TẠP CHÍ KHOA HỌC ĐHQGHN KHTN & CN T.XXIII, s ố 2007 ỨNG DỤNG KỶ THUẬT PCR PHỤC v ụ KIEM đ ị n h SALMONELLA\ TRONG NƯỚC MẶT Ô NHIỄM L ê Đ ứ c M n h , N g u y ễ n T h ị H n g G ia n g Viện Công nghiệp Thực p h ẩ m , 301-N guyễn Trãi, T h a n h X u â n , H N ội Tóm tắ t V ấn đề ô n hiễm nưốc m ặt, đặc biệt ô nhiễm nưỏc th ả i củ a n h m áy v;à nước th ả i sin h h o t đ a n g v ấ n đề xúc tạ i V iệt N am K hu h ệ vi sin h v ậ t nưốc ô nhiễm r ấ t đa d ạn g c h ủ n g loại gây n h iều khó k h ă n cho việc đ n h giá tiêm vi sinh vật Với S a lm o n ella , kỹ th u ậ t vi sinh th n g quy cho tỷ lệ dương tín h gi.ả cao n h iều vi sin h v ậ t có th ể th ể h iện n h ữ ng tín h n h S a lm o n e lla k h i đ án h g iá Bài báo đề cập so sá n h k ế t q u ả kiểm định tiêu S a lm o n e lla th e o kỹ th u ậ t thườn.g quy PCR K ết q u ả cho th ấ y kỹ th u ậ t PCR có th ể ứ n g d ụ n g h ữ u h iệu cho điộ đặc h iệu cao k h i kiểm đ ịnh tiê u S a lm o n ella tro n g k h u hệ phứ c tạp T uy n h iê n , cẩn trọ n g cần th iế t k h i đ án h giá k ế t th u n h ậ n k h ả n ăn g dương t ín h giả hữ u có m ặ t củ a k h u hệ vi sinh v ậ t đ a d n g có th ể làm giảm độ n h y phương p h áp T ro n g trư n g hợp nghi vấn, PCR có th ể sử d ụ n g n h te s t k h ả n g đ ịnh S a lm o n ella T k h ó a : N ước m ặ t, ô nhiễm , vi sin h vật, S a lm o n ella , P C R Mở đầu H iện n ay v ấn đề ô n h iễm sông ngòi, ao hồ, đặc b iệ t ô n h iễm nước th ả i củ a n h m áy nước th ả i sin h h o t đ an g v ấn đề xúc tạ i V iệt N am nhiễm từ nước th ả i k h ông ả n h hư ởng tối sức khỏe cộng đồng m ả n h hư ởng trự c tiếp đ ến sản x u ất, đặc b iệt tạ i n h m áy sản x u ấ t ch ế biến th ự c p h ẩm Để đảm bảo môi trư ng sả n x u ấ t th ô n g sô' vệ sin h cần q u a n tâ m , tro n g có thơng số c h ấ t lượng nưóc trưốc sa u xử lý M ột nhóm vi sin h v ậ t q u a n tâm nhiều Sa lm o n ella k h ả n ă n g gây b ện h cho người v ậ t nuôi S a lm o n e lla trự c k h u ẩ n G ram âm , kích thưỏc tru n g b ìn h 3,0x0,5nm , có n h iều tiêm m ao x u n g q u a n h th â n (trừ s g a llin a ru m s p u llo ru m gây bện h gà vịt) G iông n h vi k h u â n đường ru ộ t khác, S a lm o n ella th u ộ c nhóm h iếu kỵ k h í tu ỳ tiện, v ề tín h c h ấ t sin h lý, S alm onella k hông lên m en đưòng lactoza n h n g lên m en đưòng glucoza sin h hơi, sử dụng c itra t môi trư n g S im m ons, c a ta la z a (+), oxidaza (+), ly sin decacboxylaza (+), ONPG (+), u re az a (-), RM (+), VP(-), H 2S (+) [2] D ựa trê n cấu trú c k h n g nguyên, S alm onella 12 13 ủ h g dụng kỹ Ihuật PCR phục vụ kiếm dịnh ch ia th n h nhóm typ h u y ết th a n h khác n h a u Ngưòi ta tìm g ần 70 yếu tơ" k h n g n g u y ên S a lm o n ella K ết hợp vối k h n g n guyên H có m ặ t h ầ u h ế t S a lm o n e lla , có th ể th u trê n 1500 typ h u y ế t th a n h K h án