Chế tạo và đánh giá hiệu quả hình thành phức hợp oxytocin PEG để làm thuốc bằng các phương pháp hóa sinh
Contents ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ PROTEIN .2 1.2 OXYTOCIN 1.2.1 Đặc điểm cấu tạo Oxytocin [5] 1.2.2 Tính chất hóa lý Oxytocin [5], [6] .5 1.2.3 Sự tổng hợp Oxytocin thể người 1.2.4 Tác dụng dược lý oxytocin 1.3 PHƯƠNG PHÁP TĂNG ĐỘ BỀN OXYTOCIN 1.3.1 Tạo chất có cấu trúc tương tự với Oxytocin: carbetocin desamino-oxytocin 1.3.2 Kỹ thuật liên kết vào cầu nối disulfide oxytocin 1.3.3 Tạo hệ đệm chứa ion kim loại .9 1.3.4 Bột khô công thức .10 1.3.5 1.4 Các phương pháp liên hợp với Oxytocin 10 PHƯƠNG PHÁP PEGYL HÓA .10 1.4.1 Polyethylen glycol 11 1.4.2 Đại cương phương pháp pegyl hóa protein dược dụng 11 1.4.3 Pegyl hóa Oxytocin 14 1.5 CÁC NGHIÊN CỨU PEGYL HÓA CÁC PROTEIN VÀ OXYTOCIN .18 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM 20 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ 20 2.1.1 Nguyên vật liệu 20 2.1.2 Dụng cụ máy móc 21 2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 21 2.3 PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM 22 2.3.1 Tiến hành gắn PEG vào phân tử Oxytocin 22 2.3.2 Xác định có mặt hợp chất liên hợp Oxytocin-PEG phương pháp điện di 23 2.3.3 Sử dụng phương pháp sắc ký lọc gel để sơ đánh giá hiệu hình thành tinh chế hợp chất liên hợp Oxytocin-PEG 24 2.3.4 Phương pháp định lượng Oxytocin hợp chất liên hợp 26 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 28 3.1 LIÊN HỢP mPEG aldehyd VỚI OXYTOCIN VÀ ĐÁNH GIÁ TỶ LỆ HÌNH THÀNH HỢP CHẤT LIÊN HỢP 28 3.1.1 Tổng hợp Oxytocin-PEG 28 3.1.2 Kết điện di 28 3.1.3 Xây dựng phương trình tương quan logarit khối lượng phân tử protein thể tích rửa giải (Ve) sắc ký lọc gel 29 3.1.4 Xác định khối lượng phân tử hợp chất liên hợp phản ứng Pegyl hóa sắc ký lọc gel 33 3.1.5 Xác định hàm lượng Oxytocin-PEG mẫu phản ứng hai pH sau sắc ký lọc gel 35 3.2 Đánh giá ảnh hưởng lượng mPEG aldehyd tham gia phản ứng tới tỷ lệ hợp chất Oxytocin-PEG dung dịch sau sắc ký lọc gel 36 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 39 4.1.Về điều kiện phản ứng Pegyl hóa Oxytocin 39 4.2 Xác định khối lượng protein sau phản ứng liên hợp 39 4.3 Về đánh giá lượng Oxytocin-PEG dung dịch sau sắc ký lọc gel 40 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .42 KIẾN NGHỊ 43 ĐẶT VẤN ĐỀ Oxytocin hormone nonapeptide cyclic (Cys-Tyr-Ile-GLN-Asn-Cys-Pro-Leu-GlyNH ) tiết từ thùy sau tuyến yên gây co thắt tử cung Ngày nay, người ta tổng hợp để làm thuốc phổ biến sử dụng sản khoa Trên lâm sàng, oxytocin thuốc lựa chọn để định để khởi phát chuyển ngăn ngừa xuất huyết tử cung Tuy nhiên, Oxytocin không bền yếu tố ảnh hưởng trình từ sinh tổng hợp đến sử dụng làm giảm tác dụng điều trị thuốc Oxytocin dễ bị tiêu hủy enzym đường tiêu hóa, phải bào chế dạng thuốc tiêm dạng xịt mũi Một vấn đề lớn sử dụng chế phẩm dạng lỏng chứa Oxytocin ổn định bảo quản Đặc biệt phổ biến nước phát triển, ví dụ Châu Phi, Châu Á Mỹ Latinh, nơi khí hậu nhiệt đới thường có nhiệt độ ban ngày vượt 40 ° C nhiệt độ cao, Oxytocin hoạt tính sinh học Do lợi ích việc giảm tử vong mẹ liên quan đến băng huyết sau sinh, nhiều nhà khoa học giới nỗ lực để phát triển ổn định công thức oxytocin Để khắc phục nhược điểm , nhà khoa học tìm giải pháp cho vấn đề bảo vệ cấu trúc oxytocin Một số kỹ thuật pegyl hóa: gắn polyethylen glycol (PEG) vào phân tử protein Pegyl hóa mang lại nhiều ưu điểm cho Oxytocin như: làm tăng độ ổn định, tăng cường tác dụng điều trị, giảm tính sinh miễn dịch thuốc protein thể Hiện nay, kỹ thuật pegyl hóa thật chứng minh tính ưu việt nó, thể số lượng chế phẩm protein dược dụng gắn PEG không ngừng tăng thị trường dược phẩm Nhằm mục đích bào chế dạng đường uống tăng cường độ bền phân tử trình bào chế đền bảo quản, đồng thời triển khai kỹ thuật Pegyl hóa vào việc cải biến số protein dược dụng Việt Nam , tiến hành đề tài “ Chế tạo đánh giá hiệu hình thành phức hợp Oxytocin-PEG để làm thuốc phương pháp hóa sinh” với mục tiêu sau: Gắn kết Oxytocin với polyehthylen glycol tạo phực hợp Oxytocin-PEG Xác định hiệu hình thành phức hợp Oxytocin-PEG CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ PROTEIN Khái niệm Protein đại phân tử cấu tạo theo nguyên tắc đa phân mà đơn phân axít amin Chúng kết hợp với thành mạch dài nhờ liên kết peptide (gọi chuỗi polypeptide) Các chuỗi xoắn cuộn gấp theo nhiều cách để tạo thành bậc cấu trúc không gian khác protein.(1) (2)(3) Các bậc cấu trúc protein Người ta phân biệt bậc cấu trúc protein.1,2,3 Cấu trúc bậc một: Cấu trúc bậc protein thực chất trình tự xếp axit amin chuỗi polypeptide Cấu trúc bậc protein có vai trò tối quan trọng trình tự axit amin chuỗi polypeptide thể tương tác phần chuỗi polypeptide, từ tạo nên hình dạng lập thể protein định tính chất vai trò protein Sự sai lệch trình tự xếp axit amin dẫn đến biến đổi cấu trúc tính chất protein.1,2,3 Cấu trúc bậc hai: xếp đặn chuỗi polypeptide không gian Chuỗi polypeptide thường không dạng thẳng mà xoắn lại tạo nên cấu trúc xoắn α cấu trúc nếp gấp β, cố định liên kết hyđro axit amin gần Các protein sợi keratin, Collagen (có lơng, tóc, móng, sừng)gồm nhiều xoắn α, protein cầu có nhiều nếp gấp β hơn.1,2 Cấu trúc bậc ba: cấu dạng chiều tồn chuỗi polypeptid Chỉ mối tương tác khơng gian gốc acid amin xa mạch polypeptid, dạng cuộn lại không gian toàn mạch polypeptid Cấu trúc ổn định nhờ tương tác yếu: lực Van der Walls, liên kết tĩnh điện, liên kết hydro mạch bên acid amin, đặc biệt tương tác kỵ nước nhóm acid amin khơng phân cực trung tâm protein Mỗi protein cầu có cấu trúc bậc III khác tương ứng với chức sinh học riêng biểu tỷ lệ phần trăm cấu dạng α β 1,2 Cấu trúc bậc bốn: mối quan hệ không gian nhiều chuỗi polypeptid kết hợp chặt chẽ với [1] Mỗi chuỗi gọi “tiểu đơn vị” Chúng gắn với nhờ liên kết hydro, lực Van der Walls nhóm phân bố bề mặt chuỗi polypeptid [2] Ví dụ: hemoglobin… Phân tử protein cấu trúc bậc IV phân ly thuận nghịch thành tiểu đơn vị Khi phân ly hoạt tính sinh học bị thay đổi Phân loại protein theo chức sinh học Loại protein Chức Protein cấu Cấu trúc, nâng đỡ trúc Protein Enzyme Ví dụ Collagen Elastin tạo nên cấu trúc sợi bền mô liên kết, dây chẳng, gân Keratin tạo nên cấu trúc da, lơng, móng Protein tơ nhện, tơ tằm tạo nên độ bền vững tơ nhện, vỏ kén Xúc tác sinh học: Các Enzyme thủy phân dày phân giải thức ăn, tăng nhanh, chọn lọc Enzyme Amylase nước bọt phân giải tinh bột chín, Protein Hormone phản ứng sinh hóa Enzyme Pepsin phân giải Protein, Enzyme Lipase phân giải Lipid Điều hòa hoạt động sinh lý Hormone Insulin Glucagon tế bào đảo tụy thuộc tuyến tụy tiết có tác dụng điều hòa hàm lượng đường Glucose máu động vật có xương sống Huyết sắc tố Hemoglobin có chứa hồng cầu động vật Protein vận Vận chuyển chất có xương sống có vai trò vận chuyển Oxy từ phổi theo máu chuyển nuôi tế bào Tham gia vào chức Protein vận vận động động tế bào thể Protein thụ quan Protein dự trữ Actinin, Myosin có vai trò vận động Tubulin có vai trò vận động lơng, roi sinh vật đơn bào Cảm nhận, đáp ứng kích thích môi trường Thụ quan màng tế bào thần kinh khác tiết (chất trung gian thần kinh) truyền tín hiệu Dự trữ chất dinh dưỡng Albumin lòng trắng trứng nguồn cung cấp axit amin cho phôi phát triển Casein sữa mẹ nguồn cung cấp Acid Amin cho Trong hạt có chứa nguồn protein dự trữ cần cho hạt nảy mầm Bảng 1.1: Phân loại protein theo chức Một số tính chất hóa lý protein - Sự biến tính protein Dưới tác dụng tác nhân vật lý tia cực tím, sóng siêu