Ứng dụng công nghệ sinh học xử lý rác hữu cơ phục vụ sản xuất nông nghiệp, tỉnh sóc trăng (tt)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành: VI SINH VẬT HỌC Mã ngành: 62 42 01 07 MAI THI ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ SINH HỌC XỬ LÝ RÁC HỮU CƠ PHỤC VỤ SẢN XUẤT NƠNG NGHIỆP TỈNH SĨC TRĂNG Cần Thơ, 2018 CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS NGUYỄN HỮU HIỆP Luận án bảo vệ trước hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp trường Họp tại: ……………………………………, Trường Đại học Cần Thơ Vào lúc … … ngày … tháng … năm … Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: DANH MỤC LIỆT KÊ CÁC BÀI BÁO ĐÃ CÔNG BỐ Mai Thi, Nguyễn Hữu Hiệp, (2013) "Phân lập vi khuẩn phân hủy cellulose từ sùng (Holotrichia paralella)" Kỷ yếu Khoa học Hội thảo Công nghệ Sinh học vùng Đồng sông Cửu Long, Đại Học Cần Thơ, 2013 Mai Thi va Nguyen Huu Hiep, (2015) "Isolation and characterization of cellulose bacteria in organic waste in Soc Trang province, Vietnam" The 6th International Conference on Fermentation Technology for Value Added Agricultural Products (The 6th FerVAAP Conference), Khon Kaen, Thailand" Mai Thi, Nguyễn Hữu Hiệp Nguyễn Diệp Minh Tân, (2016) "Phân lập nhận diện vi khuẩn phân giải cellulose rác hữu tỉnh Sóc Trăng" Tạp chí Tài Nguyên Môi trường (ISSN 1859-1477), số 21 Trang 129-131 Mai Thi, Nguyễn Hữu Hiệp, Diệp Tuấn Anh, Lê Minh Hiếu Huỳnh Tấn Thanh (2016) "Ứng dụng chế phẩm sinh học STBacilli xử lý rác hữu cơ" Tạp chí Tài Ngun Mơi trường (ISSN 1859-1477), số 21 Trang 125-128 Mai Thi, Nguyễn Hữu Hiệp (2017) "Phân lập nhận diện vi khuẩn phân giải protein từ sùng trùn đất" Tạp chí Tài Nguyên Môi trường ISSN 1859-1477 số 16 Trang 40-42 Mai Thi, Nguyễn Hữu Hiệp Dương Ngọc Thúy (2017) "Phân lập vi khuẩn phân hủy cellulose từ sùng (Holotrichia paralella) Trùn đất (Lubricus terrestris)" Tạp chí Đại Học Cần Thơ ISSN 1859-2333; Tập 50, phần B Trang 81-90 Chương I GIỚI THIỆU 1.1 Tính cấp thiết luận án Cùng với gia tăng số lượng quy mơ ngành nghề sản xuất, hình thành khu dân cư tập trung, nhu cầu tiêu dùng hàng hoá, nguyên vật liệu lượng ngày tăng Những gia tăng tạo điều kiện kích thích ngành sản xuất, kinh doanh dịch vụ mở rộng phát triển nhanh chóng, đóng góp tích cực cho phát triển kinh tế - xã hội đất nước Tuy nhiên, song song với phát triển mạnh mẽ phóng thích lượng lớn chất thải vào môi trường, đặc biệt chất thải rắn chất thải sinh hoạt, chất thải công nghiệp, chất thải y tế, chất thải nông nghiệp, chất thải xây dựng, chất thải nguy hại… Hiện nay, ô nhiễm môi trường vấn đề cấp bách quốc gia có nhiều phương án để khắc phục, giảm thiểu hậu ô nhiễm môi trường Rác thải sinh hoạt Việt Nam, thành phố lớn chủ yếu xử lý thô sơ cách vùi bãi chôn lấp, có nguy gây nhiễm khơng khí nguồn nước ngầm Tỉnh Sóc Trăng hàng ngày có 248,2 rác thải; tỉnh chưa có quy trình cơng nghệ xử lý rác đạt u cầu mà chủ yếu đổ vào bãi rác hở chờ phân hủy tự nhiên, vừa chiếm diện tích lớn vừa vệ sinh tạo nên điểm nóng nhiễm mơi trường nghiêm trọng Chính điều tác động lớn đến môi trường xung quanh, nguy tiềm ẩn dịch bệnh cho người làm cho môi trường ngày ô nhiễm Từ lý trên, đề tài nghiên cứu “Ứng dụng công nghệ sinh học xử lý rác hữu phục vụ sản xuất nông nghiệp, tỉnh Sóc Trăng” góp phần bảo vệ mơi trường hướng đến phát triển bền vững kinh tế - xã hội đôi với bảo vệ môi trường thực 1.2 Mục tiêu đề tài Phân lập chọn lọc dòng vi khuẩn địa để xử lý rác hữu ứng dụng phân hữu vi sinh sản xuất nơng nghiệp tỉnh Sóc Trăng Chương II PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu Luận án thực từ tháng 08/2013 đến tháng 12/2016 Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học phòng thí nghiệm chun sâu trường Đại học Cần Thơ; phòng thí nghiệm Hóa Sinh thuộc Trung tâm Quan trắc Tài ngun Mơi trường tỉnh Sóc Trăng; bãi rác địa bàn tỉnh Sóc Trăng bãi rác thị trấn Đại Ngãi (huyện Long Phú), bãi rác thị trấn Trần Đề (huyện Trần Đề), bãi rác thị trấn Kế Sách (huyện Kế Sách) bãi rác xã Tân Long (huyện Ngã Năm) trang trại Ông Phạm Hữu Lai (ấp Thạnh An 3, xã Thạnh Thới Thuận, huyện Trần Đề, tỉnh Sóc Trăng) 2.2 Phương tiện nghiên cứu 2.2.1 Vật liệu Ba mẫu rác hữu ba mẫu nước rỉ rác thu từ bãi rác huyện Trần Đề, Kế Sách Ngã Năm thuộc tỉnh Sóc Trăng Mẫu lưu trữ chai thủy tinh vô trùng, trữ 4ºC đến sử dụng Các mẫu sùng gồm 12 có trọng lượng từ 2,5 g đến 15 g mẫu trùn đất gồm 12 có trọng lượng từ g đến 11 g thu thập từ đóng rơm hoai mục huyện Ngã Năm, tỉnh Sóc Trăng Những mẫu sùng đất trùn đất trữ thùng có chứa đất mùn ẩm rơm hoai mục làm thức ăn sử dụng 2.2.2 Thiết bị dụng cụ Luận án sử dụng thiết bị dụng cụ có Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học phòng thí nghiệm Chun sâu thuộc trường Đại học Cần Thơ Trung tâm Quan trắc Tài nguyên Mơi trường tỉnh Sóc Trăng 2.2.3 Hóa chất mơi trường Hóa chất khử trùng bề mặt mẫu sùng đất trùn đất; chất kháng nấm cycloheximide; thuốc thử lugol; thuốc thử Methyl red; hóa chất nhuộm Gram, hóa chất nhuộm bào tử; Mơi trường sử dụng luận án gồm có mơi trường phân lập dòng vi khuẩn phân hủy cellulose, tinh bột protein; môi trường LB (Luria Broth); môi trường xác định hoạt tính enzyme cellulase, 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Phân lập vi khuẩn Mẫu rác nước rỉ rác pha loãng mẫu với độ pha loãng 10 , 10-2, 10-3, 10-4 10-5 Sau trải 0,1 mL mẫu nồng độ lên môi trường phân lập vi khuẩn que trải thủy tinh Sau đậy nắp, úp ngược ủ hiếu khí 30oC 72 Đối với sùng trùn đất, mẫu rửa nước cất, khử trùng bề mặt cồn 70o phút sau H2O2 3% phút, mổ lấy ruột (khoảng vòng que cấy) trải lên mơi trường phân lập que trải thủy tinh, ủ 30ºC 72 điều kiện hiếu khí (Shengwei et al., 2012; Kumar et al., 2012) Khi khuẩn lạc phát triển, chọn khuẩn lạc rời rạc để tách ròng phương pháp cấy ria môi trường phân lập -1 2.3.2 Quan sát đặc điểm hình thái sinh hóa vi khuẩn Các đặc điểm khuẩn lạc vi khuẩn (hình dạng, độ nổi, dạng bìa, màu sắc kích thước) ghi nhận suốt q trình phân lập Phương pháp nhuộm Gram đo kích thước tế bào vi khuẩn dựa theo Cao Ngọc Điệp Nguyễn Hữu Hiệp (2002) Phương pháp xác định khả di động khả tạo bào tử vi khuẩn dựa theo Nguyễn Lân Dũng (2006) Phương pháp xác định khả sinh acid vi khuẩn môi trường có diện glucose khả sinh catalase vi khuẩn dựa theo Nguyễn Lân Dũng (2006) 2.3.3 Khảo sát khả phân hủy cellulose, tinh bột protein Phương pháp giếng thạch dùng để chọn dòng vi khuẩn có khả phân hủy cellulose, tinh bột protein dựa vào đường kính vòng sáng phân hủy chất xung quanh khuẩn lạc môi trường phân lập (môi trường CMC, tinh bột skim milk) Khả phân hủy chất (E) đánh giá qua hiệu số đường kính vòng sáng phân hủy (D) đường kính khuẩn lạc (d) phát triển từ giếng (E=D-d) Giá trị E lớn vi khuẩn phân hủy chất mạnh (Saini et al., 2012; Alariya et al., 2013 and Kazanas, 1968) 2.3.4 Xác định hoạt tính cellulase Cellulase phân hủy CMC (hoặc cellulose) giải phóng đường khử Hoạt tính enzyme cellulase lượng đường khử sinh (µmol) phút hoạt động xúc tác mL enzyme pH nhiệt độ phòng (Nelson, 1944) Hoạt tính endoglucanase xác định cho enzyme phản ứng với chất CMC hoạt tính exoglucanase xác định cho enzyme phản ứng với chất bột cellulose (LiJung et al., 2010) 2.3.5 Xác định hoạt tính amylase Amylase phân hủy tinh bột tạo đường khử Hoạt tính enzyme amylase xác định dựa vào nồng độ đường khử sinh thông qua phản ứng trung gian với thuốc thử đồng asenomolybdate Một đơn vị hoạt tính amylase ượng đường khử (µmol) tạo phút xúc tác mL enzyme amylase pH 5,0 nhiệt độ phòng (Nelson, 1944) 2.3.6 Xác định hoạt tính protease Sản phẩm trình phân hủy protein protease vi khuẩn có phản ứng màu với thuốc thử Folin Hàm lượng sản phẩm phân hủy định lượng dựa vào đồ thị đường chuẩn tyrosine; từ xác định hoạt tính enzyme protease Một đơn vị hoạt tính protease lượng sản phẩm hòa tan tạo thành (µmol) phút với xúc tác mL enzyme protease pH 7,5 nhiệt độ 37ºC (CuppEnyard, 2008) 2.3.7 Khuếch đại đoạn gene 16S rRNA Chọn dòng vi khuẩn có khả phân hủy cellulose, tinh bột protein triển vọng để khuếch đại đoạn gen 16Sr RNA kỹ thuật PCR với cặp mồi 27F-1492R (Lane, 1991): 27F- 5’-AGAGTTTAGTCCTTGGCTCAG- 3’ 1492R- 5’-GGCTACCTTGTTACGACTT- 3’ Sản phẩm PCR diện di gel agarose 2% 2.3.8 Giải trình tự đoạn gen 16S rRNA Sản phẩm PCR tinh kiểm tra nồng độ DNA sau tinh Sau thực phản ứng PCR gắn huỳnh quang với thuốc nhuộm Big.Dye