Các kỹ thuật sắc ký

Header Page of 126 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LỚP: DH06SH ao0oa Bài tiểu luận môn Chẩn đoán bệnh gia súc, gia cầm sinh học phân tử Đề tài: CÁC KỸ THUẬT SẮC KÝ GVHD: PGS.TS NGUYỄN NGỌC HẢI Sinh viên thực hiện: ĐINH CÁT ĐIỀM MSSV: 06126027 Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 10/2009 Footer Page of 126 Header Page of 126 I) ĐẶT VẤN ĐỀ Các tế bào sống chứa hàng trăm loại hợp chất hóa học khác Các hợp chất bao gồm đại phân tử protein, acid nucleic, lipid,… hợp chất có trọng lượng phân tử nhỏ Những hợp chất diện số lượng nhỏ, dạng vết (enzyme) hay số lượng nhiều (các protein cấu tạo) Người ta muốn biết thành phần hóa học tế bào, nhằm hiểu rõ quy trình biến đổi nó, qua giúp sống ngày thêm tốt đẹp Muốn vậy, người ta phải tìm cách tách tách riêng chúng để xác định cấu trúc hóa học Từ đó, kỹ thuật tách riêng hợp chất đời với tên gọi sắc ký (chromatography) Ngày nay, sắc ký sử dụng để tách tất hợp chất dù có màu hay không, dù trọng lượng phân tử nhỏ hay lớn Nhưng phân tử sinh học thiên hình vạn trạng với trọng lượng phân tử lớn nhỏ khác nhau, tính phân cực nhiều hay khác nên có kỹ thuật sắc ký chung cho loại hợp chất khác Vì lý đó, thực đề tài: “Các kỹ thuật sắc ký” với hướng dẫn thầy Nguyễn Ngọc Hải II) TỔNG QUAN II.1) Lịch sử sắc ký ➢ Năm 1903, nhà bác học Nga Michael Tswett cho dung dịch sắc tố thực vật ete dầu hoả lên cột nhồi bột mịn canxi cacbonat, ông thấy sắc tố bị hấp phụ lên đầu cột Khi cho ete dầu hoả lên cột, sắc tố di chuyển cột từ xuống dưới, sắc tố có tốc độ riêng, tách thành vùng hay vòng màu xếp chồng lên nhau, hình thành hệ mà Tvest gọi sắc đồ Ông đặt tên cho phương pháp tách sắc ký (Chromatography) Trong tiếng Hy Lạp,“chroma” có nghĩa chất màu, graphein có nghĩa viết Tên gọi ngày sử dụng phương pháp dùng tách chất không màu ➢ Đến thập kỷ 1930-1940, phương pháp phát triển nhanh chóng với nhiều kỹ thuật khác sắc ký giấy, sắc ký lớp mỏng, sắc ký trao đổi ion, sắc ký lực, ➢ Năm 1954, Mould D.L phát triển sắc ký gel để tách hợp chất mang điện tích theo trọng lượng phân tử chúng Đến năm 1964, Moor gọi “gel permeation chromatography” hay gọi sắc ký lọc gel ➢ Năm 1906, sắc ký khí biết đến đến 1952, kỹ thuật phát triển mạnh mẽ, thập niên 1960 ➢ Năm 1967, Horvath C tác giả tạo máy sắc ký lỏng cao áp II.2) Định nghĩa sắc ký Sắc ký nhóm phương pháp hoá lý dừng để tách thành phần hỗn hợp Sự tách sắc ký dựa phân chia khác chất khác vào hai pha tiếp xúc không hoà lẫn vào nhau: pha tĩnh pha động (Trong thí nghiệm Tvest: pha tĩnh canxi cacbonat, pha động ete dầu hoả) Pha tĩnh trì hoãn di chuyển thành phần mẫu Khi thành phần di chuyển qua hệ thống sắc ký với tốc độ khác nhau, chúng tách khỏi theo thời gian Mỗi thành phần qua hệ thống khoảng thời gian riêng biệt, gọi thời gian lưu Trong kỹ thuật sắc ký, hỗn hợp chuyên chở chất lỏng khí thành phần tách phân bố khác Footer Page of 126 Header Page of 126 chất hòa tan chúng chảy qua pha tĩnh rắn lỏng Nhiều kỹ thuật khác dùng để phân tích hợp chất phức tạp dựa tính khác chất môi trường động khí lỏng môi trường hấp phụ tĩnh mà chúng di chuyển qua giấy, gelatin hay gel magnesium silicate, Sắc ký phương pháp để phân tách tinh phân tử sinh học Sắc ký phương pháp nhanh, dễ dàng không ảnh hưởng đến protein, phương pháp đề nghị nghiên cứu định lượng protein hay phân tử II.3) Các giai đoạn trình sắc ký: Quá trình sắc ký gồm giai đoạn chính: a) Đưa hỗn hợp lên pha tĩnh (ví dụ: đưa dung dịch sắc tố lên đầu cột canxi cacbonat) Các chất giữ pha tĩnh b) Cho pha động chạy qua pha tĩnh (dung môi để dầu hoả qua cột), pha động kéo theo chất di chuyển pha tĩnh với tốc độ khác nhau, tách khỏi có vị trí khác pha tĩnh tạo thành sắc ký đồ (chromatogram) Giai đoạn gọi khai triển sắc ký ✓ Nếu tiếp tục cho pha động chạy qua chất bị kéo pha tĩnh (ví dụ: khỏi cột) Đó trình rửa giải dung môi dùng dung môi rửa giải (eluent), dịch hứng cuối cột gọi dịch rửa giải (eluate) ✓ Nếu chất tách pha tĩnh (sắc ký khai thêm ta lấy phần pha tĩnh có