âm, khuấy học hay tác nhân hóa học axit, kiềm mạnh, muối kim loại nặng, gây phá hủy hoàn toàn cấu trúc không gian (các liên kết bên phân tử trừ liên kết peptid) làm giảm hay tính chất ban đầu protein (tính chất lý hóa, độ tan tính chất sinh học) Đó tượng biến tính protein Ví dụ: Albumin trứng bị đơng vón nhiệt độ cao khơng thể hòa tan trở lại làm lạnh [1] Trong điều kiện định, protein bị biến tính trở trạng thái ban đầu tùy theo mức độ Hiện tượng gọi biến tính thuận nghịch [1] - Tính lưỡng tính: Trong phân tử protein chứa gốc aa acid (Glu, Asp) mang điện âm gốc aa kiềm (Lys, Arg, His) mang điện dương Điện tích protein phụ thuộc vào pH mơi trường Ở pH mà tổng điện tích âm điện tích dương khơng ,gọi pI (điểm đẳng điện) protein trung hòa điện ,dễ dàng kết tụ vào không di chuyển điện trường Mỗi protein có pI đặc trưng nên tách riêng protein khỏi hỗn hợp điện di huyết [2] - Tính chất hòa tan kết tủa: Protein có khả hòa tan dung dịch muối loãng.Protein dạng sợi tan dung dịch muối đậm đặc.Albumin tan nước Khi hòa tan, protein tạo thành dung dịch keo protein có lớp áo nước bao quanh protein mang điện tích dấu nên đẩy Khi làm yếu tố hòa tan trên, protein tích tụ lại gây tủa [4] Một số phản ứng hóa học protein 1.2 OXYTOCIN 1.2.1 Đặc điểm cấu tạo Oxytocin [5] Oxytocin peptid gồm aminoacid (một nonapeptide ) chuỗi cysteine- tyrosine-isoleucine-glutamine-asparagine-cysteine-proline-leucine-glycine-amit , có cầu nối disulfide nối phân tử cysteine có cơng thức phân tử C43H66N12O12S2, khối lượng phân tử 1007,193 Da Hình 1.2.1 Cơng trúc khơng gian oxytocin Với cấu trúc protein bậc I, phân tử Oxytocin có chứa liên kết peptid acid amin cầu nối disulfur phân tử Giữa phân tử liên kết với liên kết hydro hay liên kết ion Cách xếp acid amin chuỗi polypeptid định cấu trúc khơng gian tính chất sinh học Oxytocin Một số vị trí cấu trúc Oxytocin dễ bị suy thoái acid amin Cys1, Gln4, Asn5 Gly9 dễ bị oxy hóa, thủy phân mơi trường acid, nhiệt độ ánh sáng thông qua hình thành chất trung gian.Do acid amin có chứa N bậc dễ tham gia phản ứng hóa học thủy phân mơi trường phân ly điều kiện khơng phù hợp [1], [2] Ngồi ra, liên kết disulfid Cys1-Cys6 vị trí hay gây suy thối, đa số q trình suy thối cấu trúc xảy sau loại bỏ liên kết cacbon β Cys 1, tạo enamin N cysteine persulfid Tạo điều kiện cho hình thành trisulfid tetrasulfid Oxytocin thúc đẩy hình thành dimer Oxytocin sản phẩm khác [5] Hình 1.2.1 Sự hình thành disulfid từ Oxytocin - 1.2.2 Tính chất hóa lý Oxytocin [5], [6] Oxytocin bột vơ định hình trắng gần trắng Dễ hút ẩm, dễ tan nước, acid acetic, butanol ethanol Khi nung nóng để phân huỷ, phát độc sulfur oxid nitric oxid Điểm đẳng điện oxytocin pI = 5,51 Để định tính định lượng Oxytocin dùng phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao với detector UV 280 nm Thêm số phản ứng màu protein vào 1.2.3 Sự tổng hợp Oxytocin thể người Các oxytocin peptide tổng hợp từ protein tiền chất ‘precursor protein ’ không - hoạt động từ gen oxytocin [7] [8] [9] Protein tiền chất bao gồm protein vận chuyển oxytocin neurophysin I [10] Protein tiền chất không hoạt động thủy phân dần thành mảnh nhỏ (một số neurophysin I) thơng qua loạt enzyme Sự thủy phân cuối giải phóng oxytocin nonapeptide hoạt tính xúc tác peptidylglyxin alphaamidating monooxygenase[11] Ở vùng đồi, oxytocin tạo thành tế bào thần kinh trung lưu trữ thân Herring đầu cuối sợi trục tuyến yên sau Sau đưa vào máu từ thùy sau tuyến yên Bên não, tế bào chứa oxytocin tìm thấy số mô bao gồm nữ giới thể vàng [12] [13] thai [14]; nam giới tế bào kẽ hạch Leydig [15]; hai giới tính võng mạc, [16] tuyến thượng thận, [17] tuyến ức (18) tuyến tụy [19] 1.2.4 Tác dụng dược lý oxytocin - Trên tử cung: làm tăng co bóp trơn tử cung theo nhịp, tần