g n guyên K có s typ h i v s p a ty p h i [2] S a lm o n ella typ h i s p a r a ty p h i tác n h â n gây bệnh thư ng h n [1] K h u hệ vi sin h v ậ t nước m ặ t ô nhiễm r ấ t đa d n g ch ủ n g loại gây khó k h ă n cho việc đ n h giá tiê u vi sin h vật Với S a lm o n e lỉa , kỹ th u ậ t vi sinh th ò n g quy cho tỷ lệ dương tín h giả cao n h iều vi sin h v ậ t có th ể th ể n h ữ n g tín h n h S a lm o n e lla k h i đ n h giá Bài báo n ày đề cập tới việc ứ n g d ụ n g kỹ th u ậ t sin h học p h ầ n tử n h ằ m n â n g cao độ ch ín h xác x ét n ghiệm vệ sin h môi trư ng c h ấ t lượng nước Nguyên vật liệu phương pháp 3.1 M au phân tich M â u nưỏc m ặ t lấy hồ, ao thuộc n h iều địa điểm k h ác n h a u th n h phô' H Nội (B àng 1) Các m ẫu lưu trữ đầy kín tro n g ống 50 ml bảo q u ản tro n g điều kiện lạ n h (tro n g đá) k h i p h â n tích vi sin h (sau 3h) Bảng Danh >ách mẫu nưóc mặt nhiẫm tr&n địa bàn Hà Nội sử dụng nghiên cứu Mẫu Địa điểm lấy mẫu Hổ Làng Phùng Khoan, (hổ 1) HỔ Làng Phùng Khoan , (hổ 3) HỔ ỏ gần nhà máy bóng đèn phích nước Rạng Đông Sông Kim Giang Hổ Linh Đàm (hổ 1) Hổ Linh Đàm (hổ 2) Hổ Linh Đàm (hổ 3) Sông Tô Lịch (đoạn Đại Kim) Nước Cống Định Công 10 HỔ Định Công (hổ 2) 11 Hổ Định Công (hổ 3) 12 Sông Tô Lịch (đoạn cẩu Mới) T a p c h i K h o a h ọ c D H Q G H N K H T N & C N T.XXIII S Ổ I 0 14 Lè Dức M ạnh Nguyẻn Thị Hưcmg G iaing 3.2 Xác đ ịn h S alm on ella tron g nước m ặt ô n h iễm phương pháp thường quy P hương p h p xác đ ịn h S a lm o n ella th n g quy bao gồm bước tă n g sin h , tănig sin h chọn lọc, p h â n lập n h ậ n diện, bưốc tă n g s in h , 25 m l m ẫu chuyển vào tuii PE vơ trù n g sa u bổ su n g 225 ml du n g dịch BPW , đồng n h ấ t m ẫ u ủ 37°c B ưức tă n g sin h chọn lọc th ự c h iện sau 18 - 24 b ằ n g cách ch u y ển ,lm l dịch t ă n g sin h đ ã trộ n đ ều sa n g 10 m l mơi trư ò n g tả n g sin h R a p p a p p o rt-V assliad is (RV) S au đĩó, ch ú n g ủ ỏ 42 ± 0,2°c tro n g 12 -24 giò T iếp th e o , k h u ẩ n lạc đơn p h â n lâ p b ằn g que cấy từ môi trư n g tă n g sin h chọn lọc lên đ ĩa môi trư n g chọn lọc p h â n b iệ t đặc trư n g cho S a lm o n e lla (MLCB [3]) T ấ t đ ĩa môi trư n g s a u k h i cấy ù °c tro n g 22 - 24 giò T rê n mơi trư ng M LCB k h u ẩ n lạc S a lm o n e lla có m àu đen C âc k h u ẩ n lạc có đặc điểm n h trê n k h ẳ n g đ ịn h b ằ n g th n g h iệm sin h hố tr ê n mơi trư ng T S I LIM Môi trư n g T S I có th ể xác đ ịn h k h ả n ă n g lên m en loại đường glucoza, lactoza, sucroza k h ả n ă n g sin h k h í H 2S M ôi trư ng LIM xác đ ịnh k h ả n ăn g p h ả n ứ ng lysin, Indol, k h ả n ă n g dịch chuyển N goài ra, để so s n h phương p h áp , tro n g n g h iên cứu này, k h u ẩ n lạc c ũ n g kiểm tr a b ằn g kỹ t h u ậ t PCR 3.3 Xác định S a lm on elỉa tron g nước m ặt ô n h iêm b ằng k ỹ th u ậ t