Các phương pháp và công cụ trong công nghệ sinh học nano

Công nghệ sinh học nano giao thoa công nghệ nano sinh học, kết hợp nhiều lĩnh vực nghiên cứu công nghệ cao Nói cách khác, Cơng nghệ sinh học nano công nghệ sinh học mức độ siêu nhỏ (mức độ nm) liên quan đến phương pháp sử dụng vật liệu thiết bị công nghệ nano để nghiên cứu hệ sinh học Ứng dụng công nghệ sinh học nano gia tăng nhanh, đặc biệt lĩnh vực y học Một số thiết bị công nghệ sinh học nano chế tạo Việt Nam Để phục vụ cho công nghệ sinh học nano, có số cơng cụ phương pháp như: Dynamics Light Scattering (DLS): Phương pháp tán xạ ánh sáng động học Automic Force Microscopy (AFM): Hiển vi lực nguyên tử Transmision Electron Microscopy (TEM): Hiển vi điện tử truyền qua Scanning Electron Microscopy (SEM): Hiển vi điện tử quét Fluorescent microscopy: Hiển vi huỳnh quang Confocat microscopy: Hiển vi đồng tiêu Super-resolution microscopy STED: Hiển vi siêu phân giải STED Bioassays: Các phép thử sinh học ELISA, Western blotting 1 Dynamics Light Scattering (DLS): Phương pháp tán xạ ánh sáng động học Phương pháp tán xạ ánh sáng động học kỹ thuật v ật lý sử dụng để xác định cấu hình phân bố kích thước h ạt nhỏ huyền phù polyme dung dịch + Nguyên lý hoạt động Kích thước hạt đo DLS: Các hạt lơ lửng chất lỏng liên tục trải qua chuyển động ngẫu nhiên, kích thước hạt trực tiếp ảnh hưởng đến tốc độ chúng Hạt nhỏ di chuyển nhanh so với hạt lớn Trong DLS, ánh sáng qua mẫu, ánh sáng tán xạ phát ghi nhận góc độ định Sự phụ thuộc vào thời gian cường độ tán xạ cho thấy hạt chuyển động nhanh Từ thơng tin này, tính tốn kích thước trung bình hạt phân bố kích thước Đo điện Zeta ELS: Trong ánh sáng tán xạ điện di (ELS) tốc độ hạt đo diện điện trường Sự di chuyển hạt nhanh hơn, điện zeta hạt cao Nói chung, điện zeta cường độ lớn có nghĩa hạt đẩy mạnh hơn, tạo dung dịch huyền phù ổn định + Ứng dụng DLS sử dụng để mơ tả kích thước hạt khác bao gồm protein, polyme, micelles, carbohydrate, hạt nano, tế bào sinh học gel Phép đo phụ thuộc vào kích thước lõi hạt, kích thước cấu trúc bề mặt, nồng độ hạt loại ion môi trường Automic Force Microscopy (AFM): Hiển vi lực nguyên tử Kính hiển vi lực nguyên tử (AFM) thiết bị quan sát cấu trúc vi mô bề mặt vật rắn dựa nguyên tắc xác định lực tương tác nguyên tử đầu mũi dò nhọn với bề mặt mẫu, quan sát độ phân giải nanomet Cấu tạo AFM gồm có phận • Một mũi nhọn • Cần quét (cantilever) • Nguồn Laser • Phản xạ gương (miroir ) • Hai nửa pin quang điện (photodiod) • Bộ quét áp điện Bộ phận AFM mũi nhọn gắn rung (cantilever) Mũi nhọn thường làm Si SiN kích thước đầu mũi nhọn nguyên tử Khi mũi nhọn quét gần bề mặt mẫu vật, xuất lực Van der Waals nguyên tử bề mặt mẫu nguyên tử đầu mũi nhọn (lực nguyên tử) làm rung cantilever Lực phụ thuộc vào khoảng cách đầu mũi dò bề mặt mẫu Dao động rung lực tương tác ghi lại nhờ tia laser chiếu qua bề mặt rung, dao động rung làm thay đổi góc lệch tia lase detector ghi lại Việc ghi lại lực tương tác trình rung quét bề mặt cho hình ảnh cấu trúc bề mặt mẫu vật Kính hiển vi lực nguyên tử ứng dụng chụp ảnh cắt lớp nhanh ; mơ tả, phân tích, xác định đặc điểm bề mặt ; đo học đơn phân tử ; kiểm soát chất lượng, kiểm tra khuyết tật vật liệu Hơn nữa, AFM ứng dụng nhiều lĩnh vực : công nghệ nano, công nghệ bán dẫn, dược phẩm, sinh học, công nghệ vật liệu.,v…v… Transmision Electron Microscopy (TEM): Hiển vi điện tư truyền qua Kính hiển vi điện tử truyền qua thiết bị nghiên cứu vi cấu trúc vật rắn, sử dụng chùm điện tử có lượng cao chiếu xuyên qua mẫu vật rắn mỏng sử dụng thấu kính từ để tạo ảnh với độ phóng đại lớn (có thể tới hàng triệu lần), ảnh tạo huỳnh quang, hay film quang học, hay ghi nhận máy chụp kỹ thuật số Kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) Là công cụ h ữu hi ệu cho nghiên cứu vật liệu y học Khi đo TEM ta có th ể xác định đ ược hình dạng, kích thước trung bình hạt phân tán h ạt môi trường chất Khi chùm điện tử chiếu tới mẫu v ới tốc đ ộ cao phạm vi hẹp, điện tử bị tán xạ tĩnh điện hạt nhân nguyên tử lớp mây điện tử vật liệu gây nhiễu xạ điện t Chùm điện tử nhiễu xạ từ vật liệu phụ thuộc vào bước sóng chùm v ật li ệu tới khoảng cách mặt phẳng mạng tinh thể, tuân theo định luật Bragg: Kính hiển vi điện tử có độ phân giải giới hạn bước sóng sóng điện tử, sóng điện tử có bước sóng ngắn nên chúng có độ phân giải vượt xa kính hiển vi quang học truyền thống, kính hiển vi điện tử truyền qua loại kính hiển vi có độ phân giải tốt tới cấp độ hạ nguyên tử Nhờ tương tác chùm điện tử với mẫu vật, kính hiển vi điện tử truyền qua cho phép quan sát cấu trúc điện từ vật rắn đem lại nhiều phép phân tích hóa học với chất lượng cao Ứng dụng kính hiển vi điện tử truyền qua cung cấp hình ảnh phóng đại cao cấu trúc bên mẫu Hiển vi điện tử truyền qua dùng để nghiên cứu vật liệu có kích thước nano cho biết thơng tin đặc trưng hình thái, cấu trúc, kiểm soát chất lượng vật liệu chế tạo (như tính đồng cấu trúc kích thước, độ lặp lại, sai hỏng, khả phân tán…) Scanning Electron Microscopy (SEM): Hiển vi điện tư quét Là kính hiển vi điện tử tạo ảnh với độ phân giải cao bề mặt mẫu vật cách sử dụng chùm điện tử hẹp quét bề mặt mẫu Khi điện tử tương tác với bề mặt mẫu vật, có bực xạ phát ra, tạo ảnh SEM phép phân tích thực thơng qua việc phân tích xạ phát từ tương tác chùm điện tử với bề mặt mẫu vật Ứng dụng: - Phép phân tích huỳnh quang catốt: Các ánh sáng phát tương tác chùm điện tử với bề mặt mẫu Phép phân tích phổ biến hữu ích cho việc phân tích tính chất quang, điện vật liệu - Phân tích phổ tia X: Tương tác điện tử với vật chất sản sinh phổ tia X đặc trưng, hữu ích cho phân tích thành phần hóa học vật liệu - Một số hính hiển vi điện tử quét hoạt động chân