Methods in Molecular Biology 1595 Michael Schrader Editor Peroxisomes Methods and Protocols Methods in Molecular Biology Series Editor John M. Walker School of Life and Medical Sciences University of Hertfordshire Hatfield, Hertfordshire, AL10 9AB, UK For further volumes: http://www.springer.com/series/7651 Peroxisomes Methods and Protocols Edited by Michael Schrader College of Life and Enivornmental Sciences, Biosciences, University of Exeter, Exeter, UK Editor Michael Schrader College of Life and Environmental Sciences, Biosciences University of Exeter Exeter, UK ISSN 1064-3745 ISSN 1940-6029 (electronic) Methods in Molecular Biology ISBN 978-1-4939-6935-7 ISBN 978-1-4939-6937-1 (eBook) DOI 10.1007/978-1-4939-6937-1 Library of Congress Control Number: 2017937360 © Springer Science+Business Media LLC 2017 This work is subject to copyright All rights are reserved by the Publisher, whether the whole or part of the material is concerned, specifically the rights of translation, reprinting, reuse of illustrations, recitation, broadcasting, reproduction on microfilms or in any other physical way, and transmission or information storage and retrieval, electronic adaptation, computer software, or by similar or dissimilar methodology now known or hereafter developed The use of general descriptive names, registered names, trademarks, service marks, etc in this publication does not imply, even in the absence of a specific statement, that such names are exempt from the relevant protective laws and regulations and therefore free for general use The publisher, the authors and the editors are safe to assume that the advice and information in this book are believed to be true and accurate at the date of publication Neither the publisher nor the authors or the editors give a warranty, express or implied, with respect to the material contained herein or for any errors or omissions that may have been made The publisher remains neutral with regard to jurisdictional claims in published maps and institutional affiliations Printed on acid-free paper This Humana Press imprint is published by Springer Nature The registered company is Springer Science+Business Media LLC The registered company address is: 233 Spring Street, New York, NY 10013, U.S.A This book is dedicated to Tina, Anna and Paula—the “lighthouses” in my life—who make it all possible and to my parents for their ongoing support and interest in peroxisomes Preface This edition of Peroxisomes: Methods and Protocols assembles a volume of easily accessible protocols particularly useful for those already working on peroxisomes (and other membrane-bound organelles) as well as for those who would like to start working on this fascinating organelle Due to their growing importance in health and development, there is increasing interest in the study of peroxisomes Furthermore, peroxisomes combine properties which render them suitable model organelles to study diverse molecular processes in eukaryotic cells This edition assembles a comprehensive collection of methods, techniques and strategies to investigate the molecular and cellular biology of peroxisomes in different organisms It aims to provide valuable instructions, guidelines and protocols for molecular cell biologists, biochemists and biomedical researchers with an interest in peroxisome biology Protocols addressing peroxisomes in humans, yeast, fungi and plants are covered Chapters illustrating the isolation of peroxisomes, investigation of properties of membrane proteins, biochemical assays to measure peroxisome metabolic function or protocols to investigate and manipulate peroxisomes in cellular systems have been included Other chapters address the detection of peroxisomes, including immunofluorescence, cytochemistry, cryo-immuno-electron microscopy and live cell imaging approaches More specialised chapters deal with peroxisomal redox measurements, determination of pH, peroxisome biogenesis, import of peroxisomal proteins, protein modification or pexophagy, to name a few Finally, the clinical and laboratory diagnosis of peroxisomal disorders and the use of patient fibroblasts are addressed I would like to express my sincerest appreciation to all of the authors who contributed chapters to this volume They were a pleasure to work with, providing state-of-the-art protocols (and one review) in a timely fashion, while cheerfully responding to all of my queries I would also like to thank Professor John Walker, editor of the Methods in Molecular Biology series, for his invaluable advice and input in all aspects of the formulation of this book This is truly an exciting time to be involved in peroxisome research, as