thực hành hóa sinh thực phẩm về carbohydrate, protein, lipid, vitamin

thực hành hóa sinh thực phẩm về carbohydrate bao gồm phân biệt monosaccharide và disaccharide bằng thuốc thử Barfoed, định lượng amylose và amylopectin, định lượng đường khử bằng phương pháp so màu. Mục đích thí nghiệm, cách tiến hành, giải thích hiện tượng. Vẽ đồ thị tương quan giữa độ hấp phụ và nồng độ amylose

Chương 2: CARBOHYDRATE

2.1 Mục đích:

 Phân biệt giữa monosaccharide và disaccharide bằng thuốc thử Barfoed

 Nắm được phương pháp định lượng amylose và amylopectin

 Định lượng đường khử bằng phương pháp so màu với thuốc thử dinitrosalicylic acid

2.2 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất, nguyên vật liệu:

- Phễu thủy tinh

- Đũa thủy tinh

2.3.1 Phân biệt giữa monosaccharide và disaccharide (phản ứng Baroed)

 Tiến hành: chuẩn bị 6 ống nghiệm và đánh số (1A, 2A, 3A, 1B, 2B, 3B)

- Cho vào ống A (1A, 2A, 3A) mỗi ống 2 ml thuốc thử Barfoed; ống B (1B, 2B, 3B) mỗi ống 2 ml thuốc thử Fehling

- Ống 1 (1A; 1B) cho vào mỗi ống 2 ml dung dịch glucose 1%

- Ống 2 (2A; 2B) cho vào mỗi ống 2 ml dung dịch Maltose 1%

- Ống 3 (3A; 3B) cho vào mỗi ống 2 ml dung dịch Sucrose 1%

- Đun cách thủy các ống nghiệm trong 5 phút ( 75oC- 80oC ), làm lạnh, quan sát ống có trầm hiện tượng đỏ Sau đó lấy 3 ống A đun tiếp 8 phút ở 95oC Quan sát ống có hiện trầm đỏ

Hình 1 Bố trí dung dịch vào các ống nghiệm

 Kết quả, hiện tượng:

1B Dung dịch vàng cam, có trầm đỏ

2B Dung dịch xanh nhạt, có trầm đỏ

3B Dung dịch xanh đậm

Hình 2a Đun lần 1 Hình 2b Đun lần 2

 Giải thích

 Ống nghiệm A ( thuốc thử Barfoed: (Cu(CH3COO)2.H2O) )

- Khả năng khử của những monosaccharide có thể lớn hơn nhiều khả năng khử của disaccharide nên thay đổi môi trường base bằng môi trường acid yếu để phân biệt monosaccharide và disaccharide

- Khi đun ở nhiệt độ 75- 800C trong 5 phút: ống nghiệm 1A xuất hiện trầm đỏ

vì glucose ( monosaccharide) có tính khử mạnh hơn maltose ( disaccharide ) ống nghiệm 2A

- Sau khi đun tiếp ở nhiệt độ 950C:

+ Ống nghiệm 2A: Do maltose là disaccharide chứa 2 gốc α-glucopiranose liên kết với nhau bởi các nhóm OH ở vị trí C1 và C4 nên trong phân tử còn một nhóm OH glycoside và do vậy phân tử maltose có tính khử Tuy nhiên tính khử của maltose yếu hơn của glucose nên phản ứng giữa maltose với thuốc thử bafoed xảy ra chậm hơn

+ Ống nghiệm 3A: Do phân tử sucrose được hình thành bởi liên kết bởi hai nhóm glycoside trong vòng sáu C của glucose và vòng năm của fructose với nên nhau nên phân tử sucrose không có tính khử nên không cho phản ứng với thuốc thử barfoed

 Ống nghiệm B ( thuốc thử Fehling )

- Thuốc thử Fehling là hỗn hợp 2 dung dịch: dung dịch CuSO4 và muối Seignet với NaOH Khi trộn 2 dung dịch trên với nhau thì xảy ra phản ứng:

2NaOH + CuSO4→Cu(OH)2 + Na2SO4

- Sau đó dung dịch Cu(OH)2tác dụng với muối Seignet tạo muối phức hòa tan, dung dịch có màu xanh thẫm

- Muối phức trên là muối phức không bền

- Trong môi trường kiềm nung nóng, monosaccharide ở dạng enol-diol không bền, dễ dàng khử kim loại nặng như Cu2+ Mononosaccharide sẽ khử đồng II trong dung dịch Fehling thành đồng

