Nghiên cứu nuôi cấy sinh khối rễ tơ sâm dây (Codonopsis sp.) trong hệ thống Bioreactor (LV thạc sĩ)

Nghiên cứu nuôi cấy sinh khối rễ tơ sâm dây (Codonopsis sp.) trong hệ thống Bioreactor (LV thạc sĩ)Nghiên cứu nuôi cấy sinh khối rễ tơ sâm dây (Codonopsis sp.) trong hệ thống Bioreactor (LV thạc sĩ)Nghiên cứu nuôi cấy sinh khối rễ tơ sâm dây (Codonopsis sp.) trong hệ thống Bioreactor (LV thạc sĩ)Nghiên cứu nuôi cấy sinh khối rễ tơ sâm dây (Codonopsis sp.) trong hệ thống Bioreactor (LV thạc sĩ)Nghiên cứu nuôi cấy sinh khối rễ tơ sâm dây (Codonopsis sp.) trong hệ thống Bioreactor (LV thạc sĩ)Nghiên cứu nuôi cấy sinh khối rễ tơ sâm dây (Codonopsis sp.) trong hệ thống Bioreactor (LV thạc sĩ)Nghiên cứu nuôi cấy sinh khối rễ tơ sâm dây (Codonopsis sp.) trong hệ thống Bioreactor (LV thạc sĩ)Nghiên cứu nuôi cấy sinh khối rễ tơ sâm dây (Codonopsis sp.) trong hệ thống Bioreactor (LV thạc sĩ)Nghiên cứu nuôi cấy sinh khối rễ tơ sâm dây (Codonopsis sp.) trong hệ thống Bioreactor (LV thạc sĩ)Nghiên cứu nuôi cấy sinh khối rễ tơ sâm dây (Codonopsis sp.) trong hệ thống Bioreactor (LV thạc sĩ)Nghiên cứu nuôi cấy sinh khối rễ tơ sâm dây (Codonopsis sp.) trong hệ thống Bioreactor (LV thạc sĩ)Nghiên cứu nuôi cấy sinh khối rễ tơ sâm dây (Codonopsis sp.) trong hệ thống Bioreactor (LV thạc sĩ)

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM VÀ ĐÀO TẠO KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VN VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT - - NGUYỄN ĐÌNH TRỌNG NGHIÊN CỨU NI CẤY SINH KHỐI RỄ TƠ SÂM DÂY (Codonopsis sp.) TRONG HỆ THÔNG BIOREACTOR LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội, 2015 BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM VÀ ĐÀO TẠO KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VN VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT - - LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY SINH KHỐI RỄ TƠ SÂM DÂY (Codonopsis sp.) TRONG HỆ THÔNG BIOREACTOR Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 01 14 Học viên: Nguyễn Đình Trọng Hướng dẫn khoa học: PGS TS Chu Hoàng Hà Hà Nội, 2015 Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Đình Trọng LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan Luận văn hoàn toàn hoàn thiện quá trın ̀ h nghiên cứu khoa học thân hướng dẫn trực tiếp PGS TS Chu Hồng Hà với cán Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học Các số liệu hình ảnh, kết trình bày luận văn trung thực, không chép tài liệu, cơng trình nghiên cứu người khác mà không rõ nguồn tham khảo Tôi xin chịu trách nhiệm lời cam đoan trước hội đồng khoa ho ̣c Hà Nội, tháng 12 năm 2015 Học viên Nguyễn Đình Trọng LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lỏng biết ơn chân thành đến người hướng dẫn, giúp đỡ tận tịnh tơi hồn thành luận văn này: PGS TS Chu Hồng Hà, Viện trưởng Viện Cơng nghệ sinh học, Trưởng phòng Công nghệ Tế bào Thực vật – Viện Công nghệ sinh học, hướng dẫn hỗ trợ tận tình, truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm quý báu suốt q trình thực đề tài TS Phạm Bích Ngọc, Phó trưởng phòng Cơng nghệ tế bào thực vật – Viện Công nghệ sinh học, người cô, người chị trực tiếp hướng dẫn, ln theo sát thí nghiệm tơi để đưa lời khun bổ ích kịp thời cho từ ngày tơi bước vào phòng thí nghiệm GS TS Lê Trần Bình, PGS TS Lê Văn Sơn, TS Chu Nhật Huy, KS Nguyễn Khắc Hưng, CN Nguyễn Phú Tâm cán phòng Cơng nghệ tế bào thực vật giúp đỡ, bảo tận tình chun mơn Trong năm học tập nghiên cứu phòng Công nghệ tế bào thực vật, nhận nhiều quan tâm giúp đỡ, động viên chân thành tập thể cán phòng Tơi xin chân thành cảm ơn giúp đỡ quý báu Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến thầy cô giáo sở Viện Sinh thái Tài nguyên Sinh vật truyền đạt cho kiến thức quý báu thời gian học tập vừa qua Bằng tình cảm chân thành, tơi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè ln bên, động viên, giúp đỡ suốt thời gian thực luận văn Hà Nội, tháng 12 năm 2015 Học viên Nguyễn Đình Trọng MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC i DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iii DANH MỤC BẢNG iv DANH MỤC HÌNH - v MỞ ĐẦU 1.1.Đặt vấn đề -1 1.2.Mục đích nghiên cứu 1.2.1 Mục tiêu tổng quát - 1.2.2 Mục tiêu cụ thể - 1.3.Nội dung nghiên cứu 1.4.Ý nghĩa khoa học -3 CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1.Tổng quan Sâm dây -4 1.1.1 Giới thiệu phân bố địa lý 1.1.2 Phân loại - 1.1.3 Hình thái - 1.1.4 Tác dụng dược lý Sâm dây - 1.1.5 Tính cấp thiết việc nghiên cứu, bảo tồn sản xuất bền vững Sâm dây 11 1.2.Nuôi cấy sinh khối rễ tơ – giải pháp tạo nguồn dược phẩm phục vụ sức khoẻ cộng đồng 12 1.2.1 Giới thiệu nuôi cấy nuôi cấy sinh khối tế bào -12 1.2.2 Giới thiệu Agrobacterium rhizogenes – phương pháp tạo rễ tơ tế bào thực vật 13 1.2.3 Cơ chế chuyển gen vùng T-DNA vào tế bào thực vật 14 1.2.4 Nuôi cấy sinh khối rễ tơ 17 1.2.5 Ứng dụng hệ thống bioreactor nuôi cấy sinh khối rễ tơ 22 1.2.6 Ảnh hưởng elicitor đến khả tích luỹ chất thứ cấp 24 1.3.Một số phương pháp tách chiết, phương pháp định tính định lượng saponin 26 1.3.1 Phương pháp tách chiết 26 1.3.2 Một số phương pháp định tính saponin 27 1.3.3 Ứng dụng phương pháp quang phổ định lượng saponin tổng số 28 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 2.1.Vật liệu nghiên cứu 29 i Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Đình Trọng 2.2.Thiết bị hố chất nghiên cứu 29 2.3.Phương pháp nghiên cứu - 29 2.3.1 Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 29 2.3.2 Đánh giá dòng chuyển gen phương pháp PCR 30 2.3.3 Đánh giá khả tăng sinh dòng rễ tơ Sâm dây 31 2.3.4 Xác định kích thước mẫu cấy phù hợp cho nuôi cấy 32 2.3.5 Xác định loại môi trường thích hợp cho ni cấy rễ tơ mơi trường thạch. 32 2.3.6 Xác định lồi mơi trường lỏng thích hợp cho ni cấy rễ tơ -33 2.3.7 Ảnh hưởng salicylic acid (SA) lên sinh trưởng tích luỹ chất khơ rễ tơ Sâm dây 33 2.3.8 Lựa chọn mơ hình ni cấy bioreactor phù hợp 34 2.3.9 Phương pháp nuôi cấy sinh khối rễ tơ hệ thống bioreactor 34 2.3.10.Phương pháp tách chiết saponin từ sinh khối rễ tơ -35 2.3.11.Phương pháp bán định lượng hàm lượng saponin sinh khối rễ tơ -35 2.3.12.Phương pháp tính tốn 36 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN - 37 3.1 Kiểm tra đánh giá dòng rễ tơ chuyển gen phương pháp PCR - 37 3.2 Đánh giá tốc độ sinh trưởng dòng rễ tơ Sâm dây - 39 3.3 Xác định kích thước mẫu phù hợp cho nuôi cấy - 41 3.4.Xác định loại mơi trường thích hợp cho ni cấy rễ tơ môi trường đặc 42 3.5.Kết nuôi cấy rễ tơ môi trường lỏng khác 43 3.6.Ảnh hưởng salicylic acid (SA) lên sinh trưởng tích luỹ hợp chất thứ cấp rễ tơ Sâm dây - 45 3.7.Lựa chọn mơ hình ni cấy bioreactor phù hợp với điều kiện sở vật chất Viện Công nghệ sinh học - 47 3.8.Kết nuôi cấy rễ tơ sâm dây mơ hình bioreactor - 49 3.9.Kết bán định lượng hàm lượng saponin tổng số sinh khối rễ tơ, so sánh với sâm tự nhiên 52 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ - 55 1.1.Kết luận - 55 1.2.Kiến nghị - 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO - 56 ii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT A rhizogenes : Agobacterium rhizogenes A tumefaciens : Agrobacterium tumefaciens Aux : Auxin B5 : Gamborg B5, 1968 bp : Base pair DNA : Desoxyribonucleic acid GusA : β-glucuronidase kp : Kilobase pair LB : Left border MS : Murashige and Skoog, 1962 MeOH : Methanol RB : Right border Ri-plasmid : Root induction plasmid Rol : Root locus SA : Salicylic acid SH : Schenk Hildebrandt, 1972 sp : Species ss T-DNA : Single strain T-DNA vir : Virulence genes JA : Jasmonic acid WPM : McCown’s Woody Plant, 1981 iii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Cấ u trúc hóa ho ̣c saponin Codonopsis lanceolata - Bảng 1.2 Khả ức chế khối u chuột CPPW1 CPPW1B Bảng 1.3 Một số lồi thực vật ni cấy rễ tơ để thu hoạt chất sinh học 20 Bảng 2.1 Các cặp mồi sử dụng nghiên cứu - 30 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR nhân gen rolA, rolB, rolC - 31 Bảng 3.1 Sự phát triển đoạn rễ tơ sâm dây có kích thước khác 41 Bảng 3.2 Sự phát triển rễ tơ sâm dây loại môi trường khác - 42 Bảng 3.3 So sánh thành phần môi trường MS, B5, WPM, SH - 43 Bảng 3.4 Ảnh hưởng SA đến sinh trưởng rễ tơ Sâm dây - 45 Bảng 3.5 Kết nuôi cấy rễ tơ sâm dây hệ thống bioreactor khác sau tuần nuôi cấy - 51 Bảng 3.6 Kích thước củ Sâm dây -3 tuổi thu thập Kon Tum - 52 Bảng 3.7 Kết xác định hàm lượng saponin tổng số - 53 iv DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cây Sâm dây Hın ̀ h 1.2 Cấ u trúc hóa ho ̣c saponin sâm dây (Ichikawa et al., 2009) - Hình 1.3 Cơ chế chuyển gen chung Agrobacterium - 15 Hình 1.4 Các hệ thống rễ tơ Sâm dây nuôi cấy Viện Cơng nghệ sinh học 19 Hình 1.5 Hệ thống bioreactor sủi bọt dạng cầu - 24 Hình 3.1 Kết kiểm tra có mặt gen rolA, rolB, rolC kỹ thuật PCR 38 Hình 3.2 Kết khảo sát tốc độ sinh trưởng dòng rễ tơ Sâm dây - 40 Hình 3.3 Sự phân nhánh kéo dài mẫu rễ tơ sau tuần nuôi cấy môi trường khác nhau. - 42 Hình 3.4 