vital functions of this dynamic organelle in humans, plants and fungi are being discovered I hope you will get excited about peroxisome biology, that you will take advantage of the methods, techniques and strategies provided and that this volume of protocols will serve you well to tackle peroxisome- and organelle-based research questions Exeter, Devon, UK Michael Schrader vii Contents Preface vii Contributors xiii Isolation of Peroxisomes from Rat Liver and Cultured Hepatoma Cells by Density Gradient Centrifugation Andreas Manner and Markus Islinger Isolation of Peroxisomes from Mouse Brain Using a Continuous Nycodenz Gradient: A Comparison to the Isolation of Liver and Kidney Peroxisomes Miriam J Schönenberger and Werner J Kovacs Determining the Topology of Peroxisomal Proteins Using Protease Protection Assays Tânia Francisco, Ana F Dias, Ana G Pedrosa, Cláudia P Grou, Tony A Rodrigues, and Jorge E Azevedo Isolation of Native Soluble and Membrane-Bound Protein Complexes from Yeast Saccharomyces cerevisiae Tobias Hansen, Anna Chan, Thomas Schröter, Daniel Schwerter, Wolfgang Girzalsky, and Ralf Erdmann Method for Measurement of Peroxisomal Very Long-Chain Fatty Acid Beta-Oxidation and De Novo C26:0 Synthesis Activity in Living Cells Using Stable-Isotope Labeled Docosanoic Acid Malu-Clair van de Beek, Inge M.E Dijkstra, and Stephan Kemp Analysis of Plasmalogen Synthesis in Cultured Cells Masanori Honsho and Yukio Fujiki Transfection of Primary Human Skin Fibroblasts for Peroxisomal Studies Janet Koster and Hans R Waterham siRNA-mediated Silencing of Peroxisomal Genes in Mammalian Cells Tina A Schrader and Michael Schrader Dual Reporter Systems for the Analysis of Translational Readthrough in Mammals Julia Hofhuis, Severin Dieterle, Rosemol George, Fabian Schueren, and Sven Thoms 10 Cytochemical Detection of Peroxisomes in Light and Electron Microscopy with 3,3′-diaminobenzidine H Dariush Fahimi 11 Cryo-Immuno Electron Microscopy of Peroxisomal Marker Proteins Karina Mildner and Dagmar Zeuschner 12 Detection and Immunolabeling of Peroxisomal Proteins Tina A Schrader, Markus Islinger, and Michael Schrader ix 13 27 37 45 55 63 69 81 93 101 113 x Contents 13 Labeling of Peroxisomes for Live Cell Imaging in the Filamentous Fungus Ustilago maydis Sofia C Guimarães, Sreedhar Kilaru, Michael Schrader, and Martin Schuster 14 Quantitative Monitoring of Subcellular Redox Dynamics in Living Mammalian Cells Using RoGFP2-Based Probes Celien Lismont, Paul A Walton, and Marc Fransen 15 KillerRed as a Tool to Study the Cellular Responses to Peroxisome-Derived Oxidative Stress Marc Fransen and Chantal Brees 16 Determination of Peroxisomal pH in Living Mammalian Cells Using pHRed Luis F Godinho and Michael Schrader 17 In Cellulo Approaches to Study Peroxisomal Protein Import – Yeast Immunofluorescence Microscopy Tobias Hansen, Wolfgang Girzalsky, and Ralf Erdmann 18 Blue Native PAGE: Applications to Study Peroxisome Biogenesis Kanji Okumoto, Shigehiko Tamura, and Yukio Fujiki 19 In Vitro PMP Import Analysis Using Cell-Free Synthesized PMP and Isolated Peroxisomes Yuqiong Liu, Masanori Honsho, and Yukio Fujiki 20 Peroxisomal Membrane and Matrix Protein Import Using a Semi-Intact Mammalian Cell System Kanji Okumoto, Masanori Honsho, Yuqiong Liu, and Yukio Fujiki 21 The Use of Glycosylation Tags as Reporters for Protein Entry into the Endoplasmic Reticulum in Yeast and Mammalian Cells Judith Buentzel and Sven Thoms 22 Detection of Ubiquitinated Peroxisomal Proteins in Yeast Natasha Danda and Chris Williams 23 Assessing Pexophagy in Mammalian Cells Shun-ichi Yamashita and Yukio Fujiki 24 Experimental Systems to Study Yeast Pexophagy Shun-ichi Yamashita, Masahide Oku, Yasuyoshi Sakai, and Yukio Fujiki 25 Flow Cytometric Analysis of the Expression Pattern of Peroxisomal Proteins, Abcd1, Abcd2, and Abcd3 in BV-2 Murine Microglial Cells Meryam Debbabi, Thomas Nury, Imen Helali, El Mostafa Karym, Flore Geillon, Catherine Gondcaille, Doriane Trompier, Amina Najid, Sébastien Terreau, Maryem Bezine, Amira Zarrouk, Anne Vejux, Pierre Andreoletti, Mustapha Cherkaoui-Malki, Stéphane Savary, and Gérard Lizard 26 Study of Peroxisomal Protein Phosphorylation by Functional Proteomics Andreas Schummer, Sven Fischer, Silke Oeljeklaus, and Bettina Warscheid 131 151 165 181 191 197 207 213 221 233 243 249 257 267 Contents 27 Analysis of Peroxisomal β-Oxidation During Storage Oil Mobilization in Arabidopsis thaliana Seedlings Björn Hielscher, Lennart Charton, Tabea Mettler-Altmann, and Nicole Linka 28 Peroxisome Mini-Libraries: Systematic Approaches to Study Peroxisomes Made Easy Noa Dahan, Maya Schuldiner, and Einat Zalckvar 29 