết tủa bất thuận nghịch: Nguyên tắc: kết tủa bất thuận nghịch protein thường liên quan đến biến tính Khi cấu trúc bậc 2, 3, bị phá vỡ vĩnh viễn, protein tính chất lý hóa chức sinh học Các yếu tố gây kết tủa bất thuận nghịch protein bao gồm acid hữu cơ, acid vô đậm đặc ( H2SO4, HCl, HNO3…), muối kim loại nặng, nhiệt độ… Tiến hành thí nghiệm: Chuẩn bị ống nghiệm sau:     Ống 1: ml albumin + ml NaCl 10% Ống 2: ml albumin + ml (NH4)2SO4 bão hòa Ống 3: ml albumin + ml (NH4)2SO4 bán bão hòa Ống 4: ml albumin + HCl 0,5 N (từng giọt đến có kết tủa ngưng) + (NaOH đến tủa tan) + CuSO4 (từng giọt)  Ống 5: ml albumin đun cách thủy  Ống 6: ml albumin + giọt sulfosalicylic Quan sát tượng giải thích: Hình Phản ứng kết tủa bất thuận nghịch protein  Ống 1: ban đầu thấy kết tủa tạo sau tủa tan ⟶ Giải thích: Vì NaCl chất điện ly mạnh tạo ion Na+ Cl+ trung hòa điện với phân tử protein tạo kết tủa Sau thời gian kết tủa tan dung dịch lòng trắng trứng lúc có chứa albumin globulin chưa tách  Ống ống 3: cho (NH4)2SO4 bán bão hòa (NH4)2SO4 bão hòa vào thấy dung dịch xuất kết tủa trắng ⟶ Giải thích: điều kiện thường, albumin tồn trạng thái lơ lững, bên bao lớp vỏ hydrate Khi cho (NH4)2SO4 vào dung dịch, (NH4)2SO4 phân ly tạo ion NH4+ SO42-, ion trung hòa tiểu phân tích điện phân tử albumin làm lớp vỏ hydrate trung hòa điện tích phân tử protein liên kết với nhau, tạo kết tủa Đo độ hấp thu ống nghiệm dung dịch chuẩn bước sóng 550 nm vẽ đường chuẩn Sau đo độ hấp thu dung dịch ống nghiệm mẫu dựa vào đường chuẩn để suy nồng độ protein mẫu - Tính kết Hàm lượng protein lòng trắng trứng tính theo cơng thức: X = (50 x C x 100)/m Với: X: hàm lượng protein lòng trắng trứng (mg/100g) C: nồng độ protein hiển thị máy (mg/ml) m: khối lượng lòng trắng trứng đem phân tích (g) – 500 𝜇𝑙  Kết sau đo: C = 6,238 (mg/ml) Khối lượng mẫu đem phân tích: 3,0647 g X= 50 × 𝐶 ×100 𝑚 = 50 ×6,238 ×100 3,0647 = 10177,2 (mg/100g) 11 Bài LIPID I Mục đích Giúp sinh viên nắm cách xác định số đánh giá chất lipid (chỉ số peroxide số acid) khảo sát đặc tính lecithin II Thiết bị, dụng cụ, hóa chất, nguyên vật liệu Thiết bị Bếp cách thủy Dụng cụ - Bình tam giác (250 ml) có nút nhám - Bình tam giác 100 ml - Buret - Pipet - Cốc thủy tinh 100 ml - Giấy lọc Hóa chất - Acid acetic đậm đặc - Cloroform - Dung dịch KI - Dung dịch N2S2O3 0,01N - Ancol tuyệt đối - Ether ethylic - Phenolphtalein - Dung dịch KOH 0,01N - Acetone Nguyên vật liệu - Dầu ăn - Lòng đỏ trứng III Nội dung Xác định số peroxyde Chỉ số peroxyde đặc trưng cho hóa chất béo Chỉ số peroxyde số gam iod giải phóng cho dung dịch iodua kali tác dụng với 100 g chất béo tác dụng peroxyde có chất béo a) Nguyên