Đường cong sinh trưởng rễ tơ sâm dây môi trường khác 44 Hình 3.5 Kết khảo sát ảnh hưởng SA đến sinh trưởng rễ tơ Sâm dây - 46 Hình 3.6 Hệ thống bioreactor mà TS Nguyển Hữu Hổ sử dụng Viện Sinh học nhiệt đới - 48 Hình 3.7 Hệ thống bioreactor PGS TS Dương Tấn Nhựt sử dụng Viện Sinh học Tây Nguyên - 48 Hình 3.8 Hệ thống bioreactor ngành công nghiệp dược phẩm Hàn Quốc - 48 Hình 3.9 Hệ thống bioreactor sử dụng Viện Cơng nghệ sinh học - 49 Hình 3.10 Rễ tơ thu sau tuần nuôi cấy hệ thống bioreactor lít - 50 Hình 3.11 Các mẫu củ Sâm dây thu thập Kon Tum 52 v Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Đình Trọng MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Sâm dây hay Đẳng sâm có danh pháp khoa học Codonopsis sp., loài thực vật lâu năm thuộc họ Hoa chng (Campanulaceae) Chúng có nguồn gốc từ khu vực Đông Bắc châu Á bán đảo Triều Tiên Rễ đẳng sâm sử dụng y học cổ truyền từ xa xưa với tác dụng bổ ngũ tạng, tăng sức dẻo dai, tăng cường khả miễn dịch cho thể, có tác dụng bổ huyết, chống mệt mỏi, giảm stress Trong sâm dây chứa hoạt chất chủ yếu saponin, polysaccharide, triterpen, steroid… Do có nhiều cơng dụng y dược nên sâm dây có nguy bị khai thác mức làm giảm khả tái sinh phát triển Cây Sâm dây đưa vào chương trình bảo tồn lồi q đưa vào sách đỏ vào năm 1996 ( theo Sách đỏ Việt Nam – phần Thực vật, NXB KHTNCN, 2007) Những giá trị y dược quý Sâm dây ngồi nước cơng nhận, việc khai thác, sử dụng quản lý bền vững nguồn tài nguyên cần quan tâm triệt để Những năm gần đây, với xu hướng chung giới, nước ta hướng nghiên cứu công nghệ sinh khối tế bào thực vật để sản xuất sản phẩm thứ cấp bắt đầu quan tâm đầu tư phát triển Tuy nhiên q trình ni cấy tạo sinh khối tế bào thực vật để làm giảm tính biệt hố mơ tế bào ni cấy cần bổ sung chất điều hồ sinh trưởng vào môi trường nuôi cấy Vấn đề trở ngại lớn tồn dư chất điều hoà sinh trưởng sinh khối tế bào nuôi cấy Điều ảnh hướng trực tiếp đến sản phẩm sức khoẻ người tiêu dùng Việc hồn tồn khắc phục nuôi cấy sinh khối từ rễ tơ Rễ tơ loại bệnh xuất thực vật bậc cao xâm nhiễm vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes gây Đặc biệt, rễ tơ sinh trưởng phát triển tốt mơi trường khơng có chứa chất điều hòa sinh trưởng Do khả sinh trưởng nhanh, kỹ thuật nuôi cấy đơn giản kết hợp hệ thống bioreactor, rễ tơ Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Đình Trọng polyphenol, alkaloid, quinone, terpnoid… Do đó, việc xử lý thực vật với elicitor sinh học phi sinh học xem phương pháp để tăng cường tổng hợp hợp chất thứ cấp công nghệ nuôi cấy sinh khối tế bào thực vật nói chung sinh khối rễ tơ nói riêng (Jian et al., 2005; Dicosmo et al., 1984) 3.7 Lựa chọn mơ hình ni cấy bioreactor phù hợp với điều kiện sở vật chất Viện CNSH Hiện nay, viện Cơng nghệ sinh học chưa có hệ thống nuôi cấy rễ tơ riêng biệt Dựa hệ thống bioreactor lên men vi sinh vật, nhóm nghiên cứu kết hợp với phòng Cơng nghệ lên men thiết kế số mẫu bioreactor sử dụng cho thí nghiệm ni cấy sinh khối với dung tích – 20 lit Sau q trình tham khảo, chúng tơi lựa chọn mơ hình bioreactor dạng sủi bọt dạng cầu để nuôi cấy rễ tơ sâm dây Bioreactor sủi bọt dạng cầu có cấu trúc đơn giản dạng bình bioreactor, bao gồm bình chứa chính, đường cung cấp khí vào, đường khí, màng lọc khí vào khí để đảm bảo vơ trùng, hệ thống kiểm soát điều pH, nhiệt độ, độ oxy hòa tan… Bioreactor da ̣ng này ı́t ta ̣o lực xé, phù hơ ̣p với viê ̣c nuôi cấ y rễ tơ, đơn giản tiến hành lắp ráp khử trùng cách dễ dàng Bên cạnh nhóm nghiên cứu tiền hành thiết kế mẫu lồng đỡ sinh khối rễ giúp rễ tơ bám vào phát triển tốt So sánh với hệ thống bioreactor sử dụng Việt Nam giới số phòng thí nghiệm Việt Nam sử dụng hệ thống bioreactor tương tự Viện Công nghệ sinh học Nguyễn Hữu Hổ Viện Sinh học nhiệt đới, hay Dương Tấn Nhựt Viện Sinh học Tây Nguyên sử dụng hệ thống bioreactor có dung tích nhỏ từ – 20 lit Bên cạnh đó, giới đặc biệt Hàn Quốc đất nước lồi sâm ngành cơng nghiệp dược phẩm từ sâm hệ thống bioreactor họ sử dụng hệ thống nuôi cấy dạng bọt khí bên cạnh cải tiến để tối ưu hoá điều kiện sinh trưởng cho rễ tơ sâm 47 Luận văn Thạc sĩ A Nguyễn Đình Trọng B Hình 3.6 Hệ thống bioreactor mà TS Nguyển Hữu Hổ sử dụng Viện Sinh học nhiệt đới (A – lit; B – 10 lit) Hình 3.7 Hệ thống bioreactor PGS TS Dương Tấn Nhựt sử dụng Viện Sinh học Tây Nguyên Hình 3.8 Hệ thống bioreactor ngành công nghiệp dược phẩm Hàn Quốc 48 Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Đình Trọng B A Hình 3.9 Hệ thống