Terminater v3.1 Đoạn gen 16S rRNA giải trình tự máy giải trình tự ABI PRISM 3130 2.3.9 Ứng dụng vi khuẩn xử lý rác hữu Thí nghiệm bố trí theo thể thức khối đầy đủ hồn tồn ngẫu nhiên với lần lặp lại, lần lặp lại mẻ ủ với khối lượng 100 kg rác hữu phân bố vào chậu gốm Thí nghiệm gồm có nghiệm thức ký hiệu NT1, NT2, NT3, NT4 NT5 Trong đó, NT1 không bổ sung vi khuẩn; NT2 sử dụng chế phẩm sinh học SEM 09; NT3 sử dụng chế phẩm EM; NT4 sử dụng chế phẩm EcoClean NT5 sử dụng dòng vi khuẩn định danh luận án 2.3.10 Phương pháp xác định mật số vi khuẩn hiếu khí Mật số vi khuẩn hiếu khí xác định theo phương pháp Jackson (2000) Mật số tổng vi khuẩn hiếu khí mL 1g mẫu (CFU/mL CFU/g) tổng số khuẩn lạc đếm đĩa chia cho thể tích cấy đĩa (mL) độ pha loãng (Jackson, 2000) 2.3.11 Phương pháp xác định C, N, P, K phân hữu Đo hàm lượng C, N, P, K vào ngày 0, 1, 7, 14, 21, 28, 35 sau ủ để đánh giá chất lượng phân hữu vi sinh ủ từ rác 2.3.12 Ứng dụng phân hữu trồng dưa leo Thí nghiệm bố theo thể thức khối đầy đủ hoàn toàn ngẫu nhiên với nghiệm thức lần lặp lại Bốn nghiệm thức thí nghiệm gồm nghiệm thức đối chứng khơng sử dụng phân bón (NT1); nghiệm thức sử dụng 100% phân bón hóa học địa phương (NT2); nghiệm thức sử dụng 100% phân bón hữu vi sinh từ luận án (NT3) nghiệm thức sử dụng 50% phân bón hóa học 50% phân hữu vi sinh từ luận án (NT4) Các chi tiêu chiều dài trái, đường kính trái, trọng lượng trái, số lượng trái/cây, ngày nở hoa ngày thu hoạch theo dõi suốt q trình thí nghiệm 2.3.13 Xử lý kết thí nghiệm Kết thí nghiệm biên tập phần mềm Microsoft Excel 2010 phân tích thống kê phần mềm Minitab 17 Phân tích thống kê bao gồm phân tích phương sai so sánh khác biệt nghiệm thức kiểm định Fisher (LSD) với độ tin cậy 95% CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Vi khuẩn phân hủy cellulose từ rác nước rỉ rác 3.1.1 Kết phân lập Hai mươi sáu dòng vi khuẩn có khả phân hủy cellulose phân lập từ mẫu rác mẫu nước rỉ rác (được thu huyện Trần Đề, huyện Kế Sách thị xã Ngã Năm, tỉnh Sóc Trăng) ký hiệu RC1, RC2, RC26 3.1.2 Đặc điểm hình thái sinh hóa Khuẩn lạc vi khuẩn phân hủy cellulose từ rác nước rỉ rác khác nhiều đặc điểm bao gồm màu sắc, hình dạng, dạng bìa, đường kính độ Hình dạng tế bào vi khuẩn gồm que dài (15,40%), que ngắn (61,50%) cầu (23,10%) Chiều dài tế bào vi khuẩn dao động khoảng 0,52-4,09 µm chiều rộng dao động khoảng 0,52-1,5 µm Tất 26 dòng vi khuẩn có khả di động Số tế bào vi khuẩn có Gram dương 19 dòng số tế bào Gram âm dòng Có 17 dòng có khả tạo nội bào tử dòng có tế bào dạng que Gram dương Khả sinh catalase ghi nhận 26 dòng vi khuẩn cho thấy chúng có khả khử độc H2O2 sử dụng khí O2 q trình sinh trưởng (Acharya, 2013) Kết kiểm tra Methylred cho thấy có dòng sinh acid mạnh đổi màu Methyl red sang đỏ, dòng sinh acid trung bình đổi màu Methyl red sang màu cam 13 dòng khơng sinh acid 3.1.3 Khả phân hủy CMC dòng vi khuẩn Hai mươi hai dòng vi khuẩn có phân hủy CMC giá trị E dao động từ đến 22 mm Dòng RC22 RC20 phân hủy CMC mạnh với giá trị E tương ứng 22 19 mm (Hình 3.1) Giá trị E dòng RC22 cao giá trị E dòng RC20 hoạt tính enzyme Aftab (2013), Ferbiyanto et al (2015) Ribeiro et al., (2016) chứng minh B megaterium có khả phân hủy cellulose 3.3 Vi khuẩn phân hủy tinh bột từ rác nước rỉ rác 3.3.1 Kết phân lập Từ mẫu rác mẫu nước rỉ rác, 30 dòng vi khuẩn có khả phân hủy tinh bột phân lập ký hiệu RB1, RB2, RB30 3.3.2 Đặc điểm hình thái sinh hóa Khuẩn lạc dòng vi khuẩn phân hủy tinh bột từ rác nước rỉ rác khác hình dạng, độ nổi, dạng bìa, màu sắc đường kính khuẩn lạc Tế bào vi khuẩn có dạng que ngắn (86,70%) dạng que dài (13,30%) Tất 30 dòng vi khuẩn có khả di động Chiều dài tế bào vi khuẩn dao động khoảng 0,87 - 3,74 µm chiều rộng dao động khoảng 0,52 - 1,39 µm Số tế bào vi khuẩn có Gram dương 21 dòng số tế bào Gram âm 20 Có 21 dòng có khả tạo nội bào tử dòng có tế bào dạng que, Gram dương Tất 30 dòng vi khuẩn có khả sinh catalase cho thấy chúng có khả sử dụng khí oxy Mười hai dòng sinh acid mạnh đổi màu Methyl red sang đỏ, 10 dòng sinh acid trung bình đổi màu Methyl red sang cam dòng khơng sinh acid 3.3.3 Khả phân hủy tinh bột dòng vi khuẩn Tất 30 dòng vi khuẩn có khả phân hủy