PCR T rong phương p h p này, m ẫu ph ẩm làm giàu khơng chọn lọc, sau sin h khối vi sin h v ậ t sử d ụ n g làm khuôn cho P C R sử d ụ n g cặp mồi đặc h iệu cho S a lm o n ella T ương tự n h trê n , h ệ vi sin h v ậ t làm giàu b ằ n g cách chuyển 25m l m ẫu san g tú i P E vô trù n g , bổ su n g 225 m l d u n g dịch BPW , đồng n h ấ t m ẫu ủ °c tro n g 18 - 24 Vì S a lm o n e lla vi k h u ẩ n G ram âm , có th n h t ế bào tương đối m ỏng có th ể dễ d àn g bị p h h ủ y đ u n sôi 0 °c tro n g 15 p h ú t C anh trư ng đ u n sôi d ù n g trự c tiế p làm k h u ô n cho p h ả n ứ ng PC R T rư ờng hợp không tiến h n h p h ả n ứng ngay, ADN k h u ô n bảo q u ả n tro n g tủ -20°c Các mồi SaỊm (5’GCTGCGCGCGAACGGCG AAG-31) S alm (5’-TCCCGGCAGAGTTCCCATT 31) sử dụng H mồi n ày n h â n m ột đoạn 389 cặp bazơ củ a p h ầ n bảo th ủ tro n g gen invA, m ột gen q u a n trọ n g củ a S a lm o n ella spp cho q u trìn h x âm n hiễm t ế bào (inv= inva8Ìve) [5] C ặp mồi n ày đ ã n h k h o a học Ita lia sử d ụ n g trước để p h t S a lm o n e lla spp.[5] C hu trìn h n h iệ t củ a p h ả n ứ n g P C R bao gồm bước biến tín h °c tro n g p h ú t k ế tiế p 35 chu kỳ n h iệ t (9 °c - 40 giây, 62°C- 40 giây, 72°C- 40 giây) bưóc h o àn th iệ n °c tro n g p h ú t S ả n p h ẩ m PC R p h â n tách trê n gel ag aro se 1,5% với d u n g dịch đệm lxT A E h iệ u đ iệ n th ế 100V v cường độ dòng điện 80mA Gel sau n h u ộ m b ằn g d u n g dịch e th id iu m brom ide 0,5 mg/1 q u an sát n h sá n g cực tím T p c h i K h o a h ọ c Đ H Q G H N K H T N & C N T XX1II S Ổ I 2007 15 Cing dựng kỹ thuẠt PCR phục vụ kiếm dịnh Kết bàn luận 4.1 So sánh k ết kiểm định S alm on ella thường quy PCR m ẫu phẩm Các m ẫu nước m ặt bị ô n hiễm (B ảng 1) p h â n tích đồng thòi b ằn g kỹ th u ậ t kiểm địn h S a lm o n e lla thư ờng quy bằn g phương ph áp PCR n h trìn h bày K ết q u ả trìn h bày tro n g B ảng T ấ t 12 m ẫu p h â n tích cho k ế t dương tín h k h i làm g iàu RV, tu y n h iê n có m ẫu cho k ế t dương tín h trê n MLCB Đ iểu n ày p h ầ n cho th ấ y phức tạp hệ vi sin h v ậ t nưốc m ặt bị ô nhiễm T h ô n g thường, tro n g kiểm đ ịn h thự c phẩm , tầ n suâ't dương tín h với RV tương đối th ấ p v n h ữ n g m ẫu dương tín h với RV th ể nguy cao Chỉ n h ữ n g k h u ẩ n lạc cho k ế t q u ả dương tín h trê n M LCB ph ân tích tiếp b ằ n g TSI LIM n h kỹ th u ậ t p h â n tích S a lm o n ella thư ờng quy yêu cầu K ết q u ả kiểm tr a b ằn g TSI LIM trù n g khớp với k ế t q u ả m môi trư ng M LCB dem lại N hư vậy, th eo p h ân tích thư ng quy có th ế k ế t lu ậ n có m ẫu dương tín h với S a lm o n e lla , m ẫu 3, 7, 12 Ngoài kỹ th u ậ t thư ờng quy, m ẫu nước p h â n tích đồng thời bằn g kỹ th u ậ t PCR K ết kiểm đ ịn h b ằn g PCR cho th ấ y có m ẫu nước dương tín h với S a lm o n ella trù n g với k ế t th eo đ án h giá