bioreactor sử dụng Viện Công nghệ sinh học (A – lit; B – 10 lit) 3.8 Kết nuôi cấy rễ tơ sâm dây mơ hình bioreactor Sau tìm số điều kiện thích hợp cho việc ni cấy mơ hình bioreactor rễ tơ sâm dây, chúng tơi tiến hành ni cấy mơ hình bioreactor theo kết nghiên cứu trước Hai hệ thống bioreactor sử dụng hệ thống bioreactor lit hệ thống bioreactor 10 lit Hệ thống bioreactor loại lit thiết kế từ bình ni cấy lên men vi sinh tiêu chuẩn bổ sung cánh khuấy có giá đỡ thép khơng ghỉ, bên bình ni cấy thuỷ tinh chịu lực; hệ thống sục khí kèm bình cho khả khơng khí phân tán mơi trường; nhóm nghiên cứu tiến hành lắp hệ thống giá đỡ sinh khối cho rễ tơ có điểm bám phát triển 49 Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Đình Trọng Còn hệ thống bioreactor loại 10 lit phòng Cơng nghệ lên men tiến hành nghiên cứu với hệ thống sục giống bể cá bình thuỷ tinh chịu lực; với thiết kế hệ thống sục khí khơng giúp khơng khí phân tán hệ thống bioreactor lit, mặt khác cổ bình thuỷ tinh nhỏ nên việc thiết kế hệ thống giá đỡ gặp nhiều khó khăn Đầu tiên, toàn hệ thống bioreactor khử trùng 1210C thời gian 30 phút áp suất 1atm Sau mơi trường SH cho vào bình ni cấy khử trùng 1170C thời gian 20 phút áp suất 1atm để nguội Rễ tơ cắt với kích thước khoảng 1cm chuyển vào bên bình ni cấy tiến hành cắm hệ thống sục khí, tiến hành ni cấy Sau tuần ni cấy nhóm nghiên cứu thu kết hình 3.10 bảng 3.5 A B C D Hình 3.10 Rễ tơ thu sau tuần nuôi cấy hệ thống bioreactor lít (B, D) 10 lít (A, C) 50 Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Đình Trọng Bảng 3.5 Kết nuôi cấy rễ tơ sâm dây hệ thống bioreactor khác sau tuần nuôi cấy Khối Khối lượng Khối Tỷ lệ lượng Hàm Loại bình mẫu lượng tăng tươi lượng Bioreactor ban khô trưởng mẫu khô (%) đầu (g) (lần) thu (g) (g) Loại lit 12 510 28 42,5 5,49 Loại 10 lit 60 393 38 6,55 9,67 Theo nghiên cứu Choi cs năm 2008 đối tượng rễ tơ Panax ginseng sau 42 ngày bình bioreactor lit, từ khối lượng ban đầu cho vào bình nuôi cấy 20 g rễ tơ tạo thành 520 g rễ tươi (tỷ lệ tăng trưởng lên tới 26 lần, tạo 48 g rễ khô, hàm lượng khô lên tới 9,23 %) (Choi et al., 2008) Trong với đối tượng nghiên cứu rễ tơ Sâm dây bình bioreactor loại lit có thêm hệ thống giá đỡ Viện Công nghệ sinh học thiết kế sau tuần ni cấy với 12 g rễ tơ ban đầu tạo 510 g rễ tơ tươi (tỷ lệ tăng trưởng lên tới 42, lần, tạo 28 g rễ khô, hàm lượng khô 5,49 %) Nhưng tốc độ tăng trưởng rễ tơ bình bioreactor loại 10 lit đạt 6,55 lần Điều loại bình ni lit có thêm lồng đỡ sinh khối rễ tơ nên rễ tơ có khả sinh trưởng tốt môi trường lỏng rễ tơ bám lên khắp bề mặt lồng đỡ làm tăng khả hấp thụ chất dinh dưỡng khơng khí Nhưng khối lượng khơ bình bioreactor 10 lit đạt tới 38 g so với 28 g loại lit Điều trao đổi chất bình rễ tơ 10 lit diễn mạnh nên khả tích luỹ chất khơ rễ tơ cao Những kết kết ban đầu điều kiện thí nghiệm nhiều hạn chế Cần phải tiếp tục tối ưu phương pháp nuôi cấy rễ tơ hệ thống bioreactor 51 Luận văn Thạc sĩ 3.9 Nguyễn Đình Trọng Kết bán định lượng hàm lượng saponin tổng số sinh khối rễ tơ, so sánh với sâm tự nhiên Các phương pháp chiết sử dụng dung mơi hữu chủ yếu dựa tính phân cực hợp chất hoá học Các hợp chất phân cực tan dung môi phân cực hợp chất không phân cực tan dung mơi khơng phân cực Giai đoạn khảo sát có mặt saponin hệ dung môi chiết cần thiết cho q trình xác định hàm lượng saponin có sinh khối rễ Kết khảo sát hàm lượng saponin mẫu rễ tơ góp phần đánh giá chất lượng sinh khối tạo thành hiệu q trình ni cấy Các mẫu củ Sâm dây 1, 2, năm tuổi thu thập Kon Tum có chiều dài củ đường kính củ cực đại 10 củ Sâm dây loại lấy ngẫu nhiên theo bảng 3.6 năm năm năm Hình 3.11 Các mẫu củ Sâm dây thu thập Kon Tum Bảng 3.6 Kích thước củ Sâm dây -3 tuổi thu thập Kon Tum Loại củ Chiều dài (cm) Đường kính max (cm) Sâm dây năm tuổi 16,2 ± 2,77 0,9 ± 0,1 Sâm dây năm tuổi 18,1 ± 2,99 1,2 ± 0,18 Sâm dây năm tuổi 20,5 ± 4,2 1,6 ± 0,2 52 Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Đình Trọng Mẫu rễ tơ Sâm dây mẫu Sâm dây 1,2,3 năm tuổi thu thập KonTum chiết hoạt chất theo quy trình mơ tả phần 2.3.10 Dịch chiết methanol mang xác định có mặt hợp chất saponin hay triterpenoid qua phản ứng oxy hoá sử dụng acid sulfuric với thuốc thử vanillin bước đầu đánh giá hàm lượng saponin tổng số có dịch chiết Kết thu nhận thể bảng 3.7 Bảng 3.7 Kết xác định hàm lượng saponin tổng số Dung môi Mẫu STN năm STN năm MeOH STN năm Rễ tơ Abs 538 nm Nồng độ (µmol) Khối lượng (µg) 0,320 0,56 0,18 0,38 0,037 0,066 0,021 0,044 