tinh bột giá trị E dao động khoảng 1,57 đến 23,5 mm Dòng RB8 phân hủy tinh bột mạnh với giá trị E 23,5 mm; dòng RB17 (E = 21,47 mm) Hoạt tính enzyme amylase RB8 RB17 tương ứng 22,2 15,6 UI/mL Dựa theo khả phân hủy tinh bột, hai dòng chọn để giải trình tự đoạn gene 16S rRNA 11 3.3.4 Kết định danh Dòng RB8 có độ tương đồng 96% với vi khuẩn Bacillus flexus gene 16S rRNA so sánh trình tự gen 16S rRNA dòng với trình tự gene 16S rRNA ngân hàng liệu NCBI Theo (Zhao et al., 2008) Pal et al (2014) Bacillus flexus lồi vi khuẩn Gram (+), hình que, di động, sử dụng O2 có khả tạo nội bào tử phù hợp với đặc điểm hình thái, sinh hóa dòng RB8 Đã có nhiều nghiên cứu cho thấy Bacillus flexus vi khuẩn có khả phân hủy tinh bột có tiềm ứng dụng nghiên cứu Zhao et al (2008) Chen et al (2013) Dòng RB17 có độ tương đồng 99% với vi khuẩn Bacillus subtilis strain NG3-5 16S Kết phù hợp với đặc điểm hình thái sinh hóa dòng RB17 Gram dương, hiếu khí, que dài, di động tạo nội bào tử (Bergey et al., 1957) Khả phân hủy tinh bột loài vi khuẩn Bacillus subtilis tìm thấy nghiên cứu Panneerselvam Elavarasi (2015) Vijayalakshmi et al (2012) 3.4 Vi khuẩn phân hủy tinh bột từ ruột sùng trùn đất 3.4.1 Kết phân lập Từ ruột mẫu sùng mẫu trùn, 28 dòng vi khuẩn phân hủy tinh bột phân lập; 14 dòng vi phân lập từ ruột sùng đất ký hiệu SB15, SB16, …SB28 14 dòng vi khuẩn phân lập từ ruột trùn đất ký hiệu TB1, TB2,…TB14 3.4.2 Đặc điểm hình thái sinh hóa Khuẩn lạc dòng vi khuẩn phân hủy tinh bột từ ruột sùng trùn đất khác màu sắc, hình dạng, dạng bìa, đường kính độ Tất 28 dòng vi khuẩn có khả di động tế bào dạng que; que ngắn 26 dòng que dài dòng Số dòng vi khuẩn Gram dương 15 số vi khuẩn Gram âm 13 dòng Tất dòng vi khuẩn Gram dương có khả tạo nội bào 12 tử Chiều dài tế bào dao động từ 1,2 đến µm chiều rộng dao động từ 0,8 đến 1,5 µm Tất 28 dòng vi khuẩn sinh catalase chứng tỏ chúng có khả sử dụng khí oxy q trình sinh trưởng Bảy dòng sinh acid mạnh đổi màu Methyl red sang đỏ, 12 dòng sinh acid trung bình đổi màu Methyl red sang màu cam dòng khơng sinh acid 3.4.3 Khả phân hủy tinh bột dòng vi khuẩn Hai mươi bảy dòng vi khuẩn có khả phân hủy tinh bột với giá trị E dao động từ 5,7 mm đến 23,4 mm Ba dòng SB25, TB6 SB16 có vòng sáng phân hủy tinh bột lớn với giá trị E tương ứng 23,4 mm, 21,7 mm 21,57 mm (Hình 3.3) Mặc dù dòng SB25 có vòng sáng phân hủy tinh bột lớn hoạt tính enzyme amylase lại thấp với 13,64 UI/mL, hoạt tính amylase cao ghi nhận dòng TB6 (33,71 UI/mL) Sự khác biệt thành phần dinh dưỡng mơi trường xác định khả phân hủy chất mơi trường xác định hoạt tính enzyme khác Hình 3.3: Vòng sáng phân hủy tinh bột Vòng sáng phân hủy tinh bột dòng vi khuẩn SB16 (a) TB6 (b) 3.4.4 Kết định danh Dòng TB6 tương đồng với Bacillus megaterium (gene for 16S rRNA) với độ đồng hình 97% Kết phù hợp với đặc điểm hình thái sinh hóa dòng TB6 Gram dương, hiếu khí, que dài, di động tạo nội bào tử (Bergey et al., 1957) Nhiều nghiên cứu cho 13 thấy Bacillus megaterium loài vi khuẩn có khả phân hủy tinh bột có tiềm ứng dụng đời sống (David et al., 1987; Brumm et al., 1991 Mary et al., 1980) Dòng SB16 tương đồng với Bacillus cereus strain FORC 024 với độ đồng hình 95% Kết phù hợp với đặc điểm hình thái sinh hóa dòng SB16 Gram dương, hiếu khí, que dài, di động tạo nội bào tử (Bergey et al., 1957) Bacillus cereus lồi vi khuẩn có khả phân hủy tinh bột (Sanjoy et al., 2009) dùng để sản xuất amylase sử dụng công nghiệp (Sivakumar et al., 2012) Dòng SB25 có độ tương đồng 96% với vi khuẩn Bacillus flexus gene 16S rRNA Theo (Zhao et al., 2008) Pal et al (2014) Bacillus flexus lồi vi khuẩn Gram (+), hình que, di động, sử dụng O2 có khả tạo nội bào tử Quá trình khảo sát luận án cho thấy dòng SB25 vi khuẩn Gram (+), hình que (dài), di động sống mơi trường hiếu khí Khả phân hủy tinh bột loài Bacillus flexus thảo luận mục 3.3.4 3.5 Vi khuẩn phân hủy protein từ rác nước rỉ rác 3.5.1 Kết phân lập Từ mẫu rác nước rỉ rác, 29 dòng vi khuẩn phân hủy protein phân lập ký hiệu tương ứng RPp, RPs RPg 3.5.2 Đặc điểm hình thái sinh hóa Khuẩn lạc dòng vi khuẩn khác nhiều đặc điểm bao gồm màu sắc, hình dạng, dạng bìa, đường kính độ Tất 29 dòng vi khuẩn