tắc: - Trong khơng khí điều kiện có oxi, acid béo đặc biệt acid béo không no dễ dàng bị oxy hóa tạo thành peroxyde, gây tượng hóa chất béo Để khảo sát mức độ hóa chất béo, cho iodua kali tác dụng với peroxyde giải phóng iod, sau chuẩn iod dung dịch thiosulfate natri - Phản ứng xảy mơi trường acid môi trường kiềm iod tạo thành tác dụng với kiềm 12 b) Tiến hành: - Cân 3g mẫu chất béo vào bình tam giác, thêm vào 20 ml acid acetic 10 ml cloroform, lắc cho tan hoàn tồn Sau thêm 5ml dung dịch KI bão hòa để yên 30 phút tối, tiếp tục thêm ml nước cất chuẩn lượng iod thoát Na2S2O3 0,01 N dung dịch có màu vàng, thêm vào ml dung dịch hồ tinh bột 1% chuẩn tiếp đến màu xanh (khi chuẩn cần lắc mạnh) - Tiến hành mẫu trắng với điều kiện giống c) Tính kết quả: Chỉ số peroxyde (Px) biểu thị số gam iod thoát từ 100 g chất béo 𝑃𝑥 = (𝑉1 − 𝑉2 ) × 𝑁 × 0,1269 × 100 𝐺 Trong đó: V1: Lượng dung dịch Na2S2O3 0,01 N dùng chuẩn độ mẫu chất béo (ml) V2: Lượng dung dịch Na2S2O3 0,01 N dùng để chuẩn độ mẫu trắng (ml) N : Nồng độ đương lượng dung dịch Na2S2O3 G : Trọng lượng mẫu phân tích (g) (=3,0055 g) Bảng Kết chuẩn độ dung dịch Na2S2O3 0,01 N Mẫu Mẫu chất béo Mẫu trắng Lượng dung dịch Na2S2O3 0,01 N dùng chuẩn độ (ml) 13,8 2,5 𝑃𝑥 = (13,8−2,5)×0,01×0,1269×100 3,0055 =0,477 Chỉ số acid Chỉ số acid số mg KOH cần thiết để trung hòa chất béo tự có g chất béo a) Nguyên tắc Cho KOH 0,1N trung hòa acid béo tự chất béo với thị màu phenolphthalein b) Tiến hành - Cho vào bình tam giác ml alcol tuyệt đối ml ether ethylic, cho thêm vài giọt phenolphthalein dùng KOH 0,01N trung hòa hỗn hợp đến xuất màu hồng nhạt 13 - Cho thêm vào hỗn hợp 1,0323g dầu ăn tiếp tục dùng KOH 0,01N trung hòa đến xuất màu hồng bền 30 giây Đọc thể tích KOH - Tiến hành mẫu trắng với điều kiện c) Tính kết quả: Chỉ số acid tính theo cơng thức sau 𝐶𝑎 = 𝑣 × 0,56 × 𝑘 𝑚 Trong đó: Ca: Chỉ số acid v : Số ml KOH chuẩn độ (ml) k : Hệ số điều chỉnh nồng độ dung dịch KOH 0,01 N (nếu có) m : Khối lượng mẫu phân tích (g) (=1,0323 g) 0,56 mg acid béo tương ứng với ml KOH 0,01 N Bảng Kết chuẩn độ dung dịch KOH 0,01 N Mẫu Mẫu chất béo Mẫu trắng Lượng dung dịch KOH 0,01 N dùng chuẩn độ (ml) 0,25 𝐶𝑎 = (1 − 0,25) × 0,56 × = 0,407 1,0323 Khảo sát đặc tính Lecithin a) Nguyên tắc Lecithin lipid có chứa gốc phosphate (phospholipid), thành phần có nhóm phân cực alcol amincholin nhóm có tính base mạnh Chiết tách Lecithin lòng đỏ trứng alcol khảo sát đặc tính lecithin nhóm alcol amincholin b) Tiến hành Cho ½ lòng trắng trứng đánh nhuyễn vào bình tam giác 100 ml, thêm 10 ml alcol tuyệt đối, khuấy đều, đun cách thủy 75 – 800C, tiếp tục khuấy 10 phút (là thời gian để rút tách lecithin) Trong