Dựa trên sự tạo phức màu xanh của amylose với iod trong môi trường acid Sau

đó, đem đo độ hấp thụ ở bước sóng 620 nm Do trong thành phần tinh bột chủ yếu

là amylose và amylosepectin (chiếm từ 96,1 – 97%) nên có thể tính hàm lượng amylosepectin từ hàm lượng tinh bột và hàm lượng amylose trong mẫu

 Tiến hành: Xây dựng đường chuẩn với các nồng độ khác nhau của amylose

- Pha dung dịch amylose gốc với nồng độ 2 mg/ml trong dung dịch NaOH 1N

Từ dung dịch gốc, pha dãy dung dịch có nồng độ từ 0 – 2 mg/ml Bố trí thí

nghiệm như sau:

Ống nghiệm 1 2 3 4 5 6 7 Nồng độ dung dịch

Bảng 1 Xây dựng đường chuẩn các nồng độ khác nhau của amylose

- Lắc đều các ống nghiệm, để yên trong 20 phút rồi đo ở bước sóng 620 nm Vẽ

đồ thị tương quan giữa độ hấp thụ và nồng độ amylose

- Xác định độ ẩm của mẫu (bột gạo)

- Chuẩn bị mẫu: Cân chính xác 20 mg mẫu bột gạo Thêm 10 ml dung môi ethanol (lắc mạnh) để ly trích béo Đun cách thủy 60oC trong 30 phút Ly tâm

ở 6000 vòng trong 15 phút, lấy phần cặn lắng Lặp lại bước trích ly béo một lần nữa Phần cặn lắng thêm 4 ml NaOH 1N và 8 ml nước Đun cách thủy ở

95oC trong 30 phút

- Tiến hành đo:Dùng micropipette hút 100 µl dung dịch mẫu đã chuẩn bị ở trên cho vào ống nghiệm, thêm 5 ml dung dịch TCA 0,6% và 50 µl dung dịch Iod 0,01 N, lắc đều các ống nghiệm và để yên 20 phút Đo ở bước sóng 620 nm

X : nồng độ amylose được suy ra từ đồ thị chuẩn (mg/ml)

m : khối lượng của gạo ( theo căn bản khô ) Tính kết quả:

540 nm Dựa theo đồ thị dường chuẩn của glucose tinh khiết với thuốc thử DNS

sẽ tính được hàm lượng đường khử của mẫu nghiên cứu

 Tiến hành:

- Chuẩn bị dịch đường phân tích

+ Chiết đường: Lấy thịt quả chôm chôm thái nhỏ, cân 0,99g, giã nhuyễn và cho vào cốc 100 ml,thêm vào cốc 10 ml cồn 900 , đun sôi (3 lần), gạn lấy phần nước trong vào cốc mới Tiếp tục cho vào cốc với phần bã 10 ml cồn 800, đun sôi và gạn lấy phần nước trong cho vào cốc cùng với nước trong lần 1 Sau đó lọc dịch chiết và rửa bã bằng cồn 800 nóng

+ Chuẩn bị dịch đường: cho bay hơi cồn từ dung dịch vừa chiết đường bằng cách thủy nhẹ hoặc để ngoài môi trường đến khi dich cạn khô Cho 100 ml nước cất vào phận cạn để được dịch đường phân tích

+ Có thể chiết đường bằng nước cất trong trường hợp mẫu không chứa inulin và tinh bột Nếu chiết đường bằng nước cất thì cần dùng chì acetate 30% để khử tạp chất vì có lẫn protein Cần trung hòa mẫu bằng Na2CO3 đối với các mẫu quả có nhiều acid nhằm tránh quá trình thủy phân các oligosaccharide

- Xây dựng đường chuẩn

Chuẩn bị dung dịch glucose gốc 5 mg/ml

Chuẩn bị các dung dịch chuẩn như bảng sau:

Bước 1 Bước 2 Nồng độ

glucose (mg/ml)

ống

nghiệm

Dung dịch glucose

Nước cất (ml)

Thuốc thử Dinitrosalicyl

ic (ml)

Nước cất (ml)

Bảng 2 Xây dựng đường chuẩn với các nồng độ khác nhau của glucose Sau khi hoàn thành cho các chất ở bước 1 thì đun dung dịch sôi trong 5 phút và làm nguội

Khi dung dịch trong ống nghiệm nguội thì cho tiếp 7 ml nước như bước 2 và đo

độ hấp thu của dãy dung dịch chuẩn ở bước sóng 540 nm để được đường chuẩn

X: Hàm lượng đường khử từ kết quả đo (mg/ml)

m: khối lượng mẫu (mg)