có khả di động tế bào dạng que; que ngắn 20 dòng (69%) que dài dòng (31%) Số dòng vi khuẩn Gram dương 20 dòng số vi khuẩn Gram âm dòng Tất dòng vi khuẩn Gram dương có khả tạo nội bào tử Chiều dài tế bào dao động từ 0,87 đến 4,22 µm chiều rộng dao động từ 0,52 đến 2,33 µm 14 Tất 30 dòng vi khuẩn có khả sinh catalase chứng tỏ chúng có khả sử dụng khí oxy Mười hai dòng sinh acid mạnh đổi màu Methyl red sang đỏ, 11 dòng sinh acid trung bình đổi màu Methyl red sang màu cam dòng khơng sinh acid 3.5.3 Khả phân hủy protein dòng vi khuẩn Tất 29 dòng vi khuẩn có khả phân hủy protein giá trị E dao động từ 5,67 đến 28,77 mm Ba dòng có vòng sáng phân hủy lớn RPs19 (28,77 mm), RPp9 (28,57 mm) RPg15 (27,57 mm) (Hình 3.4) có hoạt tính enzyme protease tương ứng 50, 65 45 UI/mL Mặc dù dòng RPs19 có vòng sáng phân hủy skim milk lớn hoạt tính enzyme cao lại ghi nhận dòng RPp9 Sự khác biệt thành phần dinh dưỡng môi trường xác định khả phân hủy chất mơi trường xác định hoạt tính enzyme khác Hình 3.4: Vòng sáng phân hủy skim milk Vòng sáng phân hủy skim milk dòng RPs19 (a) RPp9 (b) 3.5.4 Kết định danh Dòng RPp9 tương đồng với vi khuẩn Bacillus aquimaris strain HNS62 16S với mức độ đồng hình 99% Kết phù hợp với đặc điểm hình thái sinh hóa dòng RPp9 Gram dương, hiếu khí, que dài, di động tạo nội bào tử (Bergey et al., 1957) Nhiều nghiên cứu chứng minh Bacillus aquimaris có khả phân hủy protein (Abhijit et al., 2012; Amutha and Priva, 2011; Chandrashekhar, 2012; Shivanand and Jayaraman, 2009) 15 Dòng RPs19 tương đồng với Bacillus aryabhattai strain rif 200898 16S với độ đồng hình 96% Kết phù hợp với đặc điểm hình thái sinh hóa dòng RPs19 Gram dương, hiếu khí, que dài, di động tạo nội bào tử (Bergey et al., 1957) Sự phân hủy protein loài Bacillus aryabhattai ghi nhận nghiên cứu Sharma et al (2014) dòng Bacillus aryabhattai K3 tạo vòng sáng phân hủy lớn môi trường skim milk hoạt tính protease dòng lên đến 952 UI/mL Dòng RPg15 xác định thuộc chi Bacillus tương đồng với dòng Bacillus sp S42 16s với độ đồng hình 84% Những đặc điểm hình thái sinh hóa dòng RPg15 Gram dương, hiếu khí, que dài, di động tạo nội bào tử cho thấy dòng RPg15 thuộc chi Bacillus hợp lý (Bergey et al., 1957) Tuy nhiên, chưa định danh đến lồi nên khả phân hủy protein vi khuẩn RPg15 ghi nhận phạm vi luận án 3.6 Vi khuẩn phân hủy protein từ ruột sùng trùn đất 3.6.1 Kết phân lập Từ ruột sùng trùn đất, 50 dòng vi khuẩn phân hủy protein phân lập; có 17 dòng phân lập từ ruột sùng với ký hiệu SPp, SPs SPc 33 dòng phân lập từ ruột trùn đất với ký hiệu TPp, TPc, TPs TPt 3.6.2 Đặc điểm hình thái sinh hóa Khuẩn lạc dòng vi khuẩn phân hủy protein từ ruột sùng trùn đất khác nhiều đặc điểm gồm hình dạng, dạng bìa, độ nổi, màu sắc đường kính Những dòng vi khuẩn có khả di động có tế bào dạng que ngắn (70%), dạng que dài (8%) dạng hình cầu (22%) Số dòng vi khuẩn Gram dương Gram âm tương ứng 31 19 dòng Chiều dài tế bào biến động từ 0,52 - 4,29 µm chiều rộng nằm khoảng 0,52 - 5,17 mm Những dòng vi khuẩn Gram dương có khả tạo nội bào tử 16 Tất 50 dòng vi khuẩn từ ruột sùng trùn đất có khả sử dụng O2 sinh catalase Hai mươi dòng vi khuẩn có khả sinh acid mạnh đổi màu Methyl red sang đỏ, 21 dòng có khả sinh acid trung bình đổi màu Methyl red sang cam dòng khơng sinh acid 3.6.3 Khả phân hủy protein dòng vi khuẩn Tất 50 dòng vi khuẩn có khả phân hủy protein với E dao động từ 6,57 đến 33,80 mm Ba dòng tạo vòng sáng lớn SPp5 (33,80 mm), TPt35 (31,93 mm) TPs45 (31,50 mm) (Hình 3.5) với hoạt tính protease tương ứng 80, 80 100 UI/mL Mặc dù dòng SPp5 có vòng sáng phân hủy skim milk lớn hoạt tính enzyme cao lại ghi nhận dòng TPs45 Sự khác biệt thành phần dinh dưỡng môi trường xác định khả phân hủy chất môi trường xác định hoạt tính enzyme khác Hình 3.5: Vòng sáng phân hủy skim milk Vòng sáng phân hủy skim milk dòng SPp5 (a) TPc18 (b) 3.6.4 Kết định danh Dòng TPs45 tương đồng với Bacillus megaterium strain rif200898 16S với độ đồng hình 99% dòng TPc18 tương đồng với Bacillus megaterium strain YKA3 16S với độ đồng hình 92% Hai dòng TPs45 TPc18 vi khuẩn Gram dương, hiếu khí, có tế bào dạng que có khả tạo bào tử Đó đặc điểm lồi B megaterium theo mơ tả