16,99 29,99 9,45 19,99 Khối lượng cặn chiết (µg) 100 300 350 585 Hàm lượng saponin theo phần trăm khối lượng w/w 16,99 % 9,99 % 2,70 % 3,42 % Kết khảo sát cho thấy có phát saponin dịch chiết methanol Sâm dây Hiện tượng xảy cấu trúc saponin tính phân cứu dung mơi methanol Methanol dung môi phân cực mạnh nên dễ dàng hồ tan chất có cấu trúc phân cực có saponin Việc phát saponin dịch chiết methanol phù hợp với công bố thành phần saponin Sâm dây Các nghiên cứu ra, sâm dây có chứa loại saponin Các loại saponin có cấu trúc khác dẫn đến độ phân cực hồn tồn khác Qua kết thí nghiệm cho thấy mối tương quan hàm lượng saponin có mẫu rễ tơ Sâm dây mẫu đối chứng (củ sâm dây 1, 2, năm tuổi) Hàm lượng saponin củ sâm dây tích luỹ theo thời gian ngày tăng từ 2,70 % củ năm tuổi lên 16,99 % củ năm tuổi Còn mẫu rễ tơ Sâm dây in vitro hàm lượng saponin thấp đạt 3,42 % Điều điều kiện tự nhiên thời gian nuôi lâu nên hàm lượng saponin tích tụ mẫu tự nhiên cao so với mẫu rễ tơ nuôi cấy 53 Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Đình Trọng Bên cạnh hàm lượng saponin rễ tơ sâm dây đạt 3,42 % cao so với hàm lượng saponin có củ sâm dây năm tuổi, đạt 2,70 % Điều sâm dây năm tuổi chưa đủ thời gian tuổi để tích luỹ saponin nên hàm lượng saponin thấp nhiều so với sâm dây năm tuổi (9,99 %) sâm dây năm tuổi (16,99 %) 54 Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Đình Trọng CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1.1 Kết luận Đã lựa chọn dòng rễ tơ sâm dây T7 sinh trưởng phát triển ổn định Đã tối ưu môi trường nuôi cấy rễ tơ Sâm dây thích hợp mơi trường thạch WPM cho trung bình 3,14 nhánh chiều dài đạt 0,75 ± 0,05 cm, môi trường lỏng SH cho tốc độ sinh trưởng lên tới 12,321 lần sau tuần nuôi cấy Đã tối ưu mơi trường có nồng độ salicylic acid tốt cho tăng trưởng khối lượng khô SH + 150 µM salicylic acid + 500 mg/l cefotaxime Hệ thống bioreactor sử dụng nghiên cứu dạng sủi bọt dạng cầu với quy mơ lít 10 lít Bước đầu ni cấy tạo sinh khối có tốc độ tăng trưởng lên tới 42,5 lần quy mơ bình bioreactor loại lít Bước đầu xác định hàm lượng saponin có rễ tơ 3,4 % cao so với hàm lượng saponin củ sâm dây năm tuổi (chỉ đạt, 2,70 %) 1.2 Kiến nghị - Tiếp tục tìm điều kiện tối ưu khác cho rễ tơ Sâm dây phát triển thành phần muối khoáng đa lượng vi lượng; pH, nguồn carbon hydrate, thời điểm bổ sung elicitor hay loại elicitor khác, nồng độ oxy - Tiến hành tách chiết số hoạt chất từ sinh khối rễ tơ đánh giá chất lượng sinh khối rễ tơ sâm dây tự nhiên - Tiếp tục tiến hành ni cấy bioreactor với dung tích lớn - Đánh giá số hoạt tính sinh dược học dịch chiết sinh khối rễ tơ 55 Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Đình Trọng TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Đỗ Tất Lợi (2005) “Những Cây thuốc vị thuốc Việt Nam”, Nhà xuất Y học Hà Thị Mỹ Ngân (2013) “Chuyển gen tạo rễ tóc sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) qua trung gian vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes” – Luận văn thạc sĩ Hồng Hà (2012) “Nghiên cứu quy trình tạo rễ tơ bá bệnh (Eurycoma longifolia) làm sở cho việc sản xuất sinh khối dược liệu” – Luận văn thạc sĩ Hoàng Minh Chung, Phạm Xuân Sinh, Nguyễn Mạnh Tuyển (2002) “Bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học vị thuốc Đảng sâm Việt Nam” Tạp chí Dược Liệu 7(1): – Sách đỏ Việt Nam – phần Thực vật (2007), Nhà Xuất Khoa học tự nhiên Công nghệ Phạm Bích Ngọc, Nguyễn Đình Trọng, Hồng Hà, Lâm Đại Nhân, Chu Hoàng Hà (2012) “Nghiên cứu khả tạo rễ tơ Bá Bệnh (Eurycoma longifolia JACK) thông qua vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes” Tạp chí Khoa học Cơng nghệ 50(3B): 166-173 Phạm Bích Ngọc, Nguyễn Đình Trọng, Nguyễn Khắc Hưng, Nguyễn Thị Thúy Hường, Lâm Đại Nhân, Nguyễn Hữu Cường, Lê Trần Bình, Dương Tấn Nhựt, Chu Hoàng Hà (2013) “Nghiên cứu khả tạo rễ tơ sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv) thơng qua vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes” Tạp chí Sinh học 11(4): 689 – 695 Tài liệu Tiếng Anh Alpizar, E., Dechamp, E., Lapeyre-Montes, F., Guilhaumon, C., Bertrand, B., Jourdan, C., Lashermes, P., and Etienne, H (2008), "Agrobacterium rhizogenestransformed roots of coffee (Coffea arabica): conditions for long-term proliferation, and morphological and molecular characterization", Ann Bot 101(7), pp 929-40 Asada, Y., Saito, H., Yoshikawa, T., Sakamoto, K., and Furuya, T (1993), "Biotransformation of 18 beta-glycyrrhetinic acid by ginseng