Tính kết quả

Hàm lượng đường khử (mg%) = 0,6723 𝑥 100 𝑥 100

0.99 = 6,79 mg%

Chương 3: PROTEIN 3.1 Mục đích:

 Nắm được phương pháp định tính protein bằng phương pháp kết tủa

 Nắm được phương pháp định lượng protein bằng phương pháp quang phổ

3.2.Thiết bị, dụng cụ, hóa chất, nguyên vật liệu:

- NaOH 10% và bão hòa

- Dung dịch acid sulfosalicylic 10%

- Dung dịch NaCl 10% và NaCl bão hòa

a Kết tủa thuận nghịch:

 Nguyên tắc:

Sự hòa tan của protein phụ thuộc vào pH, lực ion, dung môi và nhiệt độ Khi thay đổi các điều kiện này, độ hòa tan của protein sẽ bị thay đổi, kết tủa thuận nghịch hoặc bất thuận nghịch

Kết tủa thuận nghịch: Một số tác nhân khi thêm vào dung dịch keo protein có khả năng kết tủa protein mà không mất đi các hoạt tính và khi loại bỏ các tác nhân này, protein lại có khả năng hòa tan và tạo dung dịch keo Hiện tượng này được gọi là kết tủa thuận nghịch và được ứng dụng để chiết tách thu nhận enzyme và protein

 Tiến hành: Tách 2 loại protein trứng albumin và globulin bằng cách sử dụng

lực ly tâm 20 phút 5000 vòng, sau đó chuẩn bị 4 ống nghiệm và đánh số (1, 2,

3, 4)

- Ống 1: Cho vào ống một ít globulin và 4 ml NaCl 10%

- Ống 2: Cho vào ống 2 ml albumin và 2 ml (NH4)2SO4 bão hòa

- Ống 3: Cho vào ống 2 ml albumin, 1 ml NaCl bão hòa và 1 ml (NH4)2SO4

Hình 1 Bố trí dung dịch vào các ống nghiệm

Ống nghiệm

- Ống nghiệm 2: Protein trong lòng trắng trứng có cả albumin và globulin Đây là những protein mang acid yếu, ở điều kiện bình thường, trong trạng thái dung dịch, phân tử Protein tích điện (-), bên ngoài được bao bởi một lớp áo nước với đầu (+) quay vào và đầu (–) quay ra, nên lơ lửng trong môi trường

Khi cho các muối (NH4)2SO4 có nồng độ cao vào, thì muối sẽ tạo các ion

NH4+ và SO42- Các ion này sẽ trung hòa các tiểu phân tử protein trứng đồng thời lấy lớp áo nước bên ngoài tạo ra hiện tượng tủa

- Ống 3: Có kết tủa trắng đục vì NaCl và (NH4)2SO4 là những chất điện giải mạnh tạo các ion trung hòa điện tử của các phân tử protein, đồng thời lấy lớp áo nước bên ngoài nên gây ra hiện tượng tủa

- Ống 4: Khi cho các axit vô cơ mạnh vào, các axit này có tính háo nước, sẽ lấy nước của dung dịch protein trứng làm cho protein bị biến tính, protein

bị khử nước và trung hòa điện tích gây tủa Khi cho NaOH 10% vào tạo môi trường kiềm mạnh, protein còn tích điện nên không tạo tủa làm tủa tan Khi cho tác dụng với Cu2+ sẽ cho màu tím

b Kết tủa bất thuận nghịch

 Nguyên tắc: Kết tủa bất thuận nghịch của protein thường liên quan đến sự biến

tính Khi cấu trúc bậc 2,3,4 bị phá vỡ vĩnh viễn, protein sẽ mất các tính chất lý hóa và các chất năng sinh học Các yếu tố gây kết tủa bất thuận nghịch protein

bao gồm: acid hữu cơ, acid vô cơ đậm đặc (H2SO4, HCl, HNO3,…), muối kim

- Ống 3: đun cách thủy 3-5 phút lấy ra quan sát

Sau đó cho vào 3 ống 4 ml NaCl 10%, khảo sát độ tan của trứng

Hình 2a: Trước khi cho NaCl 10% Hình 2b: Sau khi cho NaCl 10%

 Hiện tượng và giải thích:

 Trước khi cho NaCl 10% :

- Ống 1: có kết tủa trắng, dung dịch có màu trong suốt lớp trên Khi cho các acid hữu cơ vào dung dịch protein trứng sẽ tạo nên môi trường axit yếu, có khả năng gây tủa