mang chất (phân đoạn bột cột) đem chiết lấy chất ✓ Nếu chất tách pha tĩnh (sắc ký rửa giải) ta hứng thu lấy phân đoạn dịch rửa giải có chất cần phân tích c) Phát chất: Các chất màu phát dễ dàng, chất không màu phát đèn tử ngoại hay thuốc thử Trong sắc ký rửa giải phát chất chúng khỏi cột cách cho dung dịch rửa giải qua phận phát gọi detector đặt sau cột II.4) Phân loại phương pháp sắc ký II.4.1) Theo chất vật lý pha ✓ Pha động chất lỏng hay chất khí ✓ Pha tĩnh chất rắn (hạt xốp hay bột mắn) hay chất lỏng (được giữ chất mang rắn) Ð Do đó, dựa vào chất pha ta phân biệt phương pháp (trong tên phương pháp, pha động nêu trước pha tĩnh): Sắc ký lỏng - lỏng (liquid - liquid chromatography LLC) Sắc ký lỏng - rắn (liquid - song chromatography LSC) Sắc ký khí - lỏng (gas - liquid chromatography GLC) Sắc ký khí - rắn (gas - solid chromatography GSC) ✓ Hai phương pháp đầu gọi chung sắc ký lỏng (LC) Footer Page of 126 Header Page of 126 ✓ Hai phương pháp cuối gọi chung sắc ký khí (GC) II.4.2) Theo tượng sắc ký Sắc ký hấp phụ (absorption chromatography): pha tĩnh chất rắn có khả hấp phụ, phương pháp sắc ký lỏng - rắn khí - rắn Sắc ký phân bố (partition chromatography): pha tĩnh chất lỏng không hoà lẫn với pha động, chất lỏng bao bề mặt chất rắn gọi giá hay chất mang phải chất trơ, không tham gia vào sắc ký Sắc ký phân bố bao gồm sắc ký lỏng - lỏng sắc ký khí - lỏng Sắc ký trao đổi ion (ion - exchange chromatography): pha tĩnh chất nhựa trao đổi ion chớp chất cao phân tử có mang ion có khả trao đổi với ion dấu dung dịch hỗn hợp sắc ký) Sắc ký theo loại cỡ (size - exclusion chromatography): gọi sắc ký gel Các phân tử cỡ lớn loạt phân tử nhỏ tách theo kích thước phân tử nhỏ di chuyển chậm II.4.3) Theo kỹ thuật phương tiện sắc ký II.4.3.1) Theo phương pháp giữ pha tĩnh: Sắc ký cột (column chromatography: CC) pha tĩnh chứa cột kim loại hay thuỷ tinh Sắc ký lớp mỏng (thin layer chromatography: TLC): pha tĩnh tráng giữ mặt phẳng thuỷ tinh, nhựa hay nhôm Lớp mỏng pha tĩnh thường là: silicagel, nhôm oxit, xenlulozơ, chất nhựa trao đổi lớn có chiều dày khoảng 0,25 - 0,5mm Sắc ký giấy (paper chromatography - PC) pha tĩnh (lỏng) thấm loại giấy lọc đặc biệt gọi giấy sắc ký II.4.3.2) Theo cách cho pha động chạy ta có: Sắc ký khai triển (development chromatography) cho pha động kép chất chạy tách pha tĩnh (Sắc đồ nằm pha tĩnh) Sắc ký rửa giải (elution chromatoglaphy) cho pha động chạy kép chất pha tính (ra khỏi cột, khỏi giấy) II.5) Tốc độ di chuyển chất, peak hình dáng peak II.5.1) Tốc độ di chuyển chất Tốc độ di chuyên chất đặc trưng hệ số phân bố hai pha đại lượng lưu giữ chất pha tĩnh (thời gian lưu, thể tích lưu) a Thời gian lưu thể tích lưu Thời gian lưu thời gian cần để chất di chuyển qua cột sắc ký, khỏi cột nhờ thiết bị detector ghi nhận tín hiệu xuất rực sắc đồ (tính từ lúc bơm mẫu đến xuất peak) Footer Page of 126 Header Page of 126 Tm thời gian lưu chất không bị lưu giữ, nghĩa tốc độ di chuyển tốc độ di chuyển trung bình dung môi, thời gian gọi thời gian chết tR lớn, chất bị lưu giữ mạnh tốc độ di chuyển nhỏ Hình: Sắc ký đồ chất Thời gian lưu hiệu chỉnh tR tính theo công thức: Nếu trục hoành sắc đồ, dùng đơn vị đo thể tích dung môi ta có đại lượng tương tự: thể tích lưu VR thể tích lưu hiệu chỉnh VR' thể tích VM gọi thể tích chết cột hay gọi thể tích rỗng Vo b Hệ số phân bố Trong đó: Cs Cm nồng độ chất tan pha tĩnh pha động cân thiết lập Khi nồng độ nhỏ K phụ thuộc vào chất pha, chất tan nhiệt độ K lớn chất phân bố nhiều pha tĩnh di chuyển chậm c Hệ số dung lượng K' (hệ số phân bố khối lượng) Trong đó: Qs QM lượng chất tan phân bố pha anh pha động, K' phụ thuộc vào chất pha, chất chất tan, nhiệt độ đặc điểm cột Để tách hỗn hợp chất, người ta thường chọn cột, pha động điều kiện phân tích khác cho K' nằm khoảng từ đến II.5.2) Peak hình dáng peak a Hình dáng peak: Hình dáng lý tưởng tức lực đối xứng, thực tế lúc sắc ký gần đối xứng Chiều rộng tục đo 1/10 chiều cao peak b Sự kéo dài peak: kết di chuyển nhanh chậm khác phân tử chất