th òng quy (H ình 1, B ảng 2) K hác b iệt n h ấ t m ẫu số cho k ế t âm tín h xác đ ịn h b ằ n g PCR n h ng dương tín h với đ n h giá th n g quy Đ iểu n ày cho th độ tương đồng cao h phương pháp T hông th n g phương p h áp PCR đ án h giá có độ tin cậy cao [4, 5] p h ân tích b ằn g PCR sê giảm th iể u sơ" lượng dương tín h giả N hữ ng m ẫu nhiễm S a lm o n e lla n h ữ n g m ẫu nước từ Hồ L inh Đ àm , Sông Tô Lịch (đoạn Đ ại Kim), sông Tô Lịch (đoạn c ầ u Mới) M c 10 11 12 N r i 1018 51239 ' 344' * wmm • • Hỉnh Sản phẩm PCR sử dụng mối Salm3 Salm4 đôi với mẫu nước mặt bị ô nhiễm sau làm giàu không chọn lọc M- thang ADN chuẩn (1Kb, Invitrogen); c - Chủng Salmonella chuẩn; 1, 2, 3,4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,12 - mẫu nước vùng khác nhau; N - sản phẩm PCR khơng có ADN khn Tạp c h i K hoa h ọ c Đ H Q C H N , K tĩT N & C N , T.XXIII, s ố ì 2007 Lẽ Đức Mạnh Nguyẻn Thj Hương Giamg 16 Bảng Kết phân tích Salmonella mẫu nước mặt nhiễm ò nhiổu vùng khác thuộc địa Hà Nội Phương pháp vi sinh + - nd + + ♦ + Chuyển động nd ơ>bệ Indol mH * Kết luàn theo PÒR Lysine ♦ Kết luận theo kỹ thuật vi sinh Sucrosa Glucoza Mẳu LIM Lactoza > £ MLCB TSI nd nd nd nd nd nd - - nd nd nd nd nd nd - - + - - + + - + Salmonella - - nd nd nd nd nd nd nd - - - nd nd nd nd nd nd nd - - - nd nd nd nd nd nd nd - - ♦ + ♦ - - + + - + Salmonella Salmonella ♦ + ♦ - - + + - + Salmonella Salmonella + - nd nd nd nd nd nd nd - - 10 + - nd nd nd nd nd nd nd - - 11 + - nd nd nd nd nd nd nd - - 12 + + + - - + + - + Salmonella Salmonella Chú thích: ‘ nd’ - khơng tiến hành kiểm tra; - âm tinh; V - Dương tỉnh 4.2 Khả nãng sử dụng phương pháp PCR test khẳng định SaLmonella ứ n g d ụ n g P C R tro n g p h â n tích nước m ặ t ô n hiễm k h ô n g p h ải ho àn to àn k hơng có sai 8ố M ột s ố m ẫ u p h ẩm đem lại n h ữ n g b ă n g k h ô n g đặc h iệ u có th ể ản h hưởng tới k ế t q u ả đ n h giá (H ình 1, b ă n g 2, 3, 11) Sự có m ặ t củ a n h ữ n g b ăn g n ày lý th u y ế t cố th ể làm giảm độ n h y củ a phương ph áp (cạnh tr a n h k h u ô n tro n g PCR) th ậ m chí dương tín h giả (nếu sản p h ẩm khơng đặc h iệu có cù n g kích thước với sản phẩm đích) T ro n g trư n g hợp n ghi v ấn có th ể tiến h n h làm g iàu chọn lọc áp dụ n g kỹ th u ậ t PC R để k h ẳ n g đ ịn h n h ữ n g k h u ẩ n lạc nghi ngờ N h ằm k iểm tr a k h ả n ăn g khẳng định phương pháp PCR tiến h àn h th nghiệm m ột loạt k h u ẩ n lạc dương tín h trê n mơi trư n g M LCB sau kiểm tr a đồng thời bằn g TSI, LIM b ằn g kỹ t h u ậ t PCR Để th ự c h iện điểu này, k h u ẩ n lạc m ầ u đen có h ìn h th i tương đốì k h ác n h a u trê n m ôi trư n g M LCB cùa m ẫu sô' k iểm tra K ết q u ả kiểm tra sin h hóa củ a k h u ẩ n lạc đ ều đư a đến k ế t q u ả tương đồng với ch ủ n g ch u ẩn có T p c h i K h o a h ọ c Đ H Q G H N K H T N