- Ống 2: dung dịch chia làm 2 lớp, lớp trên vẫn đục,lớp dưới trong suốt AgNO3 là muối kim loại nặng có khả năng tạo tủa và làm biến tính protein do sự phá hủy sâu sắc cấu trúc bậc 2,3 của phân tử protein

- Ống 3: kết tủa trắng Khi đun nóng cấu trúc bậc 2,3,4 của protein bị phá vỡ, protein bị biến tính

 Khi cho NaCl 10% vào:

- Ống 1: Kết tủa trắng không tan

- Ống 2: Kết tủa màu nâu tím

- Ống 3:Lớp trên trong suốt, lớp dưới kết tủa trắng

2.3.2 Định lượng protein bằng phương pháp biuret

 Nguyên tắc: Trong môi trường kiềm, các hợp chất có chứa nhóm

–CO-NH-, -CS-–CO-NH-, -C(NH)2 sẽ có phản ứng với Cu2+ tạo phức màu tím Cường

độ màu tỉ lệ thuận với nồng độ protein trong dung dịch

 Tiến hành: Chuẩn bị dãy dung dịch protein có nồng độ tăng dần từ 0-20

mg/ml từ dung dịch protein gốc (BSA 20 mg/ml) với 6 ống nghiệm như

Hình 3 Đường chuẩn BSA

 Nắm được cách xác định chỉ số peroxide và chỉ số axit

 Nắm được phương pháp khảo sát đặc tính của lecithin

4.2.Thiết bị, dụng cụ, hóa chất, nguyên vật liệu:

 Thiết bị:

- Bếp cách thủy

- Máy li tâm

 Khái niệm: chỉ số peroxide đặc trưng cho sự ôi hóa của chất béo Chỉ số

peroxide là số gam iod được giải phóng ra khi cho dung dịch KI tác dụng với

100 gam chất béo dưới tác dụng của các peroxide có trong chất béo

 Nguyên tắc:

Trong không khí hoặc trong điệu kiện có oxi, các axit béo đặc biệt là các axit béo không no dễ dàng bị oxy hóa tạo thành các peroxide, gây ra hiện tượng ôi hóa chất

béo Để khảo sát mức độ ôi hóa chất béo, khi cho KI tác dụng với peroxide, giải phóng ra iod, sau đó chuẩn lượng iod bằng dung dịch thiosulfat natri

 Tiến hành

Chuẩn bị 2 bình cầu

- Bình 1 : Cân 3g dầu ăn vào bình cầu, thêm vào bình 20ml acetic và 10ml chloroform (theo tỉ lệ 3:2 theo khối lượng), lắc đều cho dầu hòa tan hoàn toàn Sau đó cho thêm 5ml dung dịch KI bão hòa rồi để yên 30 phút trong tủ tối, lấy ra tiếp tục cho 30 ml nước cất và đem chuẩn độ bằng Na2S2O3 0,01N đến khi dung dịch có màu vàng, sau

đó thêm 1ml dung dịch hồ tinh bột 1% và chuẩn tiếp đến khi hết màu xanh

- Bình 2: (mẫu trắng) Cho 3ml nước cất vào bình cầu, thêm vào bình 20ml acetic và 10ml chloroform (theo tỉ lệ 3:2 theo khối lượng), lắc đều Sau đó thêm 5ml dung dịch KI bão hòa, thêm vào 1ml dung dịch hồ tinh bột 1% và chuẩn đến hết màu xanh

 Kết quả chuẩn độ:

+ 15ml Na2S2O3 0,01N được dùng để chuẩn độ chất béo (bình 1 )

+ 3,6ml Na2S2O3 0,01N được dùng để chuẩn độ mẫu trắng (bình 2 )

 Tính toán kết quả: Chỉ số peroxide (Px) biểu thị bằng số gam iod thoát ra từ 100g chất béo

Trong đó:

V1 : dung dịch Na2S2O3 0,01N dùng để chuẩn độ mẫu chất béo (ml)

V2: Dung dịch Na2S2O3 0,01N dùng để chuẩn độ mẫu trắng (ml)

N: Nồng độ đương lượng của dung dịch Na2S2O3

G: Trọng lượng mẫu phân tích (g)