qua cột sắc khí Các lực chậm tù c Hiệu lực cột: Hiệu lực cột thường đo hai thông số: số đĩa lý thuyết N chiều cao đĩa lý thuyết H Ta coi cột sắc khí chia thành N lớp hay N tầng mỏng, lớp phân bố chất tan vào hai pha đạt trạng thái cân Những tầng mỏng giả định gọi địa lý thuyết Nếu cột sắc khí có chiều dài L thì: H = N/L Cột có N lớn cột có hiệu lực cao Footer Page of 126 Header Page of 126 d Độ phân giải: Độ phân giải Rs tỉ số khoảng cách hai peak độ rộng trung bình peak ✓ Rs = 0,75 hai pic tách không tốt, xen phủ nhiều; ✓ Rs = 1,0 hai pic tách tốt, xen phủ 4%; ✓ Rs = l,5 hai pic tách hoàn toàn (chi xen phủ 0,3%) ✓ II.6) Các kỹ thuật sắc ký II.6.1) Sắc ký giấy Sắc ký giấy phương pháp phân tách dễ dàng thành phần hỗn hợp (acid amin) Trong sắc ký giấy, pha tĩnh tờ giấy cellulose ( thí dụ tờ giấy thấm, giấy lọc phòng thí nghiệm) Các lọai giấy có tính nước nên thực tế, pha tĩnh lớp nước (H2O) thật mỏng che phủ lên bề mặt tờ giấy, sắc ký giấy lọai sắc ký phân chia Pha động chất lỏng( chất lỏng hay hỗn hợp dung môi) Phương pháp thường sử dụng để tách chất ưa nước amino acid, đường, Trong giấy, cellulose có dạng sợi, sợi nằm cạnh tạo thành mạng lưới với lỗ rỗng to Khi ly giải, dung môi di chuyển dọc theo bề mặt sợi lỗ rỗng phủ đầy dung môi Như thế, chất tan bị phân tán nhiều lỗ rỗng khiến vết sắc ký to Bột giấy hấp thu nước, nước bị giữ lại cấu trúc glucopyranose cầu nối hydrogen, trình sắc ký xảy theo chế phân chia Hình: Sắc ký giấy, chất màu di chuyển theo dung môi lên giấy với điểm khác (a) Một giọt hỗn hợp (drop of mixture) đặt góc mảnh giấy lọc, cạnh giấy nằm dung môi (b) Dung môi di chuyển lên giấy lực hút mao mạch, chất phân bố theo tỷ lệ khác Mỗi hợp chất di chuyển với tốc độ phản ánh kích thước phân tử hòa tan dung môi (c) Những chất khác trải điểm khác biệt bảng , tạo thành sắc ký đồ Footer Page of 126 Header Page of 126 Ð Hiện nay, sắc ký giấy dần thay sắc ký lớp mỏng Do phần lớn chất hữu màu, nên sắc ký giấy không cho thấy vị trí mẫu chất trình dung môi di chuyển lên giấy Nhược điểm sắc ký giấy: Trong giấy, cellulose dạng sợi dài nằm song song kề cách tự nhiên, hệ thống mạng chắn có lỗ hỗng Khi dung môi giải ly di chuyển (mang theo chất tan, solute) dọc theo bề mặt sợi, lỗ rỗng dịp phủ đầy dung môi, chất tan có dịp khuếch tán vào lỗ rỗng này, khiến chất tan lúc to dần so với vết chấm tạo mức xuất phát ban đầu Còn sợi cellulose nén chặt dòng chảy khó di chuyển II.6.2) Sắc ký lớp mỏng Sắc ký lớp mỏng hay gọi sắc ký phẳng (planar chromatography), dựa chủ yếu vào tượng hấp thu pha động dung môi hỗn hợp dung môi, di chuyển ngang qua pha tĩnh chất trơ (thí dụ như: silicagel hay oxid alumin) Pha tĩnh tráng thành lớp mỏng, đều, phủ lên phẳng kiếng, nhôm hay plastic Do chất hấp thu tráng thành lớp mỏng nên phương pháp gọi sắc ký lớp mỏng ➢ Bình sắc ký: Một chậu, hũ, lọ thủy tinh, hình dạng đa dạng, có nắp đậy ➢ Pha tĩnh: Một lớp mỏng khoảng 0,25 nm loại hợp chất hấp thu (silicagel, alumin, ) tráng thành lớp mỏng, đều, phủ lên kiếng, nhôm, hay plastic Chất hấp thu nhờ giá đỡ sulphat canxi khan, tinh bột hay lọai polymer hữu ➢ Mẫu cần phân tích: thường hỗn hợp gồm nhiều chất với độ phân cực khác Sử dụng khoảng 1ul dung dịch mẫu với nồng độ pha lõang 2-5%, nhờ vi quản để chấm thành điểm gọn pha tĩnh, vị trí phái cao chút so với mặ thoáng chất lỏng chứa bình Hình: Bình sắc ký lớp mỏng ➢ Pha động: dung môi hay hỗn hợp dung môi, di chuyển chầm chậm dọc theo lớp mỏng, lôi kéo mẫu chất theo Dung môi di chuyển cao nhờ tính mao quản Mỗi thành phần chất di chuyển với vận tốc khác nhau, phía sau mực dung môi Vận tốc di chuyển phụ thuộc vào lực tương tác tĩnh điện mà pha tĩnh muốn níu giữ mẫu chất lại pha tĩnh tùy thuộc vào độ hòa tan mẫu chất dung môi ➢ Ưu điểm: -Chỉ cần lượng mẫu để phân tích -Có thể phân tích đồng thời mẫu chất chuẩn đối chứng điều kiện phân tích -Tất hợp chất mẫu phân tích định vị sắc ký lớp mỏng ➢ Các bước thực sắc ký lớp mỏng: -Chuẩn bị ống vi quản: ống thủy tinh có đường kính ống nhỏ, khỏang 1-2mm, đầu