Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về quy trình giám định bệnh khô cành cam quýt phoma tracheiphila (pertri) kantachveli gikachvili là dịch hại kiểm dịch thực vật của Việt Nam

Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về quy trình giám định bệnh khô cành cam quýt phoma tracheiphila (pertri) kantachveli gikachvili là dịch hại kiểm dịch thực vật của Việt NamQuy chuẩn kỹ thuật quốc gia về quy trình giám định bệnh khô cành cam quýt phoma tracheiphila (pertri) kantachveli gikachvili là dịch hại kiểm dịch thực vật của Việt NamQuy chuẩn kỹ thuật quốc gia về quy trình giám định bệnh khô cành cam quýt phoma tracheiphila (pertri) kantachveli gikachvili là dịch hại kiểm dịch thực vật của Việt NamQuy chuẩn kỹ thuật quốc gia về quy trình giám định bệnh khô cành cam quýt phoma tracheiphila (pertri) kantachveli gikachvili là dịch hại kiểm dịch thực vật của Việt Nam

QCVN 01 - 173 : 2014/BNNPTNT QUY CHUẨN KỸ THUẬT QUỐC GIA VỀ QUY TRÌNH GIÁM ĐỊNH BỆNH KHÔ CÀNH CAM QUÝT PHOMA TRACHEIPHILA (PERTRI) KANTACHVELI & GIKACHVILI LÀ DỊCH HẠI KIỂM DỊCH THỰC VẬT CỦA VIỆT NAM National technical regulation on Procedure for identification of Mal secco (Phoma tracheiphila (Pertri) Kantachveli & Gikachvili) - Plant quarantine pest of Vietnam Lời nói đầu QCVN 01 - 173 : 2014/BNNPTNT Trung tâm Giám định Kiểm dịch thực vật biên soạn, Cục Bảo vệ thực vật trình duyệt, Bộ Nông nghiệp & PTNT ban hành Thông tư số 16/TT-BNNPTNT ngày 05 tháng năm 2014 QUY CHUẨN KỸ THUẬT QUỐC GIA VỀ QUY TRÌNH GIÁM ĐỊNH BỆNH KHÔ CÀNH CAM QUÝT PHOMA TRACHEIPHILA (PERTRI) KANTACHVELI & GIKACHVILI LÀ DỊCH HẠI KIỂM DỊCH THỰC VẬT CỦA VIỆT NAM National technical regulation on Procedure for identification of Mal secco (Phoma tracheiphila (Pertri) Kantachveli & Gikachvili) - Plant quarantine pest of Vietnam I QUY ĐỊNH CHUNG 1.1 Phạm vi điều chỉnh Quy chuẩn quy định quy trình giám định bệnh khô cành cam quýt Phoma tracheiphila (Pertri) Kantachveli & Gikachvili - dịch hại kiểm dịch thực vật nhóm I Việt Nam 1.2 Đối tượng áp dụng Quy chuẩn áp dụng tổ chức, cá nhân Việt Nam nước có hoạt động liên quan đến lĩnh vực bảo vệ kiểm dịch thực vật thực giám định bệnh khô cành cam quýt Phoma tracheiphila (Pertri) Kantachveli & Gikachvili - dịch hại kiểm dịch thực vật (KDTV) nhóm I thuộc Danh mục dịch hại KDTV Việt Nam 1.3 Giải thích từ ngữ Trong quy chuẩn này, từ ngữ hiểu sau: 1.3.1 Dịch hại kiểm dịch thực vật (plant quarantine pest) Là loài dịch hại có nguy gây hại nghiêm trọng tài nguyên thực vật vùng mà loài sinh vật chưa xuất xuất có phân bố hẹp phải kiểm soát thức 1.3.2 Thực vật (plant) Là phận sống, kể hạt giống sinh chất có khả làm giống 1.3.3 Mẫu (sample) Là khối lượng thực vật, sản phẩm thực vật tàn dư sản phẩm thực vật lấy theo qui tắc định 1.3.4 Tiêu (specimen) Là mẫu vật điển hình tiêu biểu dịch hại xử lý để dùng cho việc định loại, nghiên cứu, giảng dạy, phổ biến kỹ thuật trưng bày thành sưu tập 1.3.5 