hairy root culture", Phytochemistry 34(4), pp 1049-52 10 Baenas, N., Garcia-Viguera, C., and Moreno, D A (2014), "Elicitation: a tool for enriching the bioactive composition of foods", Molecules 19(9), pp 13541-63 11 Bai, X S., Han, C J , and Bao, J (2008), "Studys on the mechanism of the compound Codonopsis lanceolata on alcoholic hepatic injury", Journal of Toxicology 22(1), pp 42-44 12 Banerjee, S., Shang, T Q., Wilson, A M., Moore, A L., Strand, S E., Gordon, M P., and Lafferty Doty, S (2002), "Expression of functional mammalian P450 2E1 in hairy root cultures", Biotechnol Bioeng 77(4), pp 462-6 13 Bernard, R G., Jack, J P., and Cheryl, L P (2010), "Molecular Biotechnology: Principles and applications of recombinant DNA ", New York: ASM press 56 Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Đình Trọng 14 Bordonaro, J L and Curtis, W R (2000), "Inhibitory role of root hairs on transport within root culture bioreactors", Biotechnol Bioeng 70(2), pp 176-86 15 Britton, M T and Escobar, M A., et al (2008), The oncogenes of Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes, Agrobacterium: From Biology to Biotechnology , T Tzfira and V Citovsky., New York , 524-565 16 Bulgakov, V P., Tchernoded, G K., Mischenko, N P., Shkryl, Y N., Glazunov, V P., Fedoreyev, S A., and Zhuravlev, Y N (2003), "Effects of Ca(2+) channel blockers and protein kinase/phosphatase inhibitors on growth and anthraquinone production in Rubia cordifolia callus cultures transformed by the rolB and rolC genes", Planta 217(3), pp 349-55 17 Casanova, E., Trillas, M I., Moysset, L., and Vainstein, A (2005), "Influence of rol genes in floriculture", Biotechnol Adv 23(1), pp 3-39 18 Chan, J Y., Lam, F C., Leung, P C., Che, C T., and Fung, K P (2009), "Antihyperglycemic and antioxidative effects of a herbal formulation of Radix Astragali, Radix Codonopsis and Cortex Lycii in a mouse model of type diabetes mellitus", Phytother Res 23(5), pp 658-65 19 Choi, H K., Won, E K., Jang, Y P., and Choung, S Y (2013), "Antiobesity Effect of Codonopsis lanceolata in High-Calorie/High-Fat-Diet-Induced Obese Rats", Evid Based Complement Alternat Med 2013, p 210297 20 Choi, Y.E , Kim, Y.S., and Paek, K.Y (2008), "Types and designs of bioreactors for hairy root culture", Plant Tissue Culture Engineering Springrer, pp 161-172 21 Dicosmo, F and Tower, GHN (1984), "Stress and secondary metabolism in ciltured plant cells", Phytochemical Adaptation to Stress Plenum, New York, pp 97175 22 Dodds, J H and Roberts, L W (1995), Experiments in Plant Tissue Culture, Cambridge University Press England 23 Fu, C G., Wen, L K., and Dong, R (2007), "The research progress on chemical constituents and pharmacological activities of Codonopsis lanceolata", Journal of Chinese Medicinal Materials 30(4), pp 497-499 24 Giri, A and Narasu, M L (2000), "Transgenic hairy roots recent trends and applications", Biotechnol Adv 18(1), pp 1-22 25 Han, B., Linden, J C., Gujarathi, N P., and Wickramasinghe, S R (2004), "Population balance approach to modeling hairy root growth", Biotechnol Prog 20(3), pp 872-9 26 Hayashi, T., Yoshida, K., and Sano, K (1988), "Formation of alkaloids in suspension cultured Colchicum autumnale", Phytochemistry 1988(27), pp 1371-1374 27 He, J Y., Ma, N., Zhu, S., Komatsu, K., Li, Z Y., and Fu, W M (2015), "The genus Codonopsis (Campanulaceae): a review of phytochemistry, bioactivity and quality control", J Nat Med 69(1), pp 1-21 28 He, J Y., Zhu, S., Goda, Y., Cai, S Q., and Komatsu, K (2014), "Quality evaluation of medicinally-used Codonopsis species and Codonopsis Radix based on the 57 Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Đình Trọng contents of pyrrolidine alkaloids, phenylpropanoid and polyacetylenes", J Nat Med 68(2), pp 326-39 29 Hiai, S., O H., and Hakajima, T (1976), "Colour reaction of some sapogenins and saponins with vanillin and sulphuric acid", Planta medica 29, pp 116-122 30 Hyam, S R., Jang, S E., Jeong, J J., Joh, E H., Han, M J., and Kim, D H (2013), "Echinocystic acid, a metabolite of lancemaside A, inhibits TNBS-induced colitis in mice", Int Immunopharmacol 15(2), pp 433-41 31 Ichikawa, M., Ohta, S., Komoto, N., Ushijima, M., Kodera, Y., Hayama, M., Shirota, O., Sekita, S., and Kuroyanagi, M (2009), "Simultaneous determination of seven saponins in the roots of Codonopsis lanceolata by liquid chromatography-mass spectrometry", J Nat Med 63(1), pp 52-7 32 Jeong, G