vót nhọn, dài 10-20cm Sử dụng ống vi quản để chấm nhiều lọai mẫu dung dịch khác nhau, cần sau lần sử dụng, rửa vi quản dung môi hữu aceton Footer Page of 126 Header Page of 126 -Chuẩn bị mỏng: mỏng thương mại 20x20cm, dùng kéo cắt với kiách thước cần thiết, phải vừa bình giải ly Dùng bút chì vạch nhẹ nét xuất phát mức tiền tuyến dung môi -Chuẩn bị dung dịch mẫu: Mẫu chất lỏng, chấm trực tiếp mẫu lên mỏng, mẫu dung dịch sễt, pha loãng mẫu Với mẫu chất rắn phải hòa tan dung môi hữu phù hợp, nồng độ 2-5% Nhờ vi quản để dung dịch mẫu lên bề mặt sắc ký lớp mỏng cách thận trọng, tránh không cho làm lũng bề mặt lớp mỏng Mỗi vết chấm không chứa nhiều 12ug (10ug tối ưu) mẫu chất -Sấy nhẹ để dung môi bay khỏi vết chấm, nhúng vào dung dịch giải ly -Giải ly để dung môi giải ly di chuyển lên: Sau bình bão hòa dung môi, người ta đặt mỏng vào bình khai triển vết chấm mẫu bờ cạnh phía đáy bình Cạnh đáy lớp mỏng nậgp dung môi giải ly khỏang 0.5-1cm Các vết mẫu không ngập dung môi giải ly, dung môi khuếch tán vào dung môi -Hiện hình vết sau giải ly: Các hợp chất có màu nhìn thấy mắt thường, phần lớn hợp chất hữu màu, nên muốn nhìn thấy vết, cần sử dụng phuơng pháp vật lý (Phát tia tử ngoại UV: đèn chiếu tia UV 254nm ánh sáng nhận hợp chất hấp thu tia UV, hợp chất có màu tối sẫm sáng; đèn chiếu tia UV 366nm ánh sàng phát nhữgn hợp chất có phát hùynh quang, vết sẫm chất mẫu có màu sáng mỏng sẫm màu) hay dùng phương pháp hóa học (Bằng cách dung thuốc thử iod, 2,7-fluorescein phát đa số hợp chất hữu cơ, ninhydrin phát aminoacid hay amin, 2,4-dinitrophenylhydrazin phát aldehyde hay caton, clorur antimony phát steroid hay vitamin hay carotenoid,…) - Ðại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển chất phân tích hệ số di chuyển Rf tính tỷ lệ khoảng dịch chuyển chất thử khoảng dịch chuyển dung môi: Trong đó: a khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm vết mẫu thử, tính cm, b khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi đo đường vết, tính cm Rf: Chỉ có giá trị từ đến l Footer Page of 126 Header Page of 126 Hình: Các bước trình sắc ký lớp mỏng II.6.3) Sắc ký cột: Sắc ký cột tiến hành điều kiện áp suất khí Pha tĩnh hạt có kích thước tương đối lớn (50-150um), nạp cột thủy tinh Mẫu chất cần phân tích đặt đầu cột, phía pha tĩnh (có lớp thủy tinh che chở để lớp mặt không bị xáo trộn), bình chứa dung môi giải ly đặt phái cao Dung môi giải ly khỏi cột phần bên cột hứng vào lọ nhỏ đặ ống dẫn cột Phương pháp thường làm cho trình tách bị chậm, hiệu thấp so với sắc ký lỏng cao áp (HPLC) Tuy vậy, sắc ký cột có ưu điểm pha tĩnh dụng cụ rẻ tiền, dễ kiếm, triển khai với lượng mẫu tương đối lớn ➢ Các bước thực sắc ký cột: -Lựa chọn chất hấp thu :pha tĩnh silicagel loại thường, hợp chất không phân cực giải ly khỏi cột trước, hợp chất phân cực giải ly sau Vơí phân tử không phân cực, phân tử naò có trọng luợng phân tử lớn có tính phân cực mạnh phân tử kia, bị pha tĩnh giữ lại cột nên di chuyển khỏi cột chậm so với phân tử nhỏ, có nóở lại lâu cột so với phân tử có tính phân cực - Lựa chọn dung môi:Mẫu cần sắc ký đuợc hoà tan hoàn toàn dung môi phù hợp với nồng độ 10mg/ml, gọi dung dịch mẫu (A) Chuẩn bị 4-6 mỏng 2,5x10cm Chấm lên tấm khoảng 2-5ul dd(A) Mỗi mỏng triển khai với loại dung môi giải ly khác nhau, kế phát đèn UV hay thuốc thử Với đơn dung môi dễ dàng thấy dung môi phù hợp Từ kết đó, cố gắng tìm hỗn hợp dung môi, dung môi phân cực dung môi phân cực thí dụ ete dầu hỏa: etyl acetate -Nạp chất hấp thu dạng khô vào cột: dùng kẹp giữ cho cột thẳng đứng giá, cho dung môi loại phân cực vào khoảng 2/3 chiều cao cột Cho chất hấp thu dạng khô vào thẳng cột, đặn, lần lượng nhỏ, vừa cho vừa khỏ nhẹ vào thành cột Khi lớp chất hấp thu đạt chiều cao khoảng 2cm cột, mở nhẹ khoá bên để cột dung môi chảy ra, hứng vào becher trống để bên cột, dung môi dẽ rót lại lên đầu cột Sau nạp xong, cho dung môi chảy qua chất hấp thu vài lần đến chất hấp thu cột đồng -Nạp mẫu: Mẫu dạng lỏng cho trực tiếp lên đầu cột sắc ký Nếu mẫu dạng