khơng siêu cao phân tích phổ điện tử Auger, dùng để phân tích tinh tế bề mặt Mặc dù khơng có độ phân giải tốt kính hiển vi điện tử truyền qua kính hiển vị điện tử quét lại có điểm mạnh phân tích mà khơng cần phá hủy mẫu vật hoạt động chân khơng thấp Fluorescent microscopy: Hiển vi huỳnh quang Kính hiển vi huỳnh quang kính hiển vi quang học sử dụng huỳnh quang lân quang phản xạ hấp thụ để nghiên cứu tính chất chất hữu chất vơ Thuật ngữ kính hiển vi huỳnh quang đề cập đến kính hiển vi sử dụng huỳnh quang để tạo hình ảnh Mẫu vật chiếu sáng ánh sáng bước sóng đặc biệt (hoặc nhiều bước sóng) hấp thụ bới chất huỳnh quang, khiến chúng phát ánh sáng có bước sóng dài (ví dụ, màu sắc khác so với ánh sáng hấp thụ) Ánh sáng chiếu tách từ huỳnh quang phát yếu nhiều thông qua việc sử dụng lọc quang phổ Bộ phận quan trọng kính hiển vi huỳnh quang nguồn ánh sáng( phổ biến đèn hồ quang xenon hay đèn thủy ngân, cao cấp đèn lượng cao LED laser), lọc kích thích, gương lưỡng sắc (hoặc tách chùm lưỡng sắc), lọc phát xạ Cấu tạo kính hiển vi huỳnh quang Các lọc gương lưỡng sắc đươhc lựa chọn để phù hợp với đặc điểm quang phổ kích thích phát xạ chất huỳnh quang sử dụng để đánh dấu mẫu vật Theo cách này, phân bố huỳnh quang (màu sắc) chụp ảnh thời điểm Hình ảnh nhiều màu sắc số loại huỳnh quang tạo cách kết hợp số hình ảnh đơn màu Kính hiển vi huỳnh quang sử dụng phổ biến kính hiển vi Epiflourescence, kích thích chất huỳnh quang dò tìm ánh sáng huỳnh quang thực thông qua đường truyền sáng (tức thông qua vật kính) Loại kính huỳnh quang sử dụng rộng rãi sinh học sở cho nhiều mẫu thiết kế kính hiển vi tiên tiến Cách thức hoạt động Kính hiển vi huỳnh quang sử dụng đèn thủy ngân đèn xenon để tạo ánh sáng cực tím Ánh sáng vào kính hiển vi huỳnh quang chạm vào gương lưỡng sắc – gương phản xạ dải bước sóng cho phép dải bước sóng khác qua Gương lưỡng sắc phản chiếu ánh snags cực tím đến mẫu vật Ánh sáng cực tím kích thích phát huỳnh quang từ phân tử mẫu vật Vật kính thu nhận ánh sáng có bước sóng huỳnh quang tạo Ánh sáng huỳnh quang qua gương lưỡng sắc lọc chắn (loại bỏ bước sóng khơng phải huỳnh quang), cuối vào thị kính để tạo thành hình ảnh Sơ đồ kính hiển vi huỳnh quang Kỹ thuật kính hiển vi huỳnh quang hữu dụng để quan sát cấu trúc đo lường hoạt động sinh lý sinh hóa tế bào sống Các thị huỳnh quang khác ln có sẵn để nghiên cứu nhiều hợp chất sinh lý quan trọng DNA, canxi, magie, natri, pH enzym Confocat microscopy: Hiển vi đồng tiêu Kính hiển vi đồng tiêu sử dụng kỹ thuật kính hiển vi quang học/huỳnh quang có khả tăng độ phân giải hệ quan sát nhờ sử dụng lỗ hội tụ (pinhole) chùm sáng quét hội tụ vào điểm nhỏ mặt phẳng tiêu (point illumination) Ánh sáng phản xạ tạo lại hình ảnh vật, ghi lại CCD camera đa số kính hiển vi đồng tiêu với độ phân giải tới khoảng 100 nm độ phóng đại 1500 lần thấp nữa, vượt