Phương pháp cấy mô kỹ thuật nuôi trồng lan

Phương pháp cấy mô là phương pháp duy nhất hiện nay có thể nhân giống lan trên qui mô công nghiệp, các cây lan con đưược sản xuất hoàn toàn giống nhau từ một cây bố mẹ quí mới đưược lai tạo và được xem là co giá trị sau lần trồ hoa đầu tiên

Phương pháp cấy mô/Kỹ thuật nuôi trồng lan

Phương pháp cấy mô là phương pháp duy nhất hiện nay có thể nhân giống lan trên qui mô công nghiệp, các cây lan con đưược sản xuất hoàn toàn giống nhau từ một cây bố mẹ quí mới đưược lai tạo và được xem là co giá trị sau lần trồ hoa đầu tiên

Ngày nay phương pháp gieo hạt chỉ đưược áp dụng dể lai giống Các loại lan hiện tại đều có tính dị hợp tử cao vì thế chúng sẽ không bao giờ đồng nhất Đối với các loài này nhiều khi chỉ sừ dụng một cây tốt duy nhất từ hàng vạn cây gieo hạt Do đó chỉ có cấy mô là phương

pháp có hiệu quả để sản xuất loài lan này kinh doanh:

So với phương pháp tách chiết thông thường tốc độ phát triển 1 cây/năm thì phương pháp cấy mô sẽ sản xuất một số lượng cây con gần như không tưởng khoảng 4 triệu cây/năm

Phương pháp cấy mô có nhiều ưu điểm :

Đây là phương pháp nhân giống vô tính vì thế nó đảm bảo hoàn toàn đặc tính của cây cha mẹ

- Cây con không bị nhiễm bệnh

- Mầm để cấy lúc nào cũng có sẵn không mất thời gian chờ đợi trái chín như cây gieo hạt

Tuy nhiên, việc cấy mô phơi được thực hiện với một qui trình thật nghiêm túc và tỉ mỉ, điều kiện về trang thiết bị đầy đủ và mô chỉ phát triển trên một môi trường hoàn toàn nhân tạo và vô trùng

Điều kiện nuôi cấy :

Có nhiều môi trường khác nhau được dùng trên thế giới để nuôi cấy mô nhưư

Knudson 's C, yamada,Singapo, Kyoto, Heller, Vacin và Went, Murashige và Skoog, Knop Mỗi nhà vưườn trồng lan trên thế giới đều dùng các môi trường khác nhau với kinh nghiệm riêng

Theo Merel (1960), môi trường Knudson/)s C dùng rất tốt để cấy cho hầu hết các loài lan, tuy nhiên cũng có thể thay đổi thành phần chút ít nhưư giảm nitrat canxi xuống 500mg mỗi lít và thêm 500mg sunfat môn, hay nitrat môn thêm vào 250mg KCL mỗi lít rất cần thiết cho sự tăng trưường cơ quan

Nhiều tác giả khác dùng các môi trưường Vacin và Went, Mu rashige và Skoog, Heller cấy mô rất tốt cho các loài thuộc nhóm đơn thân

Việc sử dụng các chất điều hòa sinh trưởng, như ANA với nồng độ phần triệu (ppm), hoặc 2,4D 1 - 2 ppm rất phổ biến ở nhiều tác giả khác nhau Bà Lê Tuệ Quang (1981)

khuyên nên giảm nồng độ các chất điều hòa sinh trưưởng trong những lần cấy chuyền Các chất chiết trái cây cũng đưược đề nghị như nưước cốt cà chua, nước chuối, nước khoai tây nhưng chúng chỉ có hiệu quả trong các lần cấy chuyền hơn là lần cấy đầu tiên, và thể tích cũng

không quá 10% môi trưường cấy

Xaccaroz gây ra sự kích thích mô cấy đối với một số loài lan, và ngược lại cũng gây ra

sự ức chế đối với một số loài khác Citokinin có hiệu quả gây sự mọc chồi với đa số loài

và với nhiều bộ phận của cây lan Nhưng những loài hoặc những bộ phận của cây không chịu ảnh hưởng của citokinin, chúng được thay thế bằng axit tranh-cinnamic

Nhiệt độ lý tưởng cho việc nuôi cấy là 220 C+ 1 cho đa số các loài đa thân và 26 0C +

3 cho đa số các loài đơn thân ánh sáng nhân tạo được cung cấp bởi 2 loại đèn huỳnh quang và đèn nóng sáng ánh sáng phải đưược sử dụng liên tục với quang kỳ 16 giờ,

18 giờ hoặc 24 giờ tùy loài và cường độ cũng thay đổi từ 1.000 đến 2.000ml/ m2 khi cây bắt đầu lớn, cường độ ánh sáng có thể tăng lên đến 18.OO0ml/m2 và quang kỳ giảm xuống