rắn hoà tan mẫu chất vào lượng nhỏ dung môi, loại dung môi cho khởi đầu sắc ký Thực nạp mẫu lên cột sau: Footer Page of 126 Header Page 10 of 126 +Mở khoá cho dung môi chảy khỏi cột để hạ mức dung môi cột xuống cho vừa sát với mặ thoáng chất hấp thu cột +Đóng khoá lại, nạp dung dịch mẫu vào đầu cột Muốn nạp mẫu, sử dụng pipet hút dung dịch mẫu chất, đặt đầu pipet gần sát mặt thoáng cảu chất hấp thu cột, vừa bóp vừa rây pipet dọc quanh thành cột cho dung dịch chảy theo thành cột, chạm xuống bề mặt chất hấp thu +mở khoá bên cho dung môi chảy khỏi cột, làm cho dung dịch mẫu thấm hết vào chất hấp thu đầu cột, cần canh chừng không cho chất hấp thu đầu cột bị khô +Dùng pipet cho luợng nhỏ dung môi lên đầu cột, đồng thời dùng dung môi để rửa ống mà dung dịch dính thành cột +Mở khoá cho dung môi chảy Lặp laị vài lần giúp cho dung dịch mẫu thấm sâu vào chất hấp thu, dung môi suốt không lây màu chất mẫu +Sử dụng thủy tinh, gòn, cát hay giấy lọc đặt nhẹ lên mặt thoáng chất hấp thu để bảo vệ mặt cột +Cho dung môi vào đầy cột để tiến hành giải ly cột II.6.4) Sắc ký trao đổi ion Sự trao đổi ion gắn kết có tính chất thuận nghịch phân tử có mang điện tích Trong sắc ký cột nhồi , pha tĩnh R có gắn thêm nhóm chức G mang điện tích Giả sử cho ngang qua cột hỗn hợp mẫu chất ban đầu có chứa nhiều lọai chất tan (solute) khác nhau, chất tan có mang điện tích ngược dấu với điện tích nhóm chức, thí dụ chất tan S, chất tan dẽ đuổi đối ion C chỗ vào, để gắn vào pha tĩnh, chất tan bị giữ lại cột, chất khác hỗn hợp mẫu chất ban đầu không bị giữ lại nên khỏi cột kỹ thuật tách riêng hợp chất S khỏi hỗn hợp ban đầu RG- + S+ € RG-S+ + C+ Hoặc RG+ +S- -€ RG+S- + CTrong đó: R pha tĩnh hay gọi nhựa (resin), G nhóm chức mang điện tích cố định pha tĩnh hay gọi nhóm chức họat động nhựa C đối ion G S chất hữu có mang điện tích trái dấu với G ➢ Các loại hạt nhựa trao đổi ion: nhựa polystyren, silicagel, polymer carbohydrate ➢ Các bước sắc ký trao đổi ion: -Nhồi nhựa trao đổi ion vào cột: Giữ cột thẳng đứng giá, khóa vòi bên cột Nhựa trao đổi ion đã cân dung dịch đệm, lượng nhựa thể tích dung môi cho rót nhựa dễ dàng vào cột, không tạo bọt khí nằm giữ hạt nhực Để yên 5-10 phút cho hạt nhựa lắng xuống, rót đầy cột dung dịch đệm, mở khóa hạt nhựa lắng xuống Khi nhồi cột hoàn tất, cần cân cột chách cho dung dịch đệm chày qua cột, cuối kiểm tra pH dung dịch chảy khỏi cột -Nạp mẫu chất lên đầu cột: dung dịch mẫu lọc suốt trước nạp vào cỗt, lọc tờ giấy lọc hay ngang qua lớp celite Lượng mẫu tùy vào lượng nhựa khả trao đổi nhựa Đầiu quan trọng tất cấu tử quan trọng mẫu chất hấp thu hết vào nhựa, tức ý số lượng mẫu thể tích mẫu Để nạp mẫu lên cột: mở khóa để hạ mức dung dịch đệm xuống vừa sát mức nhựa đầu cột, khóa lại dùng pipet hút đặt dung dịch mẫu lên đầu cột, mở khóa cho dung dịch mẫu hút vào lớp nhựa đầu cột Để yên 10-20 phút mẫu chất tiếp xúc cân với nhựa 10 Footer Page 10 of 126 Header Page 11 of 126 -Khi tất mẫu gắn lên đầu cột nhựa, cho vài ml dung dịch đệm ban đầu chảy qua, nối cột với bình cung cấp dung dich giải ly -Giải ly cách tắng dần nồng độ dung dịch giải ly: hỗn hợp mẫu gắn vào nhựa trao đổi ion dung dịch đệm có nồng độ thấp Để tách mẫu chất khỏi nhựa thường, cần phải gia tăng lực ion dung dịch đệm cách cho thêm NaCl Khi có thêm NaCl dung dịch đệm, ion dung dịch đệm cạnh tranh với hỗn hợp mẫu chất, để giành lấy nhóm chức họat động cảu nhựa, đẩy hợp chất khỏi nhựa, theo dòng chảy khỏi cột ➢ Trong phương pháp sắc ký trao đổi ion, pha tĩnh hạt mang sẵn điện tích định, hạt tương tác với phân tử (protein) mang điện tích trái dấu với chúng Cụ thể, hạt mang điện âm (như cột carboxymethyl-cellulose (CM-cellulose)), tiến trình gọi sắc ký trao đổi ion dương, tương tác với phân tử mang điện tích dương Ngược lại, hạt mang điện tích dương (như cột diethylaminoethyl-cellulose (DEAEcellulose)), gọi sắc ký trao đổi ion âm, tương tác với phân tử mang điện tích âm Vì thế, protein dấu với cột chạy khỏi cột protein trái dấu bị giữ lại cột Để phóng thích protein