số biên độ co bóp sinh lý Tính cảm thụ trơn tử cung với Oxytocin tăng dần suốt thời kỳ có thai, phụ thuộc nhiều vào có mặt Estrogen [20] Receptor Oxytocin tử cung người xác định Khi gắn với Oxytocin, receptor hoạt hóa phospholipase C làm giải phóng Ca++ nội bào đồng thời gây khử cực kênh Ca ++ nhạy cảm với điện thế, làm tăng nhập Ca ++ vào tế bào Do đó, Oxytocin thể tác dụng đơi điều hòa co bóp tế bào tử cung kích thích tế bào nội mạc, tế bào màng rụng sản xuất prostaglandin [21] Khi oxytocin sử dụng với liều mức, kích thích mức tử cung, với co cứng kéo dài, dẫn đến vỡ tử cung, sẹo cổ tử cung rò rỉ âm đạo, xuất huyết sau sanh, lưu lượng máu tử cung bị suy giảm, thuyên tắc nước ối, chấn thương bào thai bao gồm xuất huyết nội sọ,các rối loạn nhịp tim khác, tổn thương thần kinh trung ương tổn thương não, tử vong ngạt Sự co lại tử cung: Điều quan trọng giãn nở cổ tử cung trước sinh, oxytocin gây co thắt giai đoạn thứ hai thứ ba chuyển Việc phóng thích Oxytocin thời gian cho bú gây co thắt nhẹ thường đau vài tuần đầu chu kỳ sữa Điều giúp phục hồi tử cung với tác dụng làm cầm máu sau đẻ [22] - Ở bà mẹ cho bú sữa mẹ, oxytocin hoạt động tuyến vú, Oxytocin gây co giật tế bào niêm mạc bao quanh tuyến dẫn sữa vú Điều ép sữa từ kênh xoang lớn hơn, tạo điều kiện cho việc đẩy sữa Với chuyển tiếp từ vùng đồi qua thần kinh cột sống đến tuyến vú làm tăng xuất sữa trẻ sơ sinh bú Sự kích thích gây nơron tạo Oxytocin từ đầu cuối sợi thần kinh thần kinh tuyến yên [23] - Do tương tự vasopressin, làm giảm tiết nước tiểu chút Ở số loài, oxytocin kích thích tiết natri từ thận Ở người, liều cao dẫn đến nồng độ natri thấp (hạ natri máu) - Trên hệ tim mạch: Ở mức liều gây co bóp tử cung chưa đủ ảnh hưởng đến huyết áp Ở mức liều cao gây giãn mạch rõ ràng tạm thời làm hạ huyết áp, tăng nhịp tim phản xạ nóng mặt Oxytocin thụ thể tìm thấy tim số loài gặm nhấm, hormon đóng vai trò quan trọng phát triển phôi tim cách thúc đẩy khác biệt tế bào tim [24], [25] Tuy nhiên, vắng mặt Oxytocin thụ thể chuột nhắt khơng gây tình trạng thiếu máu tim[26] - Chuẩn bị nơ-ron bào thai sinh nở: Chuyển qua thai, oxytocin người mẹ đến não bào thai kích hoạt chuyển đổi hoạt động chất dẫn truyền thần kinh GABA từ kích thích đến ức chế nơ-ron vỏ não thai nhi Điều làm êm dịu não thai nhi thời gian sinh giảm khả bị tổn thương hypoxic [27] - Điều chỉnh hoạt động tuyến thượng thận - tuyến yên - thận: Oxytocin gián tiếp ức chế giải phóng hormon adrenocorticotropic cortisol, trường hợp coi chất đối kháng vasopressin [28] 1.3 PHƯƠNG PHÁP TĂNG ĐỘ BỀN OXYTOCIN 1.3.1 Tạo chất có cấu trúc tương tự với Oxytocin: carbetocin desamino-oxytocin Các chất đánh giá liên quan đến việc trì hoạt động tử cung tăng cường độ ổn định [29], [30] Các nhà khoa học tìm hai chất phổ biến desamino-oxytocin carbetocin Cả hai có lực mộ thụ thể với Oxytocin gây co thắt chế Đặc biệt thời gian bán thải máu hai chất cao nhiều so với Oxytocin thay đổi cấu trúc [31] Desamino-oxytocin carbetocin khác với Oxytocin cấu trúc thiếu nhóm amino tự cuối Phân tử carbetocin thay số sulfur cầu disulfide nhóm CH2 Hình : Cấu trúc Desamino-oxytocin Carbetocin Cả hai chất tương tự oxytocin có thời gian bán hủy kéo dài với trì số hoạt động co bóp tử cung cho thấy nhóm amino oxytocin khơng cần thiết cho hoạt động sinh học Đối với carbetocin, tăng thời gian bán thải 4- 10 lần so với oxytocin, nên dùng lần tiêm thay truyền kéo dài Carbetocin chấp thuận sử dụng cho y tế thú y nhiều quốc gia khác [32] 1.3.2 Kỹ thuật liên kết vào cầu nối disulfide oxytocin Vì vị trí thối hố peptide liên kết disulfid nên nghiên cứu tạo chất tương tự oxytocin khác cách thay phần liên kết với nguyên tử khác Nhằm mục đích để tránh loại bỏ liên kết cacbon β Cys liên kết disulfid