trường hợp lượng alcol bị bốc hết thêm lượng alcol ban đầu Lọc hỗn hợp qua bình tam giác, cạn dịch lọc, cho phần cô cạn vào ống nghiệm lượng Sau cho vào ống nghiệm (1) ml acetone, ống nghiệm (2) ml nước cất Quan sát ghi nhận tượng 14 c) Hiện tượng - Ống 1: Lecithin không tan acetone - Ống 2: Lecithin tan nước cất tạo thành nhũ tương Hình Khảo xác đặc tính Lecithin d) Giải thích Lecithin diester acid phosphoric Một đầu acid phosphoric liên kết với glycerol, đầu lại liên kết với choline Trong Lecithin gồm phần, nhóm phân cực alcol amincholin nhóm có tính base mạnh gốc acid béo, glycerol kỵ nước (không phân cực) Trong thí nghiệm ta dùng dung mơi nước (phân cực mạnh) acetone (phân cực yếu có cấu trúc đối xứng) nên lecithin tan tốt nước tạo nhũ tương gần không tan acetone 15 Bài VITAMIN I Mục tiêu: - Định tính vitamin B1 phản ứng với thuốc thử diazo - Định lượng vitamin C II Thiết bị, dụng cụ, hóa chất, nguyên vật liệu: Dụng cụ Ống nghiệm Bình tam giác 100 ml Hóa chất Dung dịch natri nitric 5% Dung dịch acid sulfanilic 1% Dung dịch natri carbonate 10% Nguyên vật liệu Nước quýt Nước cam Vỏ cam Bình định mức 100 ml Cốc thủy tinh 50 ml Cốc thủy tinh 100 ml Burette 25 ml Pipet 10 ml Một số thiết bị thường dùng phòng thí nghiệm khác III Nội dung: Định lượng vitamin B1 phản ứng với thuốc thử diazo: a) Nguyên tắc: Trong môi trường kiềm thiamin phản ứng với thuốc thử diazo cho phức màu cam đỏ b) Tiến hành - Cho vào ống nghiệm 0,5 ml dung dịch vitamin B1 + 0,5 ml dung dịch acid sulfanilic 1% + 0,5 ml dung dịch natri nitric 5% + 10 giọt dung dịch natri carbonate 10% Lắc 16 Hình 1: Vitamin B1 phản ứng với thuốc thử diazo c) Kết thí nghiệm - Dung dịch ban đầu không màu, sau cho hóa chất vào, sau thời gian dung dịch chuyển sau màu đỏ Giải thích: Do thiamin phản ứng với thuốc thử diazo theo phản ứng sau:  Phản ứng tạo muối diazomin - Acid sufanilic phản ứng với -NO2- tạo muối diazomin (C6H4SHO3N2)  Sau muối diazomin tạo ra, phản ứng với vitamin B1 có dung dịch tạo dung dịch có màu đỏ Màu đỏ hợp chất phức tạp hình thành thiamin thuốc thử diazo Hình 2: Phản ứng tao Diazo Định lượng vitamin C a) Nguyên tắc - Vitamin C (acid ascorbic) phổ biến thể động vật thực vật, tham gia vào nhiều trình oxy hóa khử xảy thể người Trong phân tử ascorbic chứa nhóm endiol (-COH=COH-) có tính khử mạnh Acid ascorbic dễ bị oxy hóa thành acid dehydroascorbic, phản ứng có tính thuận nghịch Acid dehydroascorbic acid ascorbic chất hoạt động sinh học mạnh chống xuất huyết 17 - Dựa tính khử mạnh, nhiều phương pháp hóa học để định lượng acid ascorbic đề Tuy nhiên, cho kết xác thường áp dụng phòng thí nghiệm phương pháp cho acid ascorbic khử muối