- Cho vào mỗi bình 5ml acol tuyệt đối và 5ml ether ethylic,cho thêm vài giọt

phenolphthalein, dùng KOH trung hòa hỗn hợp đến khi xuất hiện màu hồng nhạt

- Cho thêm vào hỗn hợp 1g dầu ăn và tiếp tục dùng KOH 0,01N chuẩn độ đến khi màu hồng bền trong 30 giây Đọc thể tích KOH

- Đối với mẫu trắng : cho 1ml nước cất vào bình, dùng KOH 0,01N chuẩn độ đến khi màu hồng bền trong 30 giây Đọc thể tích KOH

 Kết quả: Thể tích KOH dùng để chuẩn độ

0,56mg acid béo tương ứng với 1ml KOH 0,01N

k: hệ số hiệu chỉnh nồng độ dung dịch KOH 0,01N (nếu có)

m: khối lượng mẫu phân tích (gam)

4.3.3 Khảo sát đặc tính của lecithin

 Nguyên tắc: Lecithin là lipid có chứa gốc phosphate (phospholipid), trong thành

phần có nhóm phân cực alcol amincholin, là nhóm có tính bazo mạnh Chiết tách lecithin trong long đỏ trứng bằng alcol và khảo sát đặc tính của lecithin cũng như nhóm alcol amincholin

 Tiến hành:

Cho ½ lòng đỏ trứng đã đánh nhuyễn vào bình tam giác 100ml, thêm 10ml alcol tuyệt đối,khuấy đều, đun cách thủy ở 75-80 , tiếp tục khuấy đều trong thời gian 10 phút (là thời gian để rút tách lecithin) Trong trường hợp lượng alcol bị bốc hơi hết thì thêm đúng lượng ancol ban đầu Sau đó lọc hỗn hợp và thu dịch lọc Sau đó dùng dịch chiết bố trí thí nghiệm sau:

Hình 1 Bố trí dung dịch vào hai ống nghiệm

 Hiện tượng và giải thích:

- Ống nghiệm 1: dung dịch không đổi màu vì lecithin (có mhóm phân cực alcol amincholin) nên không tan trong acetone (không phân cực)

- Ống nghiệm 2: dung dịch có màu trắng xám do lecithin tan trong nước (dung môi phân cực) dẫn đến sự chuyển màu của dung dịch

 Kết luận: Nhờ đặc tính vừa ưa nước, vừa kỵ nước nên phospholipid tham gia

trong việc đảm bảo tính thấm một chiều của các màng cấu trúc dưới tế bào

Chương 5: VITAMIN

I Mục đích:

 Nắm được phương pháp định tính vitamin B1 bằng phản ứng với thuốc thử diazo

 Nắm được phương pháp định lượng vitamin C

II Thiết bị, dụng cụ, hóa chất, nguyên vật liệu:

 Dụng cụ:

- Ống nghiệm

- Bình định mức 100 ml

- Bình tam giác

III Nội dung

1 Định tính vitamin B 1 bằng phản ứng với thuốc thử diazo

 Tiến hành: Cho vào ống nghiệm lần lượt 0,5 ml dung dịch vitamin B1 + 0,5 ml dung dịch acid sulfanilic 1% + 0,5 ml dung dịch natri nitric 5% + 10 giọt dung dịch natri carbonate 10%, lắc đều

 Kết quả: dung dịch trong ống nghiệm có màu đỏ cam

 Giải thích: Trong môi trường kiềm thiamin (vitamin B1) phản ứng với thuốc thử diazo sẽ cho phức màu cam hoặc đỏ

2 Định lượng vitamin C

 Tiến hành:

 Với sản phẩm dạng lỏng: Lấy 5 ml nước cam (nước quýt) cho vào bình định mức 100 ml, thêm vào bình 20 ml HCl 1% và định mức bằng acid oxalic 1% đến vạch định mức, lắc đều Nếu thấy có cặn thì lọc trong dung dịch Hút 10 ml dịch chiết và chuẩn độ bằng dung dịch thuốc thử 2,6 dichlophenolindophenol cho tới khi xuất hiện màu hồng nhạt

 Với sản phẩm dạng rắn: Cân khoảng 2g vỏ cam, thái nhuyễn, ngâm trong 20 ml HCl 1%, sau đó giã nhuyễn và cho vào bình định mức, thêm

3 ml chì acetate 30% và định mức bằng acid oxalic 1% đến vạch, để yên

10 phút và lọc Hút 10 ml dịch chiết và chuẩn độ bằng thuốc thử 2,6 dichlophenolindophenol cho tới khi xuất hiện màu hồng nhạt

v: thể tích mẫu đem chuẩn độ (ml)

m: lượng mẫu cân (g)