Cys1-Cys6 khơng phải vị trí liên quan trực tiếp đến thụ thể tác dụng sinh học oxytocin [33] Điều đánh giá vào năm 1960 1970, để xác định hoạt tính có trì hai hai thiol liên kết disulfide thay đổi sang thành nhóm CH2 carbetocin Người ta thấy tác dụng sinh học quan sát, ức chế vừa phải, thay đổi kích cỡ vòng peptide Điều cho thấy cầu nối disulfide điều kiện tiên cho việc trì hoạt động sinh học [34], [35] Các nghiên cứu gần Alewood đồng nghiệp tập trung vào việc thay disulfide cầu thioether, selenylsulfide, diselenide ditelluride, tổng hợp nhiều chất tương tự oxytocin có chứa liên kết disulfid thay đổi (hình 3.) Hình 1.4 Các chất tương tự oxytocin liên kết vào cầu nối disulfide oxytocin Kết nghiên cứu tác dụng thụ thể ổn định huyết tương chất tương tự Oxytocin - với thay cầu nối disulfide Alewood cho thấy giảm kích thước vòng ([- 29 D 1.2 0.8 0.6 D 0.4 0.2 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 Ve ml Hình 3.4 Đồ thị mật độ quang phân đoạn rửa giải dung dịch Insulin Vậy thể tích rửa giải cột sắc ký lọc gel cho Ve Insulin 12 ml - Kết mật độ quang phân đoạn rửa giải Chymotrypsin biểu diễn đồ thị sau: D 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 D 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Ve ml 30 Hình 3.5 Đồ thị mật độ quang phân đoạn rửa giải dung dịch Chymotrypsin Kết rửa giải cột sắc ký lọc gel Chymotripsin Ve = ml - Sắc ký đồ lọc gel Casein D 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 D 0.4 0.3 0.2 0.1 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 ml Hình 3.6 Đồ thị mật độ quang phân đoạn rửa giải dung dịch Casein Kết rửa giải (Ve) cột sắc ký lọc gel Chymotripsin ml - Tiến hành sắc ký lọc gel dung dịch Oxytocin xác định độ hấp thu ánh sáng bước sóng 280 nm phân đoạn rửa giải Kết thu sắc ký đồ lọc gel dung dịch Oxytocin phân đoạn dịch lọc sau: 31 D 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 D 0.4 0.3 0.2 0.1 10111213 1415 161718 1920212223 2425 262728 2930 ml Hình 3.7 Đồ thị mật độ quang phân đoạn rửa giải dung dịch Oxytocin Kết rửa giải cột sắc ký lọc gel Oxytocin Ve = 18 ml - Xác định liên quan logarit khối lượng thể tích rửa giải Ve protein phương pháp sắc ký lọc gel Xây dựng mối liên quan tuyến tính logarit khối lượng phân tử protein thể tích rửa giải Ve Bảng 3.1 Tổng hợp kết rửa giải protein phương pháp lọc gel Protein MW (KDa) logMW Ve (ml) Chymotrypsin 25,000 1,398 Casein 23,600 1,373 Insulin 5,780 0,762 12 Oxytocin 1,078 0,003 18 Phương trình hồi quy đơn giản thể phụ thuộc logMW protein thứ tự rửa giải Ve sắc ký lọc gel 32 logMW 1.600 1.400 f(x) = - 0.13x + 2.36 R² = 1.200 1.000 0.800 0.600 0.400 0.200 0.000 10 12 14 16 18 20 Ve ml Hình 3.8 Đồ thị hồi quy tuyến tính logMW Ve - Phương trình biểu diễn quan hệ log MW protein thứ tự rửa giải Ve chúng có dạng: y = -0.131 x + 2.36 - Đây đường thẳng có hệ số tương quan > 0,99 Vì kết luận điều kiện thí nghiệm log MW Ve tuyến tính nghịch biến 3.1.4 Xác định khối lượng phân tử hợp chất liên hợp phản ứng Pegyl hóa sắc ký lọc gel Kết rửa giải chất phản ứng liên hợp pH 7,5 cho sắc ký đồ lọc gel phân đoạn rửa giải sau: 33 D 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 D 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 ml Hình 3.9 Biểu đồ mật độ quang phân đoạn rửa giải dung dịch sau phản ứng liên hợp Oxytocin mPEG aldehyd pH 7,5 - Nhận xét: + Oxytocin có pick phân đoạn – 17 ml, với đỉnh thể tích 11 ml + Hỗn hợp sản phẩm tạo thành pH 7.5 cho thấy có pick phân đoạn – 15 ml 15 – 22 ml, tương ứng với đỉnh thể tích 12 ml 18 ml Pick thứ hai trùng với pick Oxytocin Như pick thứ phải pick chất có khối lượng phân tử lớn Oxytocin hấp thụ UV 280 nm Đó pick Oxytocin-PEG + Theo phương trình, tính trọng lượng phân tử Oxytocin-PEG khoảng 6,1 