Các đèn phải đặc cách môi trường cấy 0,4 - O,5m

+ Cách thử PH môi trưường cấy :

Độ PH của môi trường thích hợp cho mô phát triển, trong khoảng 4,8 - 5,5, thông thường biên độ ph trong khoảng 5 - 5,2 là tốt nhất ph của môi trường có thể thử bằng các chất chỉ thị màu nhưư:

- Bromo cresol green (Tetrabromo-in-cresol-sun- fonphtalein) v ới liều lưượng O,10g trong 7,15ml dung dịch hidroxit natri (NAOH) N/50 pha loãng n ưước tới 250ml, có màu xanh khi dung dịch trung tính, vàng cam khi ph=5,4 Ở thời điểm này nhỏ 1 - 2 giọt axitphôtphoric đậm đặc để giảm độ ph, và ph = 5,2 không nên để ph môi trường xuống quá thấp dưưới 4,8, nếu có trường hợp này xảy ra ta tăng thêm dung dịch

hydroxit potat để tăng độ ph

Hidroxit natri sunfonat alizirin (1g/1.OOOml nước) : có màu tím chuyển sang màu vàng khi ph=5,2 Cong red tetrazodi - phenilaptionat natri (lg/1.OOOml nưước) : có màu xanh ở ph=5,2

Máy lắc :

Các kết quả về cấy mô cho biết rằng, môi trường lỏng được xáo trộn trên máy lắc có hiệu quả hơn môi trường đặc Tốc độ quay của máy lắc thay đổi tùy theo loài lan và giai đoạn cấy Trong giai đoạn đầu, nhờ bộ phận biến trở, ta điều chỉnh máy lắc với tốc

dộ 1/4 - 1/5 vòng/phút, tốc độ này nhằm mục đích làm cho môi trường dinh dưỡng hòa đều, sau đó tốc độ tăng dần 100 vòng/phút phổ biến cho các loài, 160 vòng/phút cho Cattleya và Dendrobium 200 - 230 vòng/phút cho Cymdium

Thời gian của mô quay trên máy lắc có thể thay đổi tùy loài lan, thưường từ 3 - 4 tuần

Việc sử dụng máy lắc có những lợi điểm sau đây :

- Tăng tối đa việc phát triển của mô qua việc loại trừ hiện tượng phân cực của nó Ngăn chặn các ức chế do mô tiết ra bằng cách hòa tan các chất này

- Giúp môi trường thoáng khí, qua đó sẽ hô hấp, tổng hợp protein hấp thụ muối

khoáng của tế bào

- Môi trường lỏng sẽ gia tăng bề mặt tiếp xúc của mô đối với các chất dinh dưỡng

Tuy nhiên môi trường lỏng chỉ giúp mô cấy hình thành protocorn, muốn phát triển thành cây hoàn chỉnh phải chuyển sang môi trưường đặc

+ Các cách khử trùng :

Môi trường cấy và nước cất phải được tiệt trùng ở nồi hấp ở áp suất 15 PSI trong 10 -

30 phút

- Các dụng cụ dùng cho cấy mô sau khi tiệt trùng ở nồi hấp; đều phải đưược tiệt trùng sau mỗi lần dùng đến bằng cách nhúng cồn 900 rồi hơ trên ngọn lửa, hoặc nhúng vào dung dịch Clorox 10%, rồi nhúng vào nước cất khử trùng

Tủ cấy đưược khử trùng bằng đèn cực tím

- Phòng nuôi mô đưược khử trùng bằng fomon

- Chồi cấy mới cắt khỏi giả hành chưa đưược bóc vảy khử trùng trong dung dịch Clorox 10% trong 5 phút, sau khi cắt hết lá khử trùng trong dung dịch Clorox 5% trong 5 phút, và cuối cùng cắt thành mô cấy đưược khử trùng lần cuối cùng trong Clorox 1% trong 3 phút Cũng

có thể dùng xà phòng rửa bề mặt chồi cấy, sau đó bóc vảy và khừ trùng trong

Hipoclorit canxi 7% trong 15 phút Nhiều người khuyên HgCl2 rất độc cho mô cấy, nên ít đưược dùng, thực tế có thể dùng HgCl2 với nồng độ 0,1% trong 7 phút rất phải lọc cho mỗi lần dùng và có

thể pha chế sẵn để dùng cho những lần kế tiếp

+ Vật liệu cấy :

Nhờ tiến bộ về khoa học, ngày nay trên thế giới người ta có thể cấy nhiều bộ phận khác nhau của cây lan để hình thành các thể giống protocorm (protocorm li ke bodies) viết tắt là plbs, nhưưng thể tích của mô cấy chỉ biến đổi từ 1 - 3mm2 Mô cấy có thể là :