xa kính quang học truyền thống vốn bị giới hạn tượng nhiễu xạ (200 nm) Gần đây, kính hiển vi đồng tiêu phát triển rộng rãi ngành khoa học vật liệu, nghiên cứu y sinh, khoa học tế bào, bán dẫn Nguyên lý hoạt động kính hiển vi huỳnh quang Kính hiển vi đồng tiêu chất dạng tân tiến kính hiển vi huỳnh quang Điểm khác biệt kính hiển vi đồng tiêu có độ phân giải lớn nhờ sử dụng lỗ hội tụ để loại ánh sáng khơng hội tụ hồn tồn (out-of- focus) chùm tia quét mẫu vật (do kích thước mũi chùm tia hội tụ nhỏ) Mẫu vật thường nhuộm chất huỳnh quang (fluorophores) cyanine, DAPI hay protein tổng hợp Chùm sáng sơ cấp phát từ đèn halogen, đèn thủy ngân điốt quang lượng cao (high-power LED) với kính hiển vi đồng tiêu truyền thống (confocal microscopy) hay từ đèn laser kính đồng tiêu quét laser (laser scanning confocal microscopy) Đôi lúc ánh sáng trắng cho qua lọc màu (filter) để lựa chọn ánh sáng đơn sắc có màu sắc cần thiết, thường từ 680 nm (đỏ hồng ngoại), 550 nm (xanh cây), 480 nm (xanh dương) 280 - 400 nm (dải cực tím) Việc lựa chọn bước sóng cho phép tạo huỳnh quang loại fluorophores khác Ánh sáng sơ cấp cho qua lỗ hội tụ sơ cấp để loại bỏ tia bị cầu sai (spherical aberration) hội tụ (out-of-focus).Sau đó, ánh sáng qua gương lọc/bán mạ (dichroic mirror) hội tụ điểm nhỏ mặt phẳng tiêu mẫu vật, với độ sâu trường ảnh (depth-of-field) vào khoảng vài trăm nanomet (do tạo ảnh ba chiều mẫu vật) Ánh sáng phản xạ ánh sáng huỳnh quang (ánh sáng thứ cấp) phản chiếu gương lọc (do có bước sóng dài bước sóng cho phép gương), qua thêm pinhole loại ánh sáng out-of-focus thứ hai trước vào phận ghi ảnh Các kính hiển vi đồng tiêu có thị kính quan sát kính quang học truyền thống, trang bị CCD camera CMOS để ghi ảnh, đặc biệt cần thiết mắt người mẫn cảm khơng quan sát tia laser hay tia cực tím Hình ảnh cuối vật ảnh ba chiều (khác với kính quang học truyền qua truyền thống ảnh hai chiều) Ở phiên đặc biệt, kính hiển vi đồng tiêu gắn thêm máy đo thời gian cực nhanh để ghi ảnh bốn chiều vật (cỡ nano giây tới mili giây) cho ứng dụng đo thời gian hoạt động tế bào (time-lapse microscopy) Kính hiển vi đồng tiêu dụng cụ quang học cho phép vượt xa khả quan sát kính hiển vi truyền thống, áp dụng để quan sát chi tiết vốn nhỏ để quan sát kính hiển vi quang học thơng thường (dưới 200 nm) Các ứng dụng bao gồm ngành y sinh học (nghiên cứu tế bào), bán dẫn (quan sát vật liệu dạng ảnh ba chiều) Kính hiển vi đồng tiêu có độ phân giải cao mà kết cấu điều khiển không phức tạp, giá thành rẻ kính hiển vi điện tử độ phân giải tốt nhiều so với kính hiển vi quang học thơng thường, xuống tới 10 nm biến thể độ phóng đại trung bình (1500 lần, phóng đại, độ phân giải giảm), đồng thời có độ sáng cao phân biệt tốt chi tiết nhờ sử dụng chất nhuộm màu Khả ghi ảnh ba chiều đo thời gian kính hiển vi đồng tiêu lợi điểm, cho phép nghiên cứu "chiều cao" chi tiết mạch bán dẫn hay thời gian hoạt động tế bào sống (các hoạt động nội bào, phân chia phát triển), đồng thời không yêu cầu phải phá hủy mẫu vật Một ưu điểm kính hiển vi đồng tiêu tốc độ quét nhanh (cỡ mili giây) so với kỹ thuật quét khác kính hiển vi điện tử truyền qua quét (cỡ giây), kính hiển vi điện tử quét (cỡ vài chục giây tới vài chục phút) kính hiển vi qt đầu dò (cỡ vài chục phút) Nhược điểm kính hiển vi đồng tiêu giá thành, rẻ so với loại biến thể hay kính hiển vi điện tử hay kính hiển vi qt đầu dò, mức đắt (trên 5,000 đôla Mỹ tùy vào loại biến thể thiết bị phụ trợ) tức khoảng 105 triệu VND so với kính hiển vi quang học thông dụng từ 16 đến 80 triệu VND Một điểm khác yêu cầu chất nhuộm màu cho q trình quan sát phần tử khơng phát xạ huỳnh quang nguyên sinh nhân tế bào, DNA, RNA, vi khuẩn, virut Điều làm ảnh hưởng tương đối lớn đến giá thành thiết bị hoạt động, đồng thời số trường hợp khơng thích hợp cho mẫu vật sống (mặc dù đa số trường hợp áp dụng với tế bào sống) khả phân giải kính hiển vi đồng tiêu, dù liệt vào loại tốt, thua xa thiết bị quan sát đại kính hiển vi điện tử hay kính hiển vi qt đầu dò (có khả phân giải tới cấp đơn phân tử, nguyên tử) Super-resolution microscopy STED: Hiển vi siêu phân giải STED Hiển vi siêu phân giải (Super-resolution microscopy) loại hiển vi quang học Các kĩ thuật siêu phân giải cho phép thu ảnh với độ phân giải không gian nhỏ giới hạn nhiễu xạ Chúng chia thành hai nhóm lớn: kĩ thuật siêu phân giải "true" "functional" ("true" super resolution, "functional" super resolution) Các kĩ thuật "functional" dùng kĩ thuật thí nghiệm thơng minh kết hợp với việc hiểu giới hạn đối tượng ảnh để dự lại ảnh siêu phân giải Kĩ thuật siêu phân giải "true" gồm phương pháp sử dụng siêu thấu kính Pendry (Pendry superlens), hiển vi quang học quét trường gần (near field scanning optical microscopy), hiển vi 4Pi hiển vi chiếu sáng có cấu trúc (structured illumination optical microscopy) SIM SMI Tuy nhiên, kĩ thuật có nhiều ứng dụng sinh học thuộc nhóm "functional" Các kĩ thuật siêu phân giải "functional" chia làm hai loại: Tất định: sử dụng hạt phát quang thường gặp kĩ thuật hiển vi huỳnh quang kích thích phi tuyến Các phương pháp nhóm gồm STED, GSD, RESOLFT and SSIM Ngẫu nhiên: sử dụng phân tử quang hoạt (sự phát quang điều khiển ánh sáng) điều khiển phát quang cách rời rạc Các phương pháp nhóm gồm SOFI, SPDM, SPDMphymod, PALM, FPALM, STORM dSTORM Bioassays: Các phép thư sinh học ELISA, Western blotting ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), gọi enzyme immunoassay (EIA), kỹ thuật sinh hóa sử dụng chủ yếu miễn dịch học để phát diện kháng thể kháng nguyên mẫu ELISA sử dụng cơng cụ chẩn đốn y học bệnh lý học thực vật, kiểm tra kiểm sốt chất lượng ngành cơng nghiệp khác nhau, chẳng hạn ứng dụng ELISA ngành công nghiệp thực