kDa Do phản ứng liên hợp phân tử mPEG aldehyd gắn kết với phân tử Oxytocin Kết rửa giải chất phản ứng liên hợp pH 4,5 cho sắc ký đồ lọc gel phân đoạn rửa giải sau: 34 D 1.2 0.8 0.6 0.4 0.2 10 11 1213 14 15 16 17 18 19 20 21 2223 24 25 26 27 28 2930 ml Hình 3.10 Biểu đồ mật độ quang phân đoạn rửa giải dung dịch sau phản ứng liên hợp Oxytocin mPEG aldehyd với pH 4,5 - Nhận xét: Mẫu phản ứng pH 4,5 cho kết tương tự kết mẫu phản ứng pH 7,5 Thu pick, pick thứ pick Oxytocin, pick thứ pick oxytocinPEG có khối lượng khoảng 6,1 kDa Do phản ứng liên hợp phân tử mPEG aldehyd gắn kết với phân tử Oxytocin Sắc ký đồ lọc gel hai mẫu phản ứng pH cho thấy lượng hợp chất Oxytocin-PEG liên hợp chứa phân đoạn từ ml đến 15 ml sau sắc ký lọc gel 3.1.5 Xác định hàm lượng Oxytocin-PEG mẫu phản ứng hai pH sau sắc ký lọc gel - Gộp thể tích sau lọc từ ml đến 15 ml, tiến hành đo quang bước sóng 280 nm Đồng thời pha mẫu chuẩn mẫu trắng đo quang điều kiện Tỷ lệ hình thành hợp chất Oxytocin-PEG thu dung dịch sau sắc ký lọc gel so với nguyên liệu tham gia phản ứng liên hợp Tiến hành so sánh tỷ lệ phản ứng tiến hành pH 4,5 pH 7,5 Kết tổng hợp bẳng sau: Bảng 3.4 Lượng sản phẩm liên hợp thu dung dịch sau lọc gel pH 4,5 M1 M2 pH 7,5 M3 M1 M2 M3 35 Cchuẩn (mg/ml) 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 Dchuẩn 3,38 3,43 3,3 3,43 3,52 3,38 Dtrắng 0,04 0,043 0,048 0,05 0,056 0,06 Dthử 0,91 0,124 0,105 0,146 0,167 0,138 Cthử (mg/ml) 0,003 0,005 0,004 0,006 0,006 0,005 Moxytocin-PEG (mg) 15,12 23,68 17,35 28,12 31,72 23,26 H% 30,35 47,54 34,84 57,86 65,27 47,86 p p < 0,05 * Nhận xét: Do p = 0,045 < 0,05 cho thấy khác biệt lượng hợp chất Pegyl hóa điều kiện phản ứng pH 7,5 so với mẫu phản ứng pH 4,5.Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê Vậy tỷ lệ thu hồi hợp chất Pegyl hóa pH 7,5 lớn so với mẫu pH 4,5 Xác định pH 7,5 điều kiện phù hợp làm tăng lượng hợp chất Pegyl hóa Oxytocin mẫu dung dịch thu sau sắc ký lọc gel 3.2 Đánh giá ảnh hưởng lượng mPEG aldehyd tham gia phản ứng tới tỷ lệ hợp chất Oxytocin-PEG dung dịch sau sắc ký lọc gel - Đo quang mẫu từ M đến M4, tiến hành lần cho mẫu Kết mật độ quang phân đoạn rửa giải qua sắc ký lọc gel sau: Bảng 3.5 Mật độ quang phân đoạn rửa giải phản sau sắc ký lọc gel M1 M2 M3 M4 0,05 0,05 0,04 0,04 0,04 0,04 0,04 0,04 0,05 0,03 0,05 0,03 0,04 0,04 0,04 0,04 0,04 0,04 0,04 0,04 0,04 0,04 0,05 0,03 0,04 0,04 0,05 0,04 0,04 0,04 0,04 0,04 0,04 0,04 0,05 0,03 P Đ 36 8 8 8 7 0,06 0,05 0,06 0,05 0,06 0,06 0,06 0,05 0,04 0,06 0,06 0,08 0,07 0,06 0,06 0,06 0,07 0,07 0,06 0,06 0,07 0,06 0,06 0,10 0,17 0,20 0,23 0,18 0,12 0,27 0,22 0,26 0,10 0,27 0,17 0,20 10 0,40 0,37 0,48 0,46 0,47 0,30 0,48 0,50 0,45 0,45 0,47 0,47 11 0,54 0,55 0,54 0,50 0,51 0,64 0,56 0,60 0,53 0,67 0,57 0,59 12 0,85 0,81 0,72 0,80 0,88 0,80 0,87 0,80 0,82 0,90 0,84 0,89 13 0,51 0,46 0,45 0,40 0,42 0,41 0,55 0,42 0,54 0,57 0,51 0,57 14 0,30 0,24 0,10 0,07 0,21 0,20 0,30 0,20 0,33 0,30 0,31 0,34 15 0,07 0,07 0,04 0,05 0,06 0,09 0,06 0,04 0,06 0,07 0,07 0,08 16 0,24 0,22 0,28 0,28 0,23 0,16 0,17 0,12 0,26 0,17 0,21 0,16 17 0,43 0,45 0,48 0,35 0,43 0,48 0,33 0,41 0,46 0,28 0,40 0,33 Kết sắc ký lọc gel cho thấy mẫu cho pick có pick thứ pick Oxytocin,còn pick thứ pick Oxytocin – PEG Ve thể tích rửa giải hợp chất liên 37 hợp mẫu phản ứng 12 ml, thay vào phương trình tuyến tính xác định khối lượng phân tử Oxytocin-PEG 6,1 kDa - Gộp phân đoạn rửa giải từ đến 15 ml đo quang xác định lượng tỷ lệ OxytocinPEG mẫu dung dịch thu sau sắc ký lọc gel Xác định hiệu hình thành OxytocinPEG mẫu dung dịch thu Bảng 3.6 Ảnh hưởng lượng mPEG aldehyd tham gia phản ứng tới tỷ lệ Oxytocin-PEG hình thành phân đoạn sau lọc gel Thông số M2 M1 -20% -10% 3 Số thí nghiệm (n) Lượng Oxytocin mg