này, ta tăng nồng độ ion pha động, ion phân tử protein tương tác với hạt mang điện tích Ví dụ, sắc ký trao đổi ion dương, ta thêm muối natri clorua hay muối khác dung dịch tách giải ion natri tranh bám vào cột với protein có điện tích dương, đó, protein mang điện tích dương phóng thích cột theo độ lớn điện tích II.6.5) Sắc ký gel Trong sắc ký gel, pha tĩnh mạng polymer có lỗ rỗng lỗ rỗng phủ đầy dung môi dùng làm pha động Một hỗn hợp gồm nhiều hợp chất có trọng lượng phân tử khác cò thể tách riêng hay không tuỳ vào kích thước lỗ rỗng Các phân tử có kích thước lớn lỗ rỗng, chui lọt vào bên lỗ rỗng, nhanh chóng theo dòng chảy pha động khỏi cột phân tử có trọng lượng phân tử (TLPT) nhỏ kích thước lỗ rỗng, toàn phần hay bán phần lọt vào lỗ rỗng, cuối theo dòng chảy khỏi cột chậm trễ Dòng chảy pha động khiến phân tử lớn chui vào lỗ rỗng mạng gel, nhanh chóng xuyên qua cột, khỏi cột, phân tử nhỏ khỏi cột lâu chui vào khỏi lỗ rỗng gel Như vậy, thành phần khác hỗn hợp mẫu ngang qua cột sắc ký gel, khỏi cột theo trình tự TLPT lớn khỏi cột trước, phân tử nhỏ khỏi cột sau Footer Page 11 of 126 11 Header Page 12 of 126 Sắc ký gel phải thực cột hình ống trụ thuỷ tinh, gồm bước sau: -Nhồi gel vào cột: hạt gel trương nở diện dạng huyền phù dung môi phù hợp cho vào cột Huyền phù chỉnh cho thật sệt rót chảy vào cột thành dòng dễ dàng Cân cột cách cho dung môi giải ly chảy ngang qua cột, lượng dung môi tích 2-3 lần thể tích cột Kiểm tra chặt chẽ cột cách cho lượng mẫu thử vào đầu cột mẫu thử thường chọn dextran blue 2000, có màu xanh dương để quan sát mắt thường di chuyển mẫu cột -Đặt mẫu cần sắc ký lên đầu cột gel: dung dịch mẫu cần phân tách phải lọc bỏ hợp chất dạng rắn, cặn Dung dịch mẫu hoà tan vào dung dịch đệm, đặt lên đầu cột giống sắc ký cột -Triển khai sắc ký gel: triển khai giải ly đơn giản, sử dụng kỹ thuật dung môi đơn nồng độ (nghĩa sử dụng loại dung môi hay hỗn hợp hai dung môi, bắt đầu kết thúc trình giải ly sứ dụng loại dung môi đó) giải lycó thể trọng lực tốt sử dụng bơm đẩy từ đầu cột hứng dung môi giải ly lọ nhỏ, lọ có thể tích định Các chất tan khỏi cột theo thứ tự TLPT giảm dần ➢ Ứng dụng: kỹ thuật dùng để tách đại phân tử có nguồn gốc sinh học như: protein, polysaccharide, acid nuleic, enzyme, Người ta ứng dụng vào việc đóan TLPT hợp chất chưa biết II.6.6) Sắc ký lực Sắc ký lực hấp thụ phát lực sinh học mà phân tử sinh học có với phân tử khác cố định pha ổn định Có nhiều phương pháp để rửa giải phân tử lực có nhiều loại sắc ký lực khác nhau, bước theo gradient thường sử dụng Thường sử dụng hệ thống có áp suất thấp Các giá thể (thường agarose) thường chịu áp suất 50psi Nhược điểm: đắt tiền, khó tẩy rửa, chọn lọc ligand (phối tử), gắn kết ligand lên giá thể hoạt hóa thường gặp nhiều khó khăn Ưu điểm: phát triển phương pháp tinh protein A (protein A antigen cho IgG), bước bắt giữ tốt, cho phép phân tách protein dạng nguyên thủy họat tính với dạng biến tính Footer Page 12 of 126 12 Header Page 13 of 126 ❖ Sử dụng sắc ký lực cho tương tác kháng nguyên kháng thể: ta tinh kháng nguyên chách cho mẫu qua cột có chứa giá thể liên kết với kháng thể để thu nhận protein Ngược lại, giá thể có liên kết với kháng nguyên chuyên biệt bắt giữ kháng thể chuyên biệt cho kháng nguyên Ứng dụng nhiều gắn kết protein A vào gel để gắn kết với globulin miễn dịch II.6.7) Sắc ký tương tác kỵ nước Sắc ký tương tác kỵ nước phuơng pháp bổ sung tốt cho kỹ thuật phân tách khác Trong năm gần đây, phương pháp trở nên thông dụng bước trình sắc ký Loại hạt Macro-Prep có dẫn xuất nhóm kỵ nước, gốc methyl hay t-butyl Các gốc hấp dẫn gốc kỵ nước khác có bề mặt protein Khi cho mẫu protein vào điều kiện nồng độ muối cao ép phần kỵ nước lại gần đính với Quá trình rửa giải thực cách giảm dần nồng độ muối phần kỵ nước lại vào dung dịch Đặc điểm: Phân tách phân tử theo tính kỵ nước phân tử Các nhóm kỵ nước khác đựợc cố đinh bề mặt giá thể Dưới điều kiện nồng độ muối cao (thấp) CÁC phần kỵ nước phân tử tương tác nhóm cố định Các phân tử gắn kết