phẩm Theo thuật ngữ đơn giản, kỹ thuật ELISA, lượng kháng nguyên gắn liền với bề mặt, sau kháng thể đặc hiệu cho vào bề mặt để liên kết với kháng nguyên Kháng thể liên kết với loại enzyme, cuối thêm chất để enzyme phân giải chất phát tín hiệu, phổ biến đổi màu chất hóa học Để thực phản ứng ELISA bao gồm kháng thể bắt cặp đặc hiệu với kháng nguyên cụ thể Các mẫu có số lượng kháng nguyên chưa biết cố định bề mặt vững chắc- giá thể rắn (thường polystyrene vi chuẩn) không đặc hiệu (thông qua hấp phụ lên bề mặt) đặc hiệu (thông qua chụp kháng thể khác đặc hiệu với kháng nguyên tương tự thí nghiệm ELISA sandwich) Sau kháng nguyên cố định, kháng thể phát thêm vào, tạo thành phức hợp với kháng nguyên Các kháng thể phát liên kết với loại enzyme, hay phát kháng thể thứ cấp liên kết với loại enzyme thơng qua liên kết cộng hóa trị phân tử sinh học Các phần kháng thể ELISA tương tự với phương pháp western blot Giữa bước, đĩa thường rửa dung dịch tẩy nhẹ để loại bỏ protein kháng thể không gắn Sau bước rửa cuối cùng, chất enzyme thêm vào để tạo tín hiệu nhìn thấy, giúp số lượng kháng nguyên mẫu Thiết bị cần thiết cho phản ứng ELISA - Đĩa ELISA pha rắn - ELISA Pipet - Hệ thống máy rửa - Máy đọc kết ELISA * Các loại ELISA a) Direct ELISA ( ELISA trực tiếp) Phương pháp ELISA trực tiếp coi loại đơn giản phương pháp ELISA, kháng nguyên (Antigen- Ag) hấp phụ lên nhựa, sau lượng lớn loại protein (thường albumin huyết bò- BSA) thêm vào để khóa tất vị trí liên kết khác Trong lúc đó, loại enzyme liên kết với kháng thể phản ứng riêng biệt, phức hợp enzyme- kháng thể sử dụng để hấp phụ kháng nguyên Sau phức enzyme- kháng thể dư thừa bị loại bỏ hết, phức hợp enzyme- kháng thể gắn với kháng nguyên lại giếng Bằng cách thêm vào chất enzyme, tín hiệu phát đại diện cho lượng kháng nguyên mẫu Tuy nhiên, so sánh ELISA trực tiếp với ELISA gián tiếp mặt kỹ thuật thấy, ELISA gián tiếp, bước tiến hành tương tự có khác biệt quan trọng có thêm bước bổ sung Sau kháng nguyên hấp thụ vào đĩa, sau bước cho BSA, kháng thể thêm vào kháng thể nhận diện kháng nguyên (kháng thể không gắn enzyme) Sau đó, kháng thể gắn enzyme chuẩn bị thêm vào đĩa nhằm phát kháng thể hấp phụ với kháng nguyên (còn ELISA trực tiếp, phức hệ kháng thể- enzyme trực tiếp hấp thụ với kháng nguyên) b) ELISA gián tiếp (Indirect ELISA) Phương pháp ELISA gián tiếp bao gồm hai bước ELISA liên quan đến hai trình gắn kháng thể sơ cấp kháng thể thứ cấp đánh dấu Kháng thể sơ cấp ủ với kháng nguyên sau ủ với kháng thể thứ cấp Tuy nhiên, việc dẫn đến tín hiệu khơng đặc hiệu xảy phản ứng chéo kháng thể thứ cấp Các bước ELISA gián tiếp: Các đĩa giếng ủ với kháng nguyên, rửa khóa BSA Thêm mẫu kháng thể vào rửa Enzyme gắn với kháng thể thứ cấp thêm vào rửa Thêm chất, enzyme kháng thể tạo tín hiệu màu huỳnh quang c) ELISA sandwich - Độ nhạy cao ELISA sandwich loại