Lượng mPEG aldehyd (mg) M0 32.4 36.45 40,5 Khối lượng phân tử (kDa) 6,1 P +10% +20% 3 44.55 48.6 33,69 ± 34,88 ± 2,54 6,83 63,99 ± 61,51 ± 4,84 12,04 8,1 mg cho mẫu 12 Hiệu suất thu hồi (%) M4 Thể tích rửa giải Ve (ml) Lượng Oxytocin-PEG (mg) M3 27,97 ± 27,86 ± 2,92 1,22 69,08 ± 62,55 ± 7,19 2,75 0.053 0,48 27,7 ± 4,25 56,99 ± 8,74 0,14 0,54 * Nhận xét: - Các mẫu phản ứng cho hợp chất liên hợp tích rửa giải Ve 12 ml quy trình sắc ký lọc gel Như khối lượng phân tử Oxytocin-PEG khoảng 6,1 kDa - Do p > 0.05 tất mẫu so với mẫu M khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê Như vậy, mẫu từ M đến M4 với M0 cho thấy tất mẫu từ M đến M4 thay đổi lượng tỷ lệ tạo thành hợp chất Oxytocin-PEG dung dịch sau lọc gel so với tỷ lệ ban đầu mẫu M0 - Điều cho thấy lượng hợp chất liên hợp mẫu dung dịch thu sau sắc ký lọc gel thay đổi lượng mPEG aldehyd khoảng 20% 38 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 4.1.Về điều kiện phản ứng Pegyl hóa Oxytocin Trong nghiên cứu công bố, polyethylene glycol lựa chọn cho phản ứng Pegyl hóa protein thường sử dụng PEG-bis succinimidyl succinat, mPEG-succinimidyl propionat, PEG-aldehyd, PEG-imidazol carbonat, PEG-succinimidyl carbonat, Chúng dẫn chất PEG hoạt hóa đầu; đầu lại trơ, khơng hoạt động bị gắn với alkyl tạo thành nhóm alcoxy (hay gặp methoxy) Khi tham gia phản ứng tạo thành hợp chất liên hợp chúng thể ưu nhược điểm khác Trong đó, Methoxy polyethylene glycol aldehyd đánh giá chất có khả phản ứng dễ dàng, chọn lọc vào nhóm amin phân tử protein [41], [90] Về điều kiện pH phù hợp cho phản ứng thường 4,5 7,5 Đây điều kiện thích hợp cho phản ứng nhóm amin (-NH 2) nhóm phản ứng aldehyd (-CHO), cacboxyl (COOH), … Cũng điều kiện tốt cho khả xúc tác NaCNBH3 [41], [84] Tỷ lệ chất xúc tác khử hóa NaCNBH thêm vào phản ứng thường gấp từ vài lần đến vài chục lần nguyên liệu liên hợp [84] Chúng thực phản ứng liên hợp với nguyên liệu dẫn chất Methoxyl polyethyle glycol propion aldehyd để Pegyl hóa Oxytocin Phản ứng liên hợp thực hai điều kiện pH 4,5 7,5 Lựa chọn tỷ lệ hai nguyên liệu ban đầu tham gia phản ứng 1:1, xúc tác phản ứng NaCNBH3 gấp lần chất tham gia phản ứng số mol chất Phản ứng thực hiên điều kiện nhiệt độ thấp (40C), thời gian 24 Đánh giá kết liên hợp phản ứng phương pháp điện di Cả hai mẫu điện di phản ứng pH 4,5 7,5 cho thấy suất chất Chất có chất protein bắt màu thuốc nhuộm Comassie blue có khối lượng phân tử lớn Oxytocin ban đầu Điều chứng minh phân tử mPEG propion aldehyd gắn kết với Oxytocin Sơ xác định khối lượng hợp chất liên hợp tạo thành khoảng kDa 4.2 Xác định khối lượng protein sau phản ứng liên hợp Phương pháp sắc ký lọc gel thường dùng để tinh chế phân tử mẫu nhỏ xác định trọng lượng phân tử protein [88], [89] Nguyên lý sắc 39 ký lọc gel là phân tách chất theo khối lượng phân tử chúng Chất có khối lượng phân tử lớn chuyển qua cột với tốc độ nhanh [88] Do phân tử Oxytocin-PEG hình thành rửa giải trước phân tử Oxytocin tự nhiên Nếu hỗn hợp sản phẩm có oxytocin-PEG có pick sắc ký nằm trước vị trí pick oxytocin Đồng thời, xác định mối liên quan tuyến tính logarit khối lượng protein (logMW) thể tích rửa giải (Ve) protein qua sắc ký lọc gel [88] Do đó, phương pháp áp dụng để xác định khối lượng phân tử protein mẫu phản ứng liên hợp Tiến hành sắc ký lọc gel protein Chymotrypcin, Casein, Insulin Oxytocin xây dựng phương trình tuyến tính logMW thể tích rửa giải Ve protein phương pháp y = -0,131x + 2,36 Trong y logMW x thể tích rửa giải protein qua sắc ký lọc gel Phương trình tuyến tính có hệ số tương quan R -0,997 Các phản ứng liên hợp thực pH 4,5 7,5 lấy mẫu tiến hành lọc gel Kết thu cho thấy, hỗn hợp sản phẩm mẫu có pick: pick thứ (ở phân đoạn – 15 ml, đỉnh: 12 ml) nằm trước pick oxytocin tự