giải cách giảm áp lực ion hòa tan phân tử khỏi giá thể Ưu điểm: Là bước cho phép cô mẫu, công suất cao, nhanh, mẫu thu nhận nồng độ muối thấp Nhược điểm: số protein bị tủa nồng độ muối cao, khó nâng cấp quy mô lớn 13 Footer Page 13 of 126 Header Page 14 of 126 II.6.8) Sắc ký khí Sắc ký khí phương pháp dùng để tách chất thể khí bay hơi, với pha động chất khí, gọi khí mang (carrier gas) Sắc ký khí áp dụng cho chất khí, lỏng, rắn dễ bay bền nhiệt độ cao, có TLPT M2000 - Các thành phần máy sắc ký lỏng hiệu cao 1) Bình chứa dung môi Thường làm thuỷ tinh, làm thép không rỉ, phương pháp rửa giải thông thường cần bình chứa dung môi, phương pháp rửa giải gradient thường dùng 2, 3, bình chứa dung môi khác hệ dung môi rửa giải hỗn hợp loại dung môi trộn lẫn với theo ti lệ xác định Cần loại hạt khí hoà tan dung môi 2) Hệ thống bơm Bơm dùng phương pháp phải tạo áp suất cao (3000 - 6000 psi hay khoảng 250 500at), lưu lượng bơm khoảng 0,1 đến 10 ml/ph, phải trơ với dung môi Hệ thống bơm phải có khả bơm pha động qua cột áp suất cao mà không bị ngắt quãng tạo nhịp sóng làm sai lệch lực thu Có nhiều kiểu bơm dùng máy HPLC; kiểu phông xoay chiều dùng phổ biến 3) Hệ bơm mẫu (hệ tiêm mẫu) Footer Page 16 of 126 16 Header Page 17 of 126 Mẫu bơm vào cột nhờ hệ thống van mẫu Người ta bơm mẫu vào vòng mẫu với thể tích thường từ 10 đến 20 μl 4) Cột sắc ký Kiểu cột thường phụ thuộc vào phương pháp dùng để tách, thường cột thép không gỉ, có cỡ lỗ xác đường kính từ đến túm dài từ 10 đến 30cm (những cột dùng cho SEC đường rộng dài đến 100cm) Loại cột có hiệu lực cao, có số (ra lý thuyết lên đến 100.000 đĩa cho 1m chiều dài cột) 5) Detector Là phận phát chất chứng khỏi cột ghi nhận tín hiệu ghi sắc ký đồ Hiện sử dụng loại detector sau: Detector tử ngoại (UV): Dùng đèn thuỷ ngân cho vạch 254nm Nhiều chất hấp thụ bước sóng Detector tử ngoại khả kiến (UV-VIS): Dùng phổ quang kế lựa chọn bước sóng từ 195 đến 750 nm Loại dùng nhiều Detector điện hoá detector huỳnh quang có độ nhạy độ chọn lọc cao dùng phân tích vết Dùng detector điện hoá phát lượng picrogam (10-12g) ❖ Các phương pháp sắc ký hiệu cao a) Sắc ký phân bố hiệu cao Gồm hai loại: Sắc khí lỏng - lỏng sắc ký pha liên kết - Sắc ký lỏng - lỏng (LLC): Pha tĩnh chất lỏng bao bề mặt hạt chất mang, tức hấp phụ chất mang - Sắc ký pha liên kết (BPC): Pha tĩnh gắn hoá học với chất mang tạo liên kết siloxan nối nhóm - silic với silicagen b Sắc ký hấp phụ hiệu cao (sắc ký lỏng - rắn LSC) Pha tĩnh chất rắn mà bề mặt có chứa nhóm hiđroxil phân cực, pha động dung môi không phân cực c) Sắc ký trao đối ion hiệu cao (IEC) Pha tĩnh rắn chứa nhựa trao đổi lớn dạng bột mịn, pha động thường dung dịch nước d Sắc ký lỏng hiệu cao gel (sốc ký loại cỡ SEC) Phương pháp ứng dụng chủ yếu cho chất có phân tử lượng lớn Chất nhồi cho SEC hạt xốp silicagent hay polyme có kích thước nhỏ ( 10 μm) Pha tĩnh dung môi nằm lỗ xốp hạt, pha động dung môi chảy hạt Chỉ phân từ nhỏ khuếch tán vào lớp xốp, rửa giải phân tử theo cỡ từ lớn đến nhỏ Footer Page 17 of 126 17 Header Page 18 of 126 So Sánh Giữa Kỹ Thuật Sắc Ký Lỏng Cao Áp (HPLC) Sắc Ký Khí (GC) - Độ bay + HPLC: Không yêu cầu bay hơi, mẫu phải tan pha động + GC: Mẫu phải bay - Độ phân cực + HPLC: Tách loại hợp chất phân cực không phân cực + GC: Mẫu phân cực không phân cực - Độ bền nhiệt + HPLC: Phép phân tích thực nhiệt độ thấp (nhiệt độ phòng hay thấp hơn) + GC: Mẫu buộc phải tồn nhiệt độ cao (nhiệt độ tách cột buồng tiêm mẫu) - Khối lượng phân tử + HPLC: Không có giới hạn mặt lý thuyết, thực tế độ hoà tan giới hạn + GC: Đặc trưng < 500 amu - Chuẩn bị mẫu + HPLC: Mẫu buộc phải lọc, mẫu nên có dung môi hoà tan pha động + GC: Dung môi phải bay có nhiệt độ sôi thấp chất phân tích - Lượng mẫu + HPLC: Lượng mẫu phụ thuộc vào đường kính (trong) cột + GC: Thường từ –5 μl - Cơ chế tách + HPLC: Thực pha động tĩnh + GC: Chỉ có pha động mang mẫu - Detecter – Đầu dò + HPLC: Thông dụng UV-VIS + GC: Thông dụng FID, dùng cho phân tích chất hữu Footer Page 18 of 126 18 Header Page 19 of 