Phản ứng chuỗi trùng hợp phản ứng khuếch đại gen (Polymerase Chain Reaction - PCR) Là kỹ thuật phổ biến sinh học phân tử nhằm khuếch đại (tạo nhiều sao) đoạn DNA mà không cần sử dụng sinh vật sống II QUY ĐỊNH KỸ THUẬT 2.1 Phương pháp thu thập bảo quản mẫu 2.1.1 Thu thập mẫu Đối với hàng xuất, nhập khẩu, cảnh vận chuyển, bảo quản nước: Tiến hành lấy mẫu theo tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 4731:891 "Kiểm dịch thực vật - phương pháp lấy mẫu", quy chuẩn kỹ thuật quốc gia QCVN 01-22:2010/BNNPTNT "Phương pháp kiểm tra xuất nhập cảnh" Đối với trồng đồng ruộng: Lấy mẫu theo Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia QCVN 0138/2010/BNNPTNT1 "Phương pháp điều tra phát dịch hại trồng" 2.1.2 Bảo quản mẫu Các phận tươi có triệu chứng bệnh (cành, lá, thân) chứa túi ni-lông có lỗ thông khí bảo quản tủ lạnh nhiệt độ - 5oC Các tiêu lam nấm dán nhãn, để hộp chuyên dụng đựng tiêu lam bảo quản nhiệt độ phòng 2.2 Thiết bị dụng cụ, hóa chất Kính lúp soi có độ phóng đại 10 - 40 lần, kính hiển vi có độ phóng đại 40 - 1.000 lần Máy ly tâm, máy lắc, tủ sấy, tủ định ôn, cân điện, máy trộn dịch, máy PCR, máy điện di, buồng tối máy chụp ảnh Bộ dao, kim giải phẫu, panh, kéo, piptet, găng tay, đèn cồn, đĩa petri, ống hút, lam, lamen, bình tam giác, cốc đong, ống ly tâm 1,5ml Cồn 70o, cồn tuyệt đối, parafin, lactophenol blue, acid acetic, nước cất vô trùng Nitơ lỏng, NaCI, phenol:chloroform:isoamylalcohol (25:24:1), chloroform, isopropanol, Proteinase K, Tris-HCI, EDTA, SDS MgCI2 ,KCI, dNTP, mồi, Taq DNA polymerase, agarose 2.3 Phương pháp phát giám định bệnh 2.3.1 Phát thu thập mẫu bệnh Khi bị nhiễm bệnh gân trở nên (gân gân phụ), cong biến vàng, chồi non bị biến vàng Sau rụng lại cuống lá, cành bị héo bị chết (hình đến hình 4, phụ lục 1) Đôi rụng gân gân phụ biến thành màu đỏ Cành bị bệnh có màu nâu màu nâu nhạt bị nứt bệnh nặng đoạn thân cành khô, có màu xám tro, mặt vết bệnh có hạt nhỏ màu đen (hình 5, phụ lục 1) Trên thân nhiễm bệnh, cắt ngang mô hóa màu hồng nâu với mô già (hình 6, phụ lục 1) 2.3.2 Phương pháp giám định đặc điểm hình thái nấm gây bệnh 2.3.2.1 Phương pháp kiểm tra trực tiếp Bào tử cành nấm P tracheiphila quan sát trực tiếp kính hiển vi quang học Để quan sát rõ cấu trúc bào tử cành nhuộm lactophenol blue Dùng kim khêu nấm khêu bào tử nấm cành trực tiếp từ phận bị phần nghi ngờ nhiễm bệnh có triệu chứng điển hình, đặt lên lam có 01 giọt lactophenol đậy lamen Đặt lam lên kính hiển vi quan sát đặc điểm hình thái, đo kích thước bào tử nấm so sánh với đặc điểm bào tử nấm P tracheiphila (phụ lục 1) Trường hợp văn viện dẫn quy chuẩn sửa đổi, bổ sung thay thực theo quy định văn 2.3.2.2 Phương pháp để ẩm Các cành khô, mẫu thân có triệu chứng bệnh (trên cành có vùng khô màu xám chì xám tro, thân mà mạch dẫn hóa màu hồng) để ẩm 12-24 Sau dùng kim khêu nấm khêu bào tử trực tiếp từ phần nghi ngờ nhiễm bệnh, đặt lên lam có 01 giọt lactophenol Đặt lam