T., Park, D.H., Hwang, B., Park, K., Kim, S W., and Woo, J C (2002), "Studies on mass production of transformed Panax ginseng hairy roots in bioreactor", Appl Biochem Biotechnol 98-100, pp 1115-27 33 Jian, Z, Lawrence, C.D., and Verpoorte R (2005), "Elicitor signal transduction leading to production of plant secondary metabolites", Biotechnology Advances 23, pp 283–333 34 Joh, E.H and Kim, D.H (2010), "Lancemaside A inhibits lipopolysaccharideinduced inflammation by targeting LPS/TLR4 complex", J Cell Biochem 111(4), pp 865-71 35 Kawaguchi, K., Hirotani, M., Yoshikawa, T., and Furuya, T (1990), "Biotransformation of digitoxigenin by ginseng hairy root cultures", Phytochemistry 29(3), pp 837-43 36 Kim, E., Yang, W S., Kim, J H., Park, J G., Kim, H G., Ko, J., Hong, Y D., Rho, H S., Shin, S S., Sung, G H., and Cho, J Y (2014), "Lancemaside A from Codonopsis lanceolata modulates the inflammatory responses mediated by monocytes and macrophages", Mediators Inflamm 2014, p 405158 37 Kim, J A., Kwang, H B., Young, M S., Sung, H S., and Shin, H (2009), "Hairy Root Cultures of Taxus cuspidata for Enhanced Production of Paclitaxel.", Journal of the Korean Society for Applied Biological Chemistry 52(2), pp 144-150 38 Krishna, P.R., Chari, M.A., Kim, M.K., Kalaiselvi, S., and Yang, D.C (2007), "Induction of adventitious roots and extraction of codonoposide from Codonopsis lanceolata", An Indian Journal 3(3), pp 129 – 131 39 Lee, K W., Jung, H J., Park, H J., Kim, D G., Lee, J Y., and Lee, K T (2005), "Beta-D-xylopyranosyl-(1 >3)-beta-D-glucuronopyranosyl echinocystic acid isolated from the roots of Codonopsis lanceolata induces caspase-dependent apoptosis in human acute promyelocytic leukemia HL-60 cells", Biol Pharm Bull 28(5), pp 854-9 40 Li, W L., Zheng, H C., Bukuru, J., and De Kimpe, N (2004), "Natural medicines used in the traditional Chinese medical system for therapy of diabetes mellitus", J Ethnopharmacol 92(1), pp 1-21 58 Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Đình Trọng 41 Liu, G Z., Cai, D G., and Shao, S (1988), "Studies on the chemical constituents and pharmacological actions of dangshen, Codonopsis pilosula (Franch.) Nannf", J Tradit Chin Med 8(1), pp 41-7 42 Lodhi, A H., Bongaerts, R J., Verpoorte, R., Coomber, S A., and Charlwood, B V (1996), "Expression of bacterial isochorismate synthase (EC 5.4.99.6) in transgenic root cultures of Rubia peregrina", Plant Cell Rep 16(1-2), pp 54-7 43 Luo, H., Lin, S., Ren, F., Wu, L., Chen, L., and Sun, Y (2007), "Antioxidant and antimicrobial capacity of Chinese medicinal herb extracts in raw sheep meat", J Food Prot 70(6), pp 1440-5 44 Maziah, M and Rosli, N (2009), "The Production of 9-methoxycanthin-6-one from Callus Cultures of (Eurycoma longifolia Jack) Tongkat Ali", Methods Mol Biol 547, pp 359-69 45 Nguyen, M D., Nguyen, T N., Kasai, R., Ito, A., Yamasaki, K., and Tanaka, O (1993), "Saponins from Vietnamese ginseng, Panax vietnamensis Ha et Grushv Collected in central Vietnam I", Chem Pharm Bull (Tokyo) 41(11), pp 2010-4 46 Palazon, J., Mallol, A., Eibl, R., Lettenbauer, C., Cusido, R M., and Pinol, M T (2003), "Growth and ginsenoside production in hairy root cultures of Panax ginseng using a novel bioreactor", Planta Med 69(4), pp 344-9 47 Peng, J H and Yu, Y J (2009), "Advances in study of Codonopsis lanceolata", Special Wild Economic Animal and Plant Research 1, pp 70-73 48 Radman, R., Bucke, C., and Keshavarz, T (2004), "Elicitor effects on Penicillium chrysogenum morphology in submerged cultures", Biotechnol Appl Biochem 40(Pt 3), pp 229-33 49 Ryan, R., Brian, C G., and Tsafrir, S M (2008), "Hairy roots organ cultures for the production of human acetylcholinesterase.", BMC Biotechnology 8(95) 50 Satdive, R.K., Fulzele, D.P., and Eapen, S (2007), "Enhanced production of azadirachtin by hairy root cultures of Azadirachta indica A.Juss by elicitation and media optimization", J Biotechnol 128, pp 281-289 51 Schmulling, T., Schell, J., and Spena, A (1988), "Single genes from Agrobacterium rhizogenes influence plant development", EMBO J 7(9), pp 2621-9 52 Sevon, N and Oksman-Caldentey, K M (2002), "Agrobacterium rhizogenesmediated transformation: root cultures as a source of alkaloids", Planta Med 68(10), pp 859-868 53 Sharp, J M and Doran, P.M (2001), "Characterization of monoclonal antibody fragments produced by plant cells", Biotechnol Bioeng 73(5), pp 338-46 54 Sivakumar, G., Yu, K.W., Hahn, E.J., and