phổ biến kỹ thuật ELISA, hiệu việc phát kháng nguyên mẫu Hơn nữa, nhiều kit thương mại ELISA xây dựng dựa loại ELISA ELISA sandwich định lượng kháng nguyên hai lớp kháng thể (kháng thể bắt- capture phát hiện- detection) Các kháng nguyên định lượng phải chứa hai epitope kháng ngun có khả liên kết với kháng thể, với hai kháng thể hoạt động kỹ thuật sandwich Các kháng thể đơn dòng đa dòng sử dụng kháng thể bắt kháng thể phát hệ thống ELISA sandwich Kháng thể đơn dòng có epitope cho phép phát định lượng tốt khác biệt nhỏ kháng nguyên Một kháng thể đa dòng thường sử dụng kháng thể bắt giữ nhiều kháng nguyên tốt (Epitope- Quyết định kháng nguyên, vị trí kháng nguyên, nơi gắn với kháng thể) Quy trình ELISA sandwich khó khăn để tối ưu hóa cần phải kiểm tra kháng thể bắt cặp sai Điều đảm bảo kháng thể phát epitope khác protein đích để chúng khơng cản trở kháng thể gắn Các bước thực hiện: o Chuẩn bị bề mặt biết trước lượng kháng thể bắt gắn o Khóa vị trí bám khơng đặc hiệu bề mặt o Cho mẫu có chứa kháng nguyên lên đĩa o Rửa đĩa, để loại bỏ kháng nguyên không gắn o Thêm kháng thể đặc hiệu vào, gắn với kháng nguyên (do gọi "sandwich": kháng nguyên bị kẹp hai kháng thể); o Thêm kháng thể thứ cấp liên kết enzyme - kháng thể phát hiện, kháng thể liên kết đặc hiệu với vùng Fc kháng thể (không đặc hiệu) o Rửa đĩa, để liên kết enzyme- kháng thể không gắn bị loại bỏ o Thêm chất enzyme để tạo màu tín hiệu huỳnh quang điện hóa o Đo độ hấp thụ huỳnh quang tín hiệu điện giếng để xác định có mặt số lượng kháng nguyên  Phương pháp Western Blot Western Blot kỹ thuật phân tích sử dụng rộng rãi nhằm phát protein chuyên biệt mẫu mô hay dịch chiết xuất mô Phương pháp sử dụng điện di gel để phân tách protein nguyên vẹn cấu trúc 3D hay protein biến tính theo độ dài mạch polypeptide Protein sau chuyển lên màng (thường sử dụng màng nitrocellulose hay màng PVDF), chúng gắn kháng thể đặc hiệu với protein mục tiêu Điện di gel đưa vào hệ thống phân tích Western Blot nhằm giải vấn đề phản ứng chéo kháng thể Western Blot kỹ thuật lai protein với protein (Kháng nguyên – Kháng thể) Protein kháng nguyên phát qua phản ứng tạo màu phát huỳnh quang Các bước thực hiện: Bước 1: Xử lý mẫu Lấy mẫu từ tồn mơ hay mơi trường ni cấy tế bào Đầu tiên, xử lý mô rắn phương pháp học sử dụng máy nghiền, sử dụng máy đồng hóa siêu âm Những mẫu virus hay mẫu lấy trừ mơi trường ni cấy nguồn protein xác định Western Blot Thêm loại chất tẩy rửa, muối dung dịch đệm để ly giải tế bào hòa tan protein Bước 2: Điện di gel Điện di gel để phân tách protein mẫu Sự phân tách protein dựa điểm đẳng điện, khối lượng phân tử, điện tích phối hợp yếu tố Phương pháp điện di phổ biến điện di gel polyacrylamide có bổ sung sodium dodecyl sulfate (SDS) Phương pháp SDS – PAGE (điện di gel polyacrylamide có bổ sung SDS) giữ polypeptide trạng thái biến tính