lên kính hiển vi tìm, quan sát đặc điểm hình thái, đo kích thước bào tử nấm Quan sát kính hiển vi so sánh với đặc điểm bào tử nấm P tracheiphila (phụ lục 1) 2.3.2.3 Phương pháp phân lập nấm từ vật liệu nhiễm bệnh Cắt phần rìa vết bệnh đoạn thân, cành khoảng 20-100mm nhúng vào cồn tuyệt đối Sau đó, đốt đoạn thân đèn cồn Khi lửa tắt dùng dao khử trùng cắt ngang dọc đoạn thân, cành thành lát mỏng Nuôi cấy lát mỏng môi trường PDA CPA 22-24oC Sau 3-5 ngày, kiểm tra sắc tố nấm tiết đĩa môi trường cách soi đĩa lên ánh sáng (hình 9, phụ lục 1) Tiếp theo, cấy truyền làm nấm Khêu mẫu nấm từ môi trường nuôi cấy đưa lên lam quan sát kính hiển vi Quan sát đặc điểm hình thái bào tử nấm thu So sánh với đặc điểm hình thái bào tử nấm P tracheiphila (phụ lục 1) 2.3.3 Phương pháp giám định PCR Sử dụng phương pháp PCR để giám định nấm P tracheiphila (Pertri) Kantachveli & Gikachvili gây bệnh khô cành cam quýt Quy trình chi tiết phụ lục III THẨM ĐỊNH KẾT QUẢ GIÁM ĐỊNH VÀ BÁO CÁO Sau khẳng định kết giám định bệnh khô cành cam quýt Phoma tracheiphila (Pertri) Kantachveli & Gikachvili- dịch hại kiểm dịch thực vật Việt Nam, đơn vị giám định phải gửi báo cáo Cục Bảo vệ thực vật kèm theo phiếu kết giám định (phụ lục 4) Tất đơn vị thuộc hệ thống Bảo vệ KDTV phải lưu giữ, quản lý khai thác liệu kết điều tra, báo cáo giám định bệnh khô cành cam quýt Đối với đơn vị lần giám định phát bệnh khô cành cam quýt Phoma tracheiphila (Pertri) Kantachveli & Gikachvili phải gửi mẫu tiêu Trung tâm Giám định kiểm dịch thực vật để thẩm định Đơn vị giám định phải đảm bảo thời gian lưu mẫu theo quy định hành IV TỔ CHỨC THỰC HIỆN Cục Bảo vệ thực vật có trách nhiệm phổ biến; tổ chức, hướng dẫn kiểm tra việc thực Quy chuẩn hệ thống tổ chức chuyên ngành Bảo vệ Kiểm dịch thực vật tổ chức, cá nhân khác có liên quan; Các tổ chức, cá nhân có hoạt động liên quan đến điều tra, thu thập mẫu, xử lý bảo quản mẫu bệnh khô cành cam quýt Phoma tracheiphila (Pertri) Kantachveli & Gikachvili Việt Nam phải tuân theo quy định quy chuẩn quy định pháp luật có liên quan hành Phụ lục Thông tin dịch hại Phân bố ký chủ 1.1 Phân bố Trong nước: Bệnh chưa có Việt Nam Trên giới: Châu Á (Armenia, Georgia, Iraq, Lebanon, Syria, Israel, Thổ Nhĩ Kì, Yemen), Châu Phi (Tunisia, Ai Cập, Libya, Algeria), Châu Âu (Hy Lạp, Albania, Hy Lạp, Italy, Liên Bang Nga, Cyprus, Pháp, Bỉ, Hà Lan) 1.2 Ký chủ: Hầu hết loài thuộc họ Citrus mẫn cảm với bệnh chanh (Citrus limon) loài bị hại nặng Các loài kí chủ khác Phật thủ (Citrus medica), Citrus bergamia, Quýt (Citrus reticulata), Cam chua (Citrus aurantium), Citrofortunella microcarpa, Citrus aurantiifolia, Citrus jambhiri, Citrus latifolia, Citrus limonia, Citrus macrophylla, Citrus sinensis, Citrus unshiu, Citrus x paradisi, Quất (Fortunella), Poncirus trifoliata Tên khoa học vị trí phân loại Tên tiếng Việt: Bệnh khô cành cam quýt Tên khoa học: Phoma tracheiphila (Pertri) Kantachveli & Gikachvili Tên khác: Bakerophoma tracheiphila (Petri) Cif Deuterophoma tracheiphila Petri Vị trí phân loại: Lớp: Dothideomycetes Bộ: Pleosporales Họ: Pleosporaceae Triệu chứng bệnh khô cành cam quýt Hình 1: Triệu chứng bệnh khô cành Hình 2: Lá rụng lại cuống bệnh khô cành cam quýt P tracheiphila cam quýt P tracheiphila (Nguồn: PaDIL, 2012) (Nguồn: PaDIL, 2012) Hình 3: Cành héo bệnh khô cành cam quýt P Hình 4: Chết bệnh khô cành cam quýt tracheiphila P tracheiphila (Nguồn: PaDIL, 2012) (Nguồn: PaDIL, 2012) Hình 5: Vết bệnh có chứa cành nấm P tracheiphila Hình 6: Triệu chứng bó mạch hóa hồng bệnh khô cành cam quýt (Nguồn: PaDIL, 2012) (Nguồn: PaDIL, 2012) Đặc điểm hình thái bào tử nấm P tracheiphila Quả cành hình cầu, kéo dài thành cổ ngắn có miệng nhỏ, màu đen đường kính 60165x45-150µm (hình 7, phụ lục 1) Các bào tử phân sinh nằm cành dạng đơn bào, kích thước 0,5-1,5x2-4µm Bào tử phân sinh sinh từ tế bào sinh bào tử Bào tử phân sinh (phialoconidia) đơn bào thường có đến giọt dầu màu suốt, dạng thẳng cong, đầu bào tử tròn kích thước 1,5-3x3-8µm thường sản sinh tế bào sinh bào tử sợi nấm tự phát triển vùng gỗ thân lộ ngoài, phần mô bị thương mạch dẫn (hình 8, phụ lục 1) Bào tử đính dạng chồi (blastoconidia) có dạng trứng dạng lê sinh từ mạch dẫn kí chủ môi trường nuôi cấy nhân tạo lỏng Hình 7: Quả cành nấm P tracheiphila (Nguồn: S Grasso,1992) Hình 8: Bào tử (phialoconidia) P tracheiphila Hình 9: Sắc tố đỏ đĩa đặt lát cành nhiễm bệnh khô cành môi trường PDA (Nguồn: EPPO,2004) (Nguồn: PaDIL, 2009) Phụ lục (quy định) Quy trình giám định bệnh khô cành cam quýt PCR Tách chiết DNA tổng số 1.1 Tách chiết DNA tổng số từ mô (mô gỗ, cành, lá) Nghiền 500mg mô chày cối sứ nitơ lỏng Chuyển 100mg mô nghiền vào ống eppendorf chứa 450µl dịch chiết cây.Trộn máy trộn dịch Ủ 65oC giờ.Thêm vào ống 300µl NaCI 6M trộn máy trộn dịch Ly tâm 12.000 vòng/phút 15 phút thu dịch vào ống Thêm phenol:chloroform:isoamylalcohol (25:24:1) vào ống với thể tích tương đương trộn máy trộn dịch Ly tâm 12.000 vòng/phút 15 phút thu dịch Thêm chloroform vào ống với thể tích tương đương trộn máy trộn dịch Ly tâm 12.000 vòng/phút 15 phút thu dịch Thêm isopropanol vào ống thể tích tương đương Ly tâm 12.000 vòng/phút 15 phút thu tủa DNA loại bỏ dịch Thêm vào ống 100µl Ethanol 70% để rửa tủa DNA Loại bỏ Ethanol để tủa DNA khô tự nhiên 10 phút Hòa tan tủa DNA 100µl TE pH8 bảo quản 4oC 1.2 Tách chiết DNA tổng số từ sợi nấm nuôi cấy môi trường Dùng kim khêu nấm vô trùng chuyển sợi nấm từ đĩa nuôi cấy vào ống eppendorf Nghiền nhỏ nấm chày nhựa vô trùng nitơ tỏng Chuyển hỗn hợp nghiền vào ống eppendorf chứa 400µl dịch chiết nấm Trộn máy trộn dịch Thêm vào ống 8µl Proteinase K 20mg/ml lắc nhẹ Ủ 65oC qua đêm.Thêm vào 300µl NaCI 6M trộn máy trộn dịch 30 giây Ly tâm 13.000 vòng/phút 30 phút thu dịch phía Thêm isopropanol vào ống với thể tích tương đương lắc nhẹ Ủ -20 oC lâu Ly tâm 13.000 vòng/phút 15 phút thu tủa DNA loại bỏ dịch Thêm vào 