nhiên (ở phân đoạn 15 – 22 ml, đỉnh: 18 ml) Đó phải pick chất có khối lượng phân tử lớn insulin hấp thụ UV bước sóng 280 nm Xét thành phần chất phản ứng hỗn hợp ban đầu, nhận thấy chất có đặc tính oxytocin tăng khối lượng phân tử cách gắn thêm phân tử khác Chúng tơi cho oxytocin-PEG Xác định thể tích rửa giải Ve Oxytocin 18 ml tính theo phương trình tuyến tính khối lượng 1009 Da Thể tích rửa giải hợp chất liên hợp Oxytocin-PEG Ve1 = 12 ml có khối lượng 6,1 kDa Hợp chất phản ứng liên hợp phân tử mPEG aldehyd gắn kết với phân tử Oxytocin Kết phù hợp với kết mẫu điện di protein sau phản ứng liên hợp 4.3 Về đánh giá lượng Oxytocin-PEG dung dịch sau sắc ký lọc gel - Ảnh hưởng pH phản ứng liên hợp 40 Mẫu phản ứng pH 4,5 7,5 xác định có hình thành hợp chất liên hợp Hợp chất có chứa phân đoạn rửa giải từ ml đến 14 ml sau sắc ký lọc gel Gộp phân đoạn rửa giải để tiến hành đo quang bước sóng 280nm Lượng hợp chất liên hợp Oxytocin-PEG xác định có dung dịch sau sắc ký lọc gel mẫu phản ứng pH 4,5 37,58% ± 8,91%, so với mẫu phản ứng pH 7,5 56,99% ± 8,74% (p < 0,05) Do đó, lượng hợp chất liên hợp pH 7,5 sau lọc gel lớn so với mẫu phản ứng pH 4,5 Chúng lựa chọn mẫu phản ứng pH 7,5 để tiếp tục khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ nguyên liệu tham gia vào phản ứng - Ảnh hưởng tỷ lệ nguyên liệu tham gia vào phản ứng liên hợp Thay đổi lượng mPEG aldehyd tham gia vào phản ứng liên hợp với Oxytocin khoảng thêm bớt 20%, 10% so với lượng ban đầu Kết cho thấy thể tích rửa giải Ve Oxytocin-PEG 12 ml khối lượng phân tử oxytocin-PEG khoảng kD Lượng hợp chất có chứa phân đoạn rửa giải từ ml đến 14 ml sau sắc ký lọc gel Với p > 0,05 so sánh mẫu M đến M4 với M0 cho thấy lượng hợp chất có mẫu dung dịch sau lọc gel không thay đổi so với tỷ lệ phản ứng ban đầu Như lượng hợp chất liên hợp mẫu dung dịch thu sau sắc ký lọc gel thay đổi lượng mPEG aldehyd khoảng 20% KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41 Đã thực gắn kết phân tử Methoxy polyethylenglycol propion aldehyd vào phân tử Oxytocin Xác định hợp chất liên hợp Oxytocin-PEG có khối lượng phân tử kDa, chứng minh phân tử hợp chất có phân tử mPEG aldehyd gắn với phân tử Oxytocin 3.Đã tinh chế Oxytocin-PEG sắc ký lọc gel Và xác định điều kiện phản ứng phù hợp nghiên cứu xác định pH 7,5 với tỷ lệ 40,5 mg mPEG aldehyd 8,1 mg Oxytocin Trong điều kiện này, tỷ lệ lượng hợp chất liên hợp Oxytocin-PEG dung dịch sau sắc ký lọc gel 56,99 ± 8,74% Khi thay đổi lượng mPEG aldehyd nguyên liệu tham gia phản ứng khoảng ±20% tất mẫu phản ứng cho thấy có chất Oxytocin-PEG có khối lượng phân tử khoảng kD Nhưng tỷ lệ Oxytocin-PEG hình thành sau sắc ký lọc gel mẫu không thay đổi so với mẫu ban đầu KIẾN NGHỊ - Cải tiến phương pháp nguyên liệu để tổng hợp protein-PEG đạt hiệu cao Xây dựng tiêu chuẩn đánh giá khác nhằm xác định thêm đặc điểm độ tinh khiết của hợp chất liên hợp Oxytocin-PEG - Phát triển áp dụng quy mô sản xuất lớn tạo hợp chất liên hợp oxytocin pegyl hóa tạo chế phẩm thuốc chứa Oxytocin-PEG sử dụng qua đường tiêu hóa ổn định bảo quản 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO 43 ... tạo đánh giá hiệu hình thành phức hợp Oxytocin- PEG để làm thuốc phương pháp hóa sinh với mục tiêu sau: Gắn kết Oxytocin với polyehthylen glycol tạo phực hợp Oxytocin- PEG Xác định hiệu hình thành. .. m moxytocin+ mPEG 100 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 27 3.1 LIÊN HỢP mPEG aldehyd VỚI OXYTOCIN VÀ ĐÁNH GIÁ TỶ LỆ HÌNH THÀNH HỢP CHẤT LIÊN HỢP 3.1.1 Tổng hợp Oxytocin- PEG - Thực phản ứng tổng hợp. .. di Bản gel lấy nhuộm phương pháp nhuộm Comassie Brillant Blue 2.3.3 Sử dụng phương pháp sắc ký lọc gel để sơ đánh giá hiệu hình thành tinh chế hợp chất liên hợp Oxytocin- PEG * Nguyên tắc 24 Trong