sau chúng xử lý với chất khử mạnh cấu trúc bậc 2, cấu trúc bậc Các mẫu nạp vào giếng gel Thường để lại giếng cho thị (marker) thang chuẩn ladder, sản phẩm thương mại có chứa hỗn hợp protein với khối lượng phân tử xác định nhuộm để tạo band màu nhìn thấy Khi điện thiết lập gel, protein bắt đầu di chuyển với tốc độ khác phụ thuộc vào khối lượng phân tử chúng Vận tốc khác protein (sự khác biệt độ di động điện di) tạo thành vạch khác giếng Bước 3: Chuyển protein gel lên màng lai Để protein phát kháng thể protein phải chuyển từ gel lên màng lai Phương pháp để chuyển protein gọi phương pháp thẩm tách điện sử dụng dòng điện để kéo protein từ gel lên màng PVDF màng nitrocellulose Các protein chuyển lên màng mà trì xếp gel Kết protein phơi lớp mỏng bề mặt để tiến hành xác định Bước 4: Xử lý màng lai (Blocking) Do kháng thể protein đích protein, nên thường thực bước để ngăn chặn liên kết màng kháng thể sử dụng để xác định protein mục tiêu Việc ngăn chặn liên kết không đặc hiệu cách đặt màng vào dung dịch protein loãng albumin huyết tương bò 3-5 % (BSA) sữa bột khơng béo Tris – Buffered saline (TBS) Protein dung dịch loãng gắn với màng tất vị trí mà protein đích chưa gắn vào Do kháng thể bổ sung vào, khơng chỗ bám màng ngoại trừ vị trí liên kết đặc hiệu với protein đích Điều làm giảm nhiễu sản phẩm cuối Western Blot, cho kết rõ ràng ngoại trừ tượng dương tính giả Bước 5: Q trình lai phát vị trí lai Để phát protein chuyên biệt, màng dò protein quan tâm kháng thể biến đổi có khả liên kết với enzyme thơng báo, enzyme kết hợp với chất tương ứng thúc đẩy phản ứng hấp thụ quang tạo màu Quá trình diễn gồm bước: - Màng lai cố định protein lai với kháng thể sơ cấp Kháng thể sơ cấp kháng thể đặc hiệu tao cho vật chủ hay môi trường nuôi cấy tế bào miễn dịch tiếp xúc với protein quan tâm - Sau rửa màng để loại bỏ kháng thể sơ cấp chưa liên kết, màng tiếp tục gắn kháng thể thứ hai (kháng thể thứ cấp) có gắn enzyme (thường sử dụng horseradish peroxidase) Tiếp tục ủ màng lai hỗn hợp phản ứng đặc hiệu với enzyme Đặt phim ngạy cảm với tia X lên màng lai để phát điểm sáng phát enzyme Có thể sử dụng nhiều phương pháp để phát kháng thể thứ cấp: sử dụng xạ hồng ngoại gần liên kết với kháng thể gắn chất huỳnh quang, sử dụng đánh dấu phóng xạ ... bề mặt ; đo học đơn phân tử ; kiểm soát chất lượng, kiểm tra khuyết tật vật liệu Hơn nữa, AFM ứng dụng nhiều lĩnh vực : công nghệ nano, công nghệ bán dẫn, dược phẩm, sinh học, công nghệ vật liệu.,v…v…...1 Dynamics Light Scattering (DLS): Phương pháp tán xạ ánh sáng động học Phương pháp tán xạ ánh sáng động học kỹ thuật v ật lý sử dụng để xác định cấu hình phân bố kích... tuyến Các phương pháp nhóm gồm STED, GSD, RESOLFT and SSIM Ngẫu nhiên: sử dụng phân tử quang hoạt (sự phát quang điều khiển ánh sáng) điều khiển phát quang cách rời rạc Các phương pháp nhóm gồm