100µl Ethanol 70% để rửa tủa DNA Loại bỏ ethanol, để tủa DNA khô tự nhiên 10 phút Hòa tan tủa DNA 100µl TE pH8 bảo quản 4oC Nhân gen máy PCR Đoạn mồi sử dụng Pt-FOR2 (5'-GGATGGGCGCCAGCCTTC-3') Pt-REV2 (5'-GCACAAGGGCAGTGGACAAA-3') Master mix: 25µl phản ứng 1.5 mM MgCI2, 50 mM KCl; 200 µM loại dATP, dCTP, dGTP dTTP 1.0 µM mồi 10 ng DNA tách chiết 0.8 µl Taq DNA polymerase Chu trình nhiệt 94oC phút 94oC 30 giây 65oC 60 giây Lặp lại 30 chu kì o 72 C 90 giây 72oC phút Đọc kết Sản phẩm nhân gen điện di gel agarose 1,5% 2,5 hiệu điện 3,3 V/cm dung môi TAE Nhuộm gel ethidium bromide quan sát đèn UV Mẫu dương tính cho đoạn gen kích thước 378bp Thành phần dịch chiết dùng cho PCR 5.1 Thành phần dịch chiết 0,4 M NaCI; 10 mM Tris-HCI pH 8,0; 2,0 mM EDTA pH 8,0; 400 µg/mL proteinase K; 2% SDS 5.2 Thành phần dịch chiết nấm 400 mM NaCI; 10 mM Tris-CI pH 8,0; mM EDTA; 20 g/l SDS Phụ lục Một số loại môi trường nuôi cấy nấm Môi trường PDA Cân 200g khoai tây Cắt thành hình lập phương 1x1x1 cm Đun Lọc qua vải lọc thu nước Thêm 20g dextrose Thêm 15 g Agar Thêm nước cất cho đủ lít Môi trường CPA Rửa mài nhuyễn nghiền nhỏ cà rốt khoai tây Lấy loại 20g đun nước cất khoảng Lọc qua vải lọc thu lại phần nước Thêm vào 15g agar Thêm nước cất cho đủ lít Phụ lục (quy định) Mẫu phiếu kết giám định Cơ quan Bảo vệ Kiểm dịch thực vật ……………………………………… CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc ……… ngày … tháng … năm 20… PHIẾU KẾT QUẢ GIÁM ĐỊNH Bệnh khô cành cam quýt Phoma tracheiphila (Pertri) Kantachveli & Gikachvili- dịch hại kiểm dịch thực vật Việt Nam Tên hàng hóa : Nước xuất : Xuất xứ : Phương tiện vận chuyển : Địa điểm lấy mẫu : Ngày lấy mẫu : Người lấy mẫu : Tình trạng mẫu : Khối lượng: Ký hiệu mẫu : 10 Số mẫu lưu : 11 Người giám định : 12 Phương pháp giám định: Theo quy chuẩn kỹ thuật quốc gia QCVN 01 - 173 : 2014/BNNPTNT "Quy trình giám định bệnh khô cành cam quýt Phoma tracheiphila (Pertri) Kantachveli & Gikachvili- dịch hại kiểm dịch thực vật Việt Nam" 13 Kết giám định Tên khoa học: Phoma tracheiphila (Pertri) Kantachveli & Gikachvili Lớp: Dothideomycetes Bộ: Pleosporales Họ: Pleosporaceae Là dịch hại kiểm dịch thực vật thuộc danh mục dịch hại kiểm dịch thực vật Việt Nam TRƯỞNG PHÒNG KỸ THUẬT (hoặc người giám định) (ký, ghi rõ họ tên) THỦ TRƯỞNG ĐƠN VỊ (ký, ghi rõ họ tên, đóng dấu) ... ĐỊNH KẾT QUẢ GIÁM ĐỊNH VÀ BÁO CÁO Sau khẳng định kết giám định bệnh khô cành cam quýt Phoma tracheiphila (Pertri) Kantachveli & Gikachvili- dịch hại kiểm dịch thực vật Việt Nam, đơn vị giám định. .. Người giám định : 12 Phương pháp giám định: Theo quy chuẩn kỹ thuật quốc gia QCVN 01 - 173 : 2014/BNNPTNT "Quy trình giám định bệnh khô cành cam quýt Phoma tracheiphila (Pertri) Kantachveli & Gikachvili- ... đơn vị lần giám định phát bệnh khô cành cam quýt Phoma tracheiphila (Pertri) Kantachveli & Gikachvili phải gửi mẫu tiêu Trung tâm Giám định kiểm dịch thực vật để thẩm định Đơn vị giám định phải