126 III KẾT LUẬN: Sắc ký kỹ thuật ứng dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực giới Việt Nam tiếp cận kỹ thuật vào năm thập niên 80 Vì điều kiện sống ngày cao, nên đòi hỏi phải có công nghệ kỹ thuật đáp ứng nhu cầu Bên cạnh có số người, lợi nhuận cá nhân mà bất chấp tất Ngày nay, để kiểm soát kiểm tra tình hình chất lượng hàng hoá để đáp ứng nhu cầu sống như: thực phẩm, dược phẩm, hoá chất… Vì kỹ thuật sắc ký có vai trò lớn công tác kiểm tra, giám sát chất lượng mà kỹ thuật hoàn toàn đảm đương yêu cầu Ví dụ như: kiểm tra dư lượng kháng sinh (nitrofuran, tetracycline…) thuỷ sản, kiểm tra dư lượng hoocmon (clenbuterol, salbutamol…) kích thích tăng trưởng, tạo nạc cho gia súc, kiểm tra dư lượng màu bị cấm có thực phẩm mỹ phẩm như: Sudan có trứng gia cầm son môi, MCPD (3_monoclo_propan_1,2_diol) có nước tương, formone có bánh phở, xác định số phương pháp chế biến bảo quản nhằm loại trừ phát triển nấm mốc gây độc (có độc tố Aflatoxin) lô hàng nông sản dự trữ xuất đặc biệt đậu tương lạc …Trong công nghiệp dược phẩm, sơn: Kiểm tra hàm lượng hoạt chất dược phẩm, dư luợng chất gây độc hại… Ngoài ứng dụng nhiều lĩnh vực khác quan trắc, môi trường… Vì vậy, với mục đích sử dụng mà ta chọn phương pháp sắc ký phù hợp để phân tích mẫu tương ứng IV) TÀI LIỆU THAM KHẢO 1) Nguyễn Kim Phi Phụng, Phương pháp cô lập chất hữu cơ, NXB ĐHQGTPHCM, 2007, Trang 151-451 2) Trần Nhật Phương, Học phần kỹ thuật Công Nghệ Sinh Học- Proteomic/Sắc ký, 2008, 12trang 3) Nguyễn Tuấn Anh, Đỗ Thị Lan, Nguyễn Thế Hùng, Giáo trình phân tích môi trường, ĐH Nông Lâm Thái Nguyên, trang 49-59 4) Sắc ký giấy: http://www.chemguide.co.uk/analysis/chromatography/paper.html http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/C/Chromatography_paper.html http://en.wikipedia.org/wiki/file:cromatography_tank.png http://peer.tamu.edu/podium_poster_presentations/Paper% 20Chromatography.ppt 5) Sắc ký lớp mỏng: Piia Salo, Thin-Layer Chromatography with Ultravioletand Mass Spectrometric Detection: From Preparative-Layer to Miniaturized Ultra-Thin-Layer Technique ,Division of Pharmaceutical Chemistry Faculty of Pharmacy University of Helsinki, Finland http://www.waters.com/waters/nav.htm?locale=en_US&cid=10048919 http://www.chromatography-online.org/Principles/TLC-Apparatus/Chambers.html 6) Sắc ký cột: http://en.wikipedia.org/wiki/Column_chromatography 7) Sắc ký trao đổi ion: http://www.separations.us.tosohbioscience.com/ServiceSupport/TechSupport/ResourceCenter/Pr inciplesofChromatography/IonExchange/ 8) Sắc ký gel: http://www.separations.us.tosohbioscience.com/ServiceSupport/TechSupport/ResourceCenter/Pr inciplesofChromatography/SizeExclusion/ 9) Sắc ký tương tác kỵ nước: Footer Page 19 of 126 19 Header Page 20 of 126 http://www.separations.us.tosohbioscience.com/ServiceSupport/TechSupport/ResourceCenter/Pr inciplesofChromatography/HydrophobicInteraction/ 10) Sắc ký lực: http://fachschaft.biochemtech.uni-halle.de/downloads/chromatography/affchr.pdf http://www.separations.us.tosohbioscience.com/ServiceSupport/TechSupport/ResourceCenter/Pr inciplesofChromatography/Affinity/ 11) Sắc ký khí: http://en.wikipedia.org/wiki/Gas-liquid_chromatography http://teaching.shu.ac.uk/hwb/chemistry/tutorials/chrom/gaschrm.htm http://www.chemistry.nmsu.edu/Instrumentation/GC_MS.html 12) Sắc ký lỏng cao áp: http://elchem.kaist.ac.kr/vt/chem-ed/sep/lc/hplc.htm Footer Page 20 of 126 20 ... pháp phát triển nhanh chóng với nhiều kỹ thuật khác sắc ký giấy, sắc ký lớp mỏng, sắc ký trao đổi ion, sắc ký lực, ➢ Năm 1954, Mould D.L phát triển sắc ký gel để tách hợp chất mang điện tích... gọi sắc ký lọc gel ➢ Năm 1906, sắc ký khí biết đến đến 1952, kỹ thuật phát triển mạnh mẽ, thập niên 1960 ➢ Năm 1967, Horvath C tác giả tạo máy sắc ký lỏng cao áp II.2) Định nghĩa sắc ký Sắc ký. .. nhiều hay khác nên có kỹ thuật sắc ký chung cho loại hợp chất khác Vì lý đó, thực đề tài: Các kỹ thuật sắc ký với hướng dẫn thầy Nguyễn Ngọc Hải II) TỔNG QUAN II.1) Lịch sử sắc ký ➢ Năm 1903, nhà