+Phân sinh mô đỉnh và phân sinh mô bên (apicamerisrtem and laterat meristem) : Morel 1960, 1965a, 1965b, 1971 Wimber 1963 Sagawa, Shoji và Shoji, 1966, 1967 Seully và Mohr 1967 M Vajrabhava và T Vajrahhaya, 1970

+Cộng hoa (Stalk) :

- Rotor, 1949

Savawa, Niimoto 1960

Sagawa, 1961

- Seully, 1965

- Wrata và Iwanaya 1965

- Singh và Sagawa 1972

Intuwong, Kunisaki, Sagawa 1972

+Đáy lá (leaf ba se) :

Champagnat, Morel Mounetou 1970

+Đỉnh lá (leaf tip) :

- Arditti, Ball, Chu~chill 1971, 1972, 1973, 1974

Đỉnh tưược (Shoott tip) :

- Kunisaki, Kim, Sagawa 1972

- Teo, Kunisaki, Sagawa 1973

- Intuwong, Sagawa 1974

+Hoa tự (Inflorescellce) :

- Intuwong, Sagawa 1973

+Nốt (No de) :

- Mosich, Ball, Arditti 197.4

Căn cứ vào kết quả đạt đưược, chúng tôi tạm sấp xếp lan làm 5 nhóm khác nhau, theo điều kiện cấy mô phân sinh từ dễ đến khó

- Nhóm thứ nhất, dễ : gồm các loài thuộc giống Cylllbidium, Pllaius, Miltonia,

Ollcidium

- Nhóm thứ hai, trung bình : gồm các loài thuộc giống Cattleya, Den.drobium

- Nhóm thứ ba khó : gồm các loài thuộc giống đơn thân nhưư Rllyn.chostylis, Vanda, Pllalaenopsis

- Nhóm thứ tưư, khó : gồm các bộ phận khác ngoài mô phân sinh của đỉnh (ngọn) và

mô phân sinh bên

- Nhóm thứ năm, rất khó : gồm các giống thuộc bộ Diandrae

Phương pháp cấy mô từ mô phân sinh ngọn, là phương pháp đầu tiên áp dụng cho cây lan Cylllbidium bởi Morel 1960, nay rất phổ biến Phôi của cây lan phát triển trong tình trạng rất đặc biệt, nó gồm một tế bào nhỏ không có sự chuyên biệt hay phân cực

gì cả Đang trong lúc nãy mầm, phôi này tạo ra một khối căn nhỏ màu lục và sinh ra rễ giả (rhizoid) Rồi ở trên đỉnh hơi hạ thấp xuống, là nơi mà mô phân sinh đưược tổ chức, trước hết nó sinh ra một lá thô, rồi 2 hoặc 3 lá lớn hơn, chồi được hình thành và chỉ lúc đó rễ đầu tiên mới xuất hiện dưưới gốc chồi này

Mô phân sinh ngọn của nhiều loài lan khi đưược phân lập vô trùng và nuôi cấy trong ống nghiệm nó sinh ra các thể giống protoeorm (viết tắt là Plbs), về hình thái tương tự nhưư protocorm tạo ra bởi phôi, và cuối cùng cũng tái sinh ra một cây bình thường và hoàn bị nhưư

vậy Khi đã có Plbs rồi, ngưười ta cất thành từ 3 - 6 phần, mỗi phần sẽ khỏi sự đâm chồi và chưưa đầy một tháng sẽ sản xuất đến 12 plbs mới, tiến trình này có thể tiếp tục mãi, vì thế mỗi tháng có thể nhận được 4 lần con số cây đó và chỉ sau một năm sẽ có đến 4 triệu cây con từ một chồi duy nhất Khi người ta ngừng cắt, mỗi mầm sẽ tái sinh một cây lan mới Riêng các loài thuộc giống Vanda, plbs không cần cắt, qua quá trình lắc, các tế bào bị vàng ra và hình thành các plbs mới Một số loài khác chỉ cấy chuyền giới hạn trong một số lần nhất

định, nếu không các plbs bị hiện tượng clorotic

Cây gieo hạt thường đưược trồng trong điều kiện vô trùng, do đó việc cấy phân sinh

mô đỉnh của chúng sẽ thực hiện dễ dàng hơn cây lớn ngoài thiên nhiên Tuy nhiên phương pháp này không nên áp dụng vì cây cấy mô gieo hạt chưa trổ hoa, sẽ không cho ta biết chắc phần đặc tính của hoa và cây sẽ có, nhất là các loài lan lai mang đặc tính dị hợp tử cao, phương pháp nhân giống vô tính từ một cây hữu tính, chưa biết đặc tính, thì các loại hoa sẽ có trong tương lai đều mang tính chất may rủi