natri 2,6 dichlorophenol indophenol (màu xanh đen) đến không màu Thuốc thử 2,6 dichlorophenolindophenol dư môi trường acid có màu hồng - Xác định vitamin C dựa nguyên tắc: vitamin C chiết khỏi lương thực, thực phẩm, acid acetic acid chlohydric Các chất khử khác chất màu khác phải tách dung dịch chì acetate Sau chuẩn độ dịch chiết môi trường acid (pH = - 4) 2,6 dichlorophenol indophenol đến màu hồng b) Tiến hành Chuẩn bị mẫu thử: tất sản phẩm dạng lỏng bột phải trộn không lắc để tránh lên bọt khí Lượng cân sản phẩm lấy tùy thuộc vào hàm lượng vitamin C Khi hàm lượng lấy mẫu nhiều ngược lại - Với sản phẩm dạng lỏng Lấy lượng nước cam cho vào bình định mức 100 ml, thêm vào bình 20 ml dung dịch acid chlohydric 1% thêm acid oxalic đến vạch định mức lắc Nếu thấy có cặn lọc dung dịch Hút 10 ml dung dịch chuẩn độ thuốc thử 2,6 dichlorophenolindophenol xuất màu hồng nhạt - Với sản phẩm dạng rắn Cân 2,0019 g vỏ cam cho vào cối sứ, nghiền cẩn thận; cho thêm 20 ml HCl 1% vào ngập mẫu nghiền cẩn thận Sau chuyển tồn hỗn hợp vào bình định mức 100 ml Thêm vào ml chì acetate để loại bỏ protein giúp cho trình lọc dễ dàng thêm HCl 1% đến vạch định mức Để yên 10 phút, lắc cẩn thận lọc Dùng pipet hút vào bình tam giác cốc thủy tinh 10 ml dịch lọc có chứa vitamin C, chuẩn độ bằng 2,6 dichlorophenolindophenol 0,001 N xuất màu hồng nhạt Chuẩn độ mẫu đối chứng: cho ml acid oxalic 1% ml HCl 1%, chuẩn độ đến xuất màu hồng nhạt c) Tính tốn kết  Kết thí nghiệm: 18 Hình Dung dịch trước sau chuẩn độ - Với sản phẩm dạng lỏng: - Lần chuẩn độ Mẫu nước quýt (ml) 4,95 4,8 4,8 Trung bình 4,85 Lần chuẩn độ Mẫu nước cam (ml) 2,9 2,95 2,9 Trung bình 2,92 2,3 2,3 2,25 Trung bình 2,28 Với sản phẩm rắn: Lần chuẩn độ Vỏ cam (ml) - Chuẩn độ mẫu trắng: 0,25 ml  Hàm lượng vitamin C (mg %) X= (𝑎−𝑏)×𝑓×𝑉×100 𝑣×𝑚 Trong đó: a: số ml natri 2,6 dichlorophenol indophenol dùng định phân dịch chiết vitamin C b: số ml natri 2,6 dichlorophenol indophenol dùng định phân mẫu kiểm chứng (hỗn hợp thuốc thử dùng) f: số mg acid ascorbic ứng với ml dung dịch natri 2,6 dichlorophenol indophenol ( = 0,088) V: Tổng thể tích dịch chiết (= 100 ml) v: Thể tích mẫu đem chuẩn độ (= 10 ml) m: lượng mẫu cân ( = 2,0019 g)  Hàm lượng vitamin C mẫu nước quýt X= (4,85−0,25)×0,088×100×100 10×10 = 40,48 𝑚𝑔%  Hàm lượng vitamin C mẫu nước cam 19 X= (2,92−0,25)×0,088×100×100 10×10 = 23,50 𝑚𝑔%  Hàm lượng vitamin C mẫu rắn (vỏ cam) X= (2,28−0,25)×0,088×100×100 2,0019×10 = 89,24 𝑚𝑔% Bài ENZYME I Mục tiêu - Đo hoạt tính enzyme amylase - Khảo sát ảnh hưởng nồng độ chất lên tốc độ thủy phân enzyme - Khảo sát enzyme urease bột đậu nành II Thiết bị, dụng cụ, nguyên vật liệu, hóa chất