Bergey et al (1957) Khả phân hủy 17 protein Bacillus megaterium ghi nhận qua nhiều nghiên cứu nghiên cứu Mrudula and Shyam (2012) Liang et al (2016) Dòng TPt35 tương đồng với Bacillus licheniformis strain CCMMB838 16S với độ đồng hình 99% Kết phù hợp với đặc điểm hình thái sinh hóa dòng TPt35 Gram dương, hiếu khí, que dài, di động tạo nội bào tử (Bergey et al., 1957) Nhiều nghiên cứu cho thấy loài Bacillus licheniformis có khả phân hủy protein có tiềm ứng dụng nhiều lĩnh vực (Shehri et al., 2004; Nejad et al., 2009 Haddar et al., 2011) Dòng SPp5 tương đồng với Bacillus aquimaris strain L12 16S với độ đồng hình 99% Kết phù hợp với đặc điểm hình thái sinh hóa dòng SPp5 Gram dương, hiếu khí, que dài, di động tạo nội bào tử (Bergey et al., 1957) Khả phân hủy protein loài B aquimaris thảo luận mục 3.5.4 Dòng TPp27 tương đồng với Bacillus subtilis strain OSS 516S với độ đồng hình 99% dòng SPs12 tương đồng với Bacillus subtilis strain T2-Shier5-16S với độ đồng hình 92% Hai dòng TPp27 SPs12 vi khuẩn Gram dương, hiếu khí, có tế bào dạng que có khả tạo bào tử Đó đặc điểm lồi B subtilis theo mô tả Bergey et al (1957) Khả phân hủy protein Bacillus subtilis bết đến qua nghiên cứu Chantawannakula et al (2002) Geethanjali and Subash (2011) 3.7 Đánh giá khả phân hủy rác thải chế phẩm sinh học Qua trình ủ rác thải, tiêu theo dõi có có biến động theo chiều hướng tốt Trong bốn nghiệm thức có sử dụng chế phẩm sinh học đạt yêu cầu mật số vi khuẩn; hàm lượng C; N; C/N; K (%) phân hữu vi sinh theo tiêu chuẩn TCVN 7185: 2002 Tuy nhiên hàm lượng P (%) tất nghiệm thức chưa đạt yêu cầu 18 3.8 Thảo luận chung Hai trăm mười ba dòng vi khuẩn phân lập từ bãi rác, sùng đất trùn đất Tỉnh Sóc Trăng Trong đó, 20 dòng có hoạt tính enzyme cellulase, amylase protease mạnh chọn để ly trích DNA, khuếch đại đoạn gen 16S rRNA, giải trình tự định danh Tất 20 dòng giải trình tự thuộc chi Bacillus Đột biến gen vi khuẩn phân lập từ rác nhiều dòng vi khuẩn phân lập từ sùng đất trùn đất chế thích nghi vi khuẩn nguồn dinh dưỡng biến động rác 3.9 Kết ứng dụng phân hữu vi sinh trồng dưa leo Khi sử dụng phân hữu vi sinh từ luận án kết hợp bón phân đạm hóa học giúp giảm 50% lượng phân đạm hóa học Cây dưa leo có tiêu chiều dài trái, đường kính trái, trọng lượng trái, số trái tương đương với bón 100N Như vậy, trồng dưa leo có sử dụng phân hữu vi sinh giúp giảm 50% lượng phân hoa học, đồng thời góp phần giảm nhiễm mơi trường 19 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Hai trăm mười ba dòng vi khuẩn hiếu khí phân lập từ bãi rác, sùng trùn đất tỉnh Sóc Trăng Tất dòng vi khuẩn có khả di động khác đặc điểm hình thái đặc điểm sinh hóa Hai mươi dòng vi khuẩn triển vọng gồm dòng phân hủy cellulose, dòng phân hủy tinh bột dòng phân hủy protein chọn để giải trình tự đoạn gen 16S rRNA Dựa theo đặc điểm hình thái, sinh hóa kết so sánh trình tự đoạn gen 16S rRNA với liệu NCBI, tất 20 dòng vi khuẩn thuộc chi Bacillus Đột biến gen vi khuẩn phân lập từ rác nhiều dòng vi khuẩn phân lập từ sùng đất trùn đất Ứng dụng vi khuẩn đề tài để xử lý rác thải hữu thu gom địa bàn tỉnh Sóc Trăng cho kết phân hủy rác hữu không thua so với chế phẩm ngoại nhập Sản phẩm sau ủ phân hữu bón cho dưa leo giúp tăng suất chất lượng trái Nghiệm thức 50% phân hữu vi sinh 50% phân hóa học cho kết vượt trội suất so với bón phân hóa học Điều giúp tiết kiệm 50% phân bón hóa học góp phần giảm ô nhiễm môi trường 4.2 Kiến nghị Nghiên cứu phân lập thêm nguồn vi khuẩn phân hủy chất cellulose, tinh bột protein đối tượng côn trùng khác mối, đuông, tằm ăn dâu nhằm làm phong phú nguồn vi khuẩn địa phục vụ xử lý rác thải Tiếp tục nghiên cứu thành phần chất mang, tỷ lệ phối trộn dòng vi khuẩn điều kiện tồn trữ thích hợp để sản xuất chế phẩm sinh học phục vụ xử lý ô nhiễm hữu 20 TÀI LIỆU THAM KHẢO Abhijit, P., G Ratan and C.J Subhas, 2012 Optimization of physicochemical condition for improved production of hyperthermostable β-amylase from Bacillus subtilis DJ5 Journal of Biochemistry Technology, 3(4): 370-374 Aftab, S., 2013 Characterization of cellulose degrading bacterium, Bacillus megaterium S3, isolated from indigenous environment Pakistan Journal of