Paek, K.Y (2005), "Optimization of organic nutrients forginseng hairy roots production in large-scale bioreactors", Current Science 89 (4), pp 641 - 649 55 Sun, Y X (2009), "Immunological adjuvant effect of a water-soluble polysaccharide, CPP, from the roots of Codonopsis pilosula on the immune responses to ovalbumin in mice", Chem Biodivers 6(6), pp 890-6 59 Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Đình Trọng 56 Tepfer, D.A and Tempe, J (1981), "Production d'agropine par des racines formees sous l'action d'Agrobacterium rhizogenes, souche A4", C.R Acad Sci Paris 292, pp 153-156 57 Trigiano, R N and Gray, D J (1999), Plant Tissue Culture Concepts and Laboratory Exercises, ed Edition, Second, 25 58 Ueda, J Y., Tezuka, Y., Banskota, A H., Le Tran, Q., Tran, Q K., Harimaya, Y., Saiki, I., and Kadota, S (2002), "Antiproliferative activity of Vietnamese medicinal plants", Biol Pharm Bull 25(6), pp 753-60 59 Vasil, I.K and Thorpe, T.A , eds (1998), Plant cell and tissue culture, Dordrecht: Kluwer Acad Publ 60 Wang, Z.T., Ng, T.B., Yeung, H.W., and Xu, G.J (1996), "Immunomodulatory effect of a polysaccharide-enriched preparation of Codonopsis pilosula roots", Gen Pharmacol 27(8), pp 1347-50 61 Woo, S S., Song, J S., Lee, J Y., In, D S., Chung, H J., Liu, J R., and Choi, D W (2004), "Selection of high ginsenoside producing ginseng hairy root lines using targeted metabolic analysis", Phytochemistry 65(20), pp 2751-61 62 Xin, T., Zhang, F., Jiang, Q., Chen, C., Huang, D., Li, Y., Shen, W., Jin, Y., and Sui, G (2012), "The inhibitory effect of a polysaccharide from Codonopsis pilosula on tumor growth and metastasis in vitro", Int J Biol Macromol 51(5), pp 788-93 63 Xu, C., Liu, Y., Yuan, G., and Guan, M (2012), "The contribution of side chains to antitumor activity of a polysaccharide from Codonopsis pilosula", Int J Biol Macromol 50(4), pp 891-4 64 Yang, C., Gou, Y., Chen, J., An, J., Chen, W., and Hu, F (2013), "Structural characterization and antitumor activity of a pectic polysaccharide from Codonopsis pilosula", Carbohydr Polym 98(1), pp 886-95 65 Yang, F R., L Z M., and Gao, J P (2011), "Separation and structural characterization and anti-tumor effect in vitro of polysaccharides from Radix Codonopsis", Lishizhen Med Mater Med Res 2011(12), pp 2876–2878 66 Yongxu, S and Jicheng, L (2008), "Structural characterization of a water-soluble polysaccharide from the roots of Codonopsis pilosula and its immunity activity", Int J Biol Macromol 43(3), pp 279-82 67 Yoo, C S and Kim, S J (2013), "Methanol extract of Codonopsis pilosula inhibits inducible nitric oxide synthase and protein oxidation in lipopolysaccharidestimulated raw cells", Tropical J Pharm Res 12(5), pp 705–710 68 Yu, K.W., Gao, W.Y., Son, S.H., and Paek, K.Y (2000), "Improvement of ginsenoside production by jasmonic acid and some other elicitor in hairy root culture of ginseng ( Panax ginseng CA Meyer)", In Vitro Cellular and Developmental Biology Plant 36(5), pp 424 - 428 69 Zhang, L., Han, C J., Li, L J , and Tao, L (2007), "The preventive effect of the compound Codonopsis lanceolata on alcoholic hepatic injury in mice", Journal of Toxicology 21(4), pp 265-267 60 Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Đình Trọng 70 Zhao, J., Zhu, W.H., Hu, Q., and He, X.W (2000), "Improved indole alkaloid production in Catharanthus roseus suspension cell culture by various chemical", Biotechnology Letters 22, pp 1221-1226 71 Zhao, M Q., Ding, J Y., Liu, J., and Hu, B (2001), "Studies on the arbutin biosynthesis by hairy root of Panax ginseng C.A Mayer", Zhongguo Zhong Yao Za Zhi 26(12), pp 819-22 72 Zhi, B H and Min, D (2006), "Hairy roots and its application in plant genetic engineering.", Journal of intergrative plant biology 48(2), pp 121-127 Tài liệu Web 73 http://www2.hawaii.edu/ 61 ... nuôi cấy rễ tơ 1.2.2 Mục tiêu cụ thể: - Lựa chọn dòng rễ tơ sâm dây sinh trưởng phát triển ổn định - Tối ưu môi trường nuôi cấy rễ tơ sâm dây - Nuôi cấy nhân sinh khỗi rễ tơ hệ thống bioreactor. .. dòng rễ tơ - Tối ưu môi trường nuôi cấy rễ tơ sâm dây môi trường đặc - Tối ưu môi trường nuôi cấy rễ tơ sâm dây môi trường lỏng - Nuôi cấy sinh khối rễ tơ hệ thống bioreactor - Tách chiết hoạt... NGHỆ VN VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT - - LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY SINH KHỐI RỄ TƠ SÂM DÂY (Codonopsis sp.) TRONG HỆ THÔNG BIOREACTOR Chuyên ngành: Sinh