Generation of Peroxisome-Deficient Somatic Animal Cell Mutants Kanji Okumoto and Yukio Fujiki 30 Clinical and Laboratory Diagnosis of Peroxisomal Disorders Ronald J.A Wanders, Femke C.C Klouwer, Sacha Ferdinandusse, Hans R Waterham, and Bwee Tien Poll-Thé xi 291 305 319 329 Index 343 Contributors Pierre Andreoletti • Laboratoire ‘Biochimie du peroxysome, inflammation et métabolisme lipidique’, EA7270/INSERM, Faculté des Sciences Gabriel, Université de Bourgogne Franche Comté, Dijon, France Jorge E. Azevedo • Instituto de Investigação e Inovação em Saúde, Universidade Porto, Porto, Portugal; Organelle Biogenesis and Function Group, Instituto de Biologia Molecular e Celular (IBMC), Universidade Porto, Porto, Portugal; Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar (ICBAS), Universidade Porto, Porto, Portugal Maryem Bezine • Laboratoire ‘Biochimie du peroxysome, inflammation et métabolisme lipidique’, EA7270/INSERM, Faculté des Sciences Gabriel, Université de Bourgogne Franche Comté, Dijon, France; Laboratoire de Venins et Biomolécules Thérapeutiques (LVMT), Université de Tunis El Manar-Institut Pasteur, Tunis, Tunisia Chantal Brees • Laboratory of Lipid Biochemistry and Protein Interactions, Department of Cellular and Molecular Medicine, KU Leuven – University of Leuven, Leuven, Belgium Judith Buentzel • Department of Pediatrics and Adolescent Health, University Medical Center, University of Göttingen, Göttingen, Germany Anna Chan • Abteilung für Systembiochemie, Institut für Biochemie und Pathobiochemie, Medizinische Fakultät der Ruhr-Universität Bochum, Bochum, Germany Lennart Charton • Institute for Plant Biochemistry and Cluster of Excellence on Plant Sciences (CEPLAS), Heinrich Heine University, Düsseldorf, Germany Mustapha Cherkaoui-Malki • Laboratoire ‘Biochimie du peroxysome, inflammation et métabolisme lipidique’, EA7270/INSERM, Faculté des Sciences Gabriel, Université de Bourgogne Franche Comté, Dijon, France Noa Dahan • Department of Molecular Genetics, Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel Natasha Danda • Molecular Cell Biology, Groningen Biomolecular Sciences and Biotechnology Institute (GBB), University of Groningen, Groningen, The Netherlands Meryam Debbabi • Laboratoire ‘Biochimie du peroxysome, inflammation et métabolisme lipidique’, EA7270/INSERM, Faculté des Sciences Gabriel, Université de Bourgogne Franche Comté, Dijon, France; Faculté de Médecine, Laboratoire de Nutrition—Aliments Fonctionnels et Santé Vasculaire (LR12ES05), Monastir & Faculté de Médecine, Université de Monastir, Sousse, Tunisia Ana F. Dias • Instituto de Investigação e Inovação em Saúde, Universidade Porto, Porto, Portugal; Organelle Biogenesis and Function Group, Instituto de Biologia Molecular e Celular (IBMC), Universidade Porto, Porto, Portugal; Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar (ICBAS), Universidade Porto, Porto, Portugal xiii Clinical and Laboratory Diagnosis of Peroxisomal Disorders 333 can vary from severe retardation to virtually intact mental development Craniofacial dysmorphic features may be absent to very subtle Adrenal insufficiency is common although asymptomatic in more than 50% of the patients [see ref [10] for review] 2 D-Bifunctional Protein Deficiency and Acyl-CoA Oxidase Deficiency Through the years it has become clear that the same set of signs and symptoms as described for ZSD patients are also observed in patients with a defect in the peroxisomal beta-oxidation system although this is only true for D-bifunctional protein (DBP) deficiency [11] and acyl-CoA oxidase (ACOX1) deficiency [12] Indeed, the first case of DBP deficiency was originally described as pseudo-Zellweger syndrome [13] Both for DBP deficiency and ACOX deficiency milder variants have been described in literature For instance, two adult siblings with ACOX1 deficiency have been reported with neurological symptoms but only mild cognitive impairment [14] Furthermore, Pierce and coworkers [15] described DBP deficiency in two sisters with ovarian dysgenesis, hearing loss, and ataxia resembling Perrault syndrome More recently, MacMillen et al [16] described two brothers aged 16.5 and 14 with DBP deficiency, characterized by normal early childhood development, followed by sensory neural hearing loss, progressive cerebellar and sensory ataxia, and subclinical retinitis pigmentosa In literature additional mild cases of DBP deficiency have been described [17, 18] 3 Laboratory Diagnosis of ZSDs, DBP Deficiency and ACOX1 Deficiency If a patient is suspected to suffer from a ZSD or DBP or ACOX1 deficiency based on clinical signs, VLCFA analysis in plasma remains the analysis of choice