Zoology, 45: 1655-1662 Afzal I., A.A Shah, Z Makhdum, A Hameed and F Hasan, 2012 Isolation and characterization of cellulase producing Bacillus cereus MRLB1 from soil Minerva Biotecnologica, 24: 101-109 Ajay, K., Manhar, Y Bashir, D Saikia, D Nath, K Gupta, B.K Konwar, R Kumar, N.D Namsa and M Mandal, 2016 Cellulolytic potential of probiotic Bacillus subtilis AMS6 isolated from traditional fermented soybean (Churpi): an in-vitro study with regards to application as an animal feed additive Microbiological Research, 186: 62-70 Alariya, S.S., S Sethi, S Gupta and B.L Gupta, 2013 Amylase activity of a starch degrading bacteria isolated from soil Scholars Research Library, 5: 15-24 Amutha, K and K Priya, 2011 Effect of pH, temperature and metal ions on amylase activity from Bacillus subtilis Kcx 006 International Journal of Pharma and Bio Sciences, 2: 40-413 Bergey, D H., R.E Buchanan and N.E Gibbons, 1957 American Society for Microbiology Bergey's manual of determinative bacteriology Baltimore: Williams & Wilkins Pp 613- 653 Brumm, P.J., R.E Hebeda and W.M Teague, 1991 Purification and characterization of the commercialized, cloned Bacillus megaterium α-Amylase Biosynthesis Nutrion Biomedical, 43: 315-319 Cao Ngọc Điệp Nguyễn Hữu Hiệp 2002 Giáo trình thực tập Vi sinh vật đại cương Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ, trang 11-45 21 Chandrashekhar, U., R I Kallur and B B Kaliwal, 2012 Production of α-amylase using banana waste by Bacillus subitis under solid state fermentation European Journal of Experimental Biology, 2(4): 1044-1052 Chantawannakula, P., A Oncharoena, K Klanbuta, E Chukeatiroteb and L Saisamorn, 2002 Characterization of proteases of Bacillus subtilis strain 38 isolated from traditionally fermented soybean in Northern Thailand, Science Asia 28: 241-245 Chen, K., J Yang and H Zhao, 2013 Isolation and characterization of a Bacillus strain for alkaline wastewater treatment Academic Journals, 7(44): 5119-5125 Cupp-Enyard, C., 2008 Sigma’s non-specific protease activity assay casein as a substrate Journal of Visualized Experiments, 19: 899901 David, M.H., H Günther and H.H Röper, 1987 Catalytic properties of Bacillus megaterium amylase, Biosynthesis Nutrient Biomedical, 39: 436-440 Ferbiyanto, A., I Rusmana and R Raffiudin, 2015 Characterization and identification of cellulolytic bacteria from gut of worker Macrotermes gilvus, Hayati Journal of Biosciences, 22: 197-200 Geethanjali, S and A Subash, 2011 Optimization of protease production by Bacillus subtilis isolated from mid gut of fresh water fish Labeo rohita World Journal of Fish and Marine Sciences, 3: 88-95 Haddar, H.O., G.M Aziz and M.H.A Gelawi, 2007 Optimization of bacitracin production by Bacillus licheniformis B5 Pakistan Journal of Biological Sciences, 10: 972-976 Jackson, R.W., K Osborne, G Barnes, C Jolliff, D Zaman, B Roll, A Stillings, D Herzog, S Cannon and S Loveland, 2000 Multiregional evaluation of the simplate heterotrophic plate count method compared to the standard plate count agar pour plate method in water Applied and Environmental Microbiology, 66: 453-454 22 Joseph, V., 2016 Isolation and identification of cellulose degrading bacteria and optimization of the cellulase production International Journal of Research in Biosciences, 5: 58-67 Kazanas, N., 1968 Proteolytic activity of microorganisms isolated from freshwater fish Applied Microbiology, 16: 128-132 Kim, Y.K., S.C Lee, Y.Y Cho, H.J Oh and Y.H Ko, 2012 Isolation of cellulolytic Bacillus subtilis strains from agricultural environments International Scholarly Research Network Microbiology, 2012: 1-9 Kumar, M., D.J Poovai, P.C.L Kumar, S.Y Saroja, A Manimaran and P.T Kalaichelvan, 2012 Optimization of Bacillus cereus MRK1 cellulase production and its biostoning activity Der Pharmacia Lettrer, 4: 881-888 Lane, D J., 1991 16S/23S rRNA sequencing.In the Nucleic acid techniques in bacterial systematics In: E Stackebrandt, M Goodfellow and D J Lane (Editors) John Wiley and Sons New York 175 pp Liang, L., Z Zhao, X Huang, X Du, C Wang, J Li, L Wang and Q Xu, 2016 Isolation, identification and optimization of