Thiết bị Dụng cụ - Bếp đun cách - Ống nghiệm thủy - Bình tam giác - Pipet - Đũa thủy tinh Hóa chất - Hồ tinh bột 1% - Dung dịch đệm pH từ – - Dung dịch iod 1% - Dung dịch CuSO4 2% - Dung dịch NaOH N/20 - Aldehyde formic - Dung dịch urease - Phenolphtaein 1% alcol Nguyên vật liệu - Lúa nẩy mầm - Bột đậu nành III Xác định hoạt tính enzyme amylase Đo hoạt tính enzyme amylase a) Nguyên tắc Dựa sở thủy phân tinh bột enzyme amylase thành sản phẩm khả kết hợp tạo màu sản phẩm với iod Phức hệ amylase mầm lúa có khả thủy phân tinh bột thành sản phẩm là: Tinh bột (màu xanh với iod)  amylodextrin (màu tím với iod), Erythrodextrin 20 (màu đỏ với iod)  achrodextrin (không kết hợp với iod, khơng có màu)  maltodextrin (khơng kết hợp với iod)  Maltose glucose (không kết hợp với iod) Khi cho sản phẩm thủy phân kết hợp với iod, ta nhận biết thời gian kết thúc phản ứng b) Tiến hành - Ly trích amylase Trích ly từ Malt (hoặc lúa): Cân 5,0250 g lúa nẩy mầm nghiền nhỏ, cho vào bình tam giác dung dịch 250 ml, cho vào 50 ml nước cất 10 ml dung dịch đệm phosphate pH = 4,9 Giữ hỗn hợp nhiệt độ 30oC thời gian có khuấy định kỳ Lọc, rửa thu hồi dịch trích enzyme cho V = 100 ml Bảo quản dung dịch enzyme gốc – 4oC thời gian ngày Pha loãng enzyme gốc dung dịch đệm cho ml dung dịch enzyme phân tích enzyme đủ để thủy phân 20 – 30% tinh bột dung dịch điều kiện xác định - Xác định hoạt tính Chuẩn bị dung dịch thí nghiệm theo bảng sau: Bảng 1: Bố trí thí nghiệm đo hoat tính amylase Ống nghiệm Dung dịch cho vào Hồ tinh bột 1% (ml) Nước cất (ml) Dung dịch đệm pH = (ml) 1 1 1 0,4 0,6 0,8 1,2 1.4 1,6 2 2 2 2,6 2,4 2,2 1,6 1,4 1,8 Để ổn định 50oC (trong phút) Thể tích dung dịch enzyme 1,8 1,2 Thời gian kết thúc thủy phân (giây) Khi cho dung dịch enzyme vào ống nghiệm, dùng pipet khuấy nhẹ dung dịch lấy giọt để thử màu với iod Khi màu dung dịch iod không thay đổi thủy phân tinh bột kết thúc Tiến hành ống c) Kết thí nghiệm 21 Ống nghiệm Thể tích dung dịch enzyme (ml) Thời gian kết thúc thủy phân (giây) 2,6 36 2,4 43 2,2 47 62 1,8 73 1,6 1,4 76 107 1,2 122 Thời gian thủy phân (giây) 140 120 y = 344,04e-0,875x R² = 0,9828 100 80 60 40 20 0 0,5 1,5 2,5 Thể tích enzym (ml) Hình Đồ thị thể hoạt tính enzyme Amylase * Nhận xét: Thể tích enzyme lớn thời gian thủy phân ngắn Chọn thể tích ống nghiệm để tiến hành khảo sát ảnh hưởng nồng độ chất lên tốc độ thủy phân enzyme Khảo sát ảnh hưởng nồng độ chất lên tốc độ thủy phân enzyme a) Tiến hành Chuẩn bị dung dịch thí nghiệm theo bảng sau: Ống nghiệm Dung dịch cho vào Nồng độ dung dịch tương ứng (mg/ml) Hồ tinh bột 1% (ml) 0,4 0,6 0,8 1,2 1.4 1,6 Nước cất (ml) 1,6 1,4 1,2 0,8 0,6 0,4 Dung dịch đệm pH = (ml) 2 2 2 Để ổn định 50oC 22 Thể tích dung dịch enzyme (ml) 2 2 46 72 2 81 90 Thời gian kết thúc thủy phân (giây) b) Kết thí nghiệm Ống nghiệm Nồng độ dung dịch tương ứng (mg/ml) Thời gian kết thúc thủy phân (giây) 22 29 38 100 90 Thời gian thủy phân (giây) 80 70 y = 51,505ln(x) - 24,027 R² = 0,894 60 50 40 30 20 10 0 Nồng độ tinh bột (mg/ml) 10 Hình Biểu đồ thể tốc độ thủy phân enzyme * Nhận xét: Nồng độ chất cao thời gian thủy phân lâu Khảo sát enzyme urease bột đậu nành a) Nguyên tắc Urease enzyme thủy phân theo phản ứng (NH2)2CO + H2O  (NH4)2CO3 Nếu thêm formol vào mơi trường, có phản ứng tạo thành hexamethylene tetramine acid carbonic 2(NH4)2CO3 + HCHO  (CH2)6N4 + H2O + H2CO3 Định phân lượng acid tạo thành kiềm để xác định lượng urease bị thủy phân Từ xác định hoạt tính enzyme urease 23 b) Chuẩn bị formol trung tính: Cho vào bình cầu 15 ml nước 15 ml formol 40%, sau dùng NaOH trung hòa với thi phenolphthalein c) Tiến hành: Chuẩn bị ống nghiệm sau: Ống nghiệm Thể tích urease 2% (ml) 5 Thể tích enzyme urease (ml) Thể tích enzyme urease đun sôi (ml) Ủ ống nghiệm nước ấm 40oC tromg 20 phút Cho vào ống ml formol trung hòa, lắc vài phút Lần lượt cho dung dịch ống bình tam giác 100 ml, tráng ống nghiệm với nước cất Dùng NaOH N/20 định phân H2CO3 giải phóng với phenolphthalein làm thị màu d) Tính kết Hoạt tính enzyme urease biểu thị số mol urease bị thủy phân lượng enzyme có gram bột bột đậu nành thời gian phút 40oC, (𝑉1 − 𝑉2 ) × 𝐴 20 × 103 × × 𝑡 × 𝑎 × 𝑚 𝑚𝑜𝑙 𝑔 ( ) 𝑝ℎú𝑡 Với: V1: Thể tích NaOH N/20 dùng định phân ống (ml) V2: Thể tích NaOH N/20 dùng định phân ống (ml) a: Thể tích enzyme cho vào ống (ml) A: Tổng thể tích enzyme thu từ m gam bột đậu nành (ml) t: Thời gian thủy phân (phút) m: số gam bột đậu nành đem cân để khảo sát enzyme urease  Số liệu ghi nhận được: Số lần chuẩn độ Trung bình V1 3,4 3,5 3,45 V2 0,4 0,4 0,4 Thể tích NaOH (ml)  Tính tốn kết quả: 24 (𝑉1 −𝑉2 )×𝐴 20×103 ×2×𝑡×𝑎×𝑚 = 3,45−0,4)×100 = 2,54.10-5 (mol/g)/phút 20×10 ×2×20×5×3,0037 ( Vậy hoạt tính enzyme urease 2,54.10-5 (mol/g)/phút 25 ... bị, dụng cụ, nguyên vật liệu, hóa chất Thiết bị Dụng cụ Hóa chất Nguyên vật liệu - Bếp cách thủy - Ống nghiệm - (NH4)2SO4 bão - Lòng trắng trứng - Máy đo quang hòa bán bão hòa phổ - H2SO4 đậm đặc... đục xuất ống nghiệm ⟶ Giải thích: tác dụng Sulfosalicylic cấu trúc hóa học protein bị phá vỡ khiến protein tính chất hóa lý chức sinh học nên tạo kết tủa Định lượng protein theo phương pháp Biuret... (mg/100g) 11 Bài LIPID I Mục đích Giúp sinh viên nắm cách xác định số đánh giá chất lipid (chỉ số peroxide số acid) khảo sát đặc tính lecithin II Thiết bị, dụng cụ, hóa chất, nguyên vật liệu Thiết bị