culture conditions of a bioflocculant-producing bacterium Bacillus megaterium SP1 and its application in aquaculture wastewater treatment Biomed Research International, 2016: 1-9 Li-Jung, Y., L Hsin-Hung and X Zheng-Rong, 2010 Purification and characterization of a cellulose from Bacillus subtilis YJ1 Journal of Marine Science and Technology, 18(3): 466-471 Mary, T., G Priest and J Stark, 1980 Characterization of an extracellular β-amylase from Bacillus megaterium sensu stricto Journal of General Microbiology, 118: 67-72 Mrudula, S and N Shyam, 2012 Immobilization of Bacillus megaterium MTC 2444 by Ca-alginate entrapment method for enhanced alkaline protease production Brazilian Archives of Biology and Technology, 55: 135-144 Nejad, Z G., S Yaghmaei and R H Hosseini, 2009 Production of Extracellular protease and detemination of optimal condition by 23 Bacillus licheniformis BBRC 100053 Archive of SID, 22(3): 221228 Nelson, N., 1944 A photometric adaptation of the Somogyi method for the determination of glucose Journal of Biological Chemistry,153: 375-380 Nguyễn Lân Dũng Đinh Thúy Hằng 2006 Phương pháp thực nghiệm dùng để định tên loài vi khuẩn http://vietsciences.free.fr Panneerselvam, T and S Elavarasi, 2015 Isolation of amylase producing Bacillus subtilis from soil International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences, 4: 543-552 Ribeiro, N.Q, T.P Souza, L.M.A.S Costa, C.P Castro and E.S Dias, 2016 Microbial additives in the composting process Ciência e Agrotecnologia, 41: 159-168 Saini, J.K., Arti and T Lakshmi, 2012 Simultaneous isolation and screening of cellulolytic bacteria: selection of efficient medium Journal of Pure and Applied Microbiology 6: 1339-1344 Saleem, M., S Ahmad and W Ahmad, 2014 Potential of Bacillus cereus for bioremediation of pulp and paper industrial waste Annals of Microbiology, 64: 823-829 Sanjoy, D, P.K Surendran and T Nirmala, 2009 PCR-based detection of enterotoxigenic isolates of Bacillus cereus from tropical seafood The Indian Journal of Medical Research,12: 316-320 Sharma, K M., R Kumar, S Vats and A Gupta, 2014 Production, partial purification and characterization of alkaline protease from Bacillus aryabhattai K3 International Journal of advances in Pharmacy, Biology and Chemistry, 3(2): 290-298 Shehri, A., M Abdulrahman, Mstafa, and S Yasser, 2004 Producion and some properties of protease produced by Bacllus lichenformis isolated from Tihamet Aseer, Saudi Arabia Pakistan Journal of Biologial Sciences, 7(9), 1631-1635 Shengwei, H., P Sheng and H Zhang, 2012 Isolation and identification of celluolytic bacteria from the gut of Holotrichia parallela 24 Larvae International Journal of Molecular Sciences , 13: 25632577 Shivanand, P and G Jayaraman, 2009 Production of extracellular protease from halotolerant bacterium, Bacillus aquimaris strain VITP4 isolated from Kumta coast Process Biochemistry, 44(10): 1088-1094 Sivakumar, T., T Shankar, P Vijayabaskar, J Muthukumar and E Nagendrakannan, 2012 Amylase production using Bacillus cereus isolated from a vermicompost site International Journal of Microbiological Research, 3: 117-123 Vijayalakshmi, K.S., S Abha and P Chander, 2012 Isolation and characterization of Bacillus subtilis KC3 for amylolytic activity International Journal of Bioscience, Biochemistry and Bioinformatics, 2: 336-360 Zhao, J., X Lan, J Su, L Sun and E Rahman, 2008 Isoalation and identification of alkaliphilic Bacillus flexus XJU-3 and analysis of its alkaline amylase Acta Microbiologica Sinica, 48(6): 750-756 25 ... người làm cho môi trường ngày ô nhiễm Từ lý trên, đề tài nghiên cứu Ứng dụng công nghệ sinh học xử lý rác hữu phục vụ sản xuất nơng nghiệp, tỉnh Sóc Trăng góp phần bảo vệ môi trường hướng đến... khuẩn địa phục vụ xử lý rác thải Tiếp tục nghiên cứu thành phần chất mang, tỷ lệ phối trộn dòng vi khuẩn điều kiện tồn trữ thích hợp để sản xuất chế phẩm sinh học phục vụ xử lý ô nhiễm hữu 20 TÀI... triển Cơng nghệ Sinh học phòng thí nghiệm chun sâu trường Đại học Cần Thơ; phòng thí nghiệm Hóa Sinh thuộc Trung tâm Quan trắc Tài nguyên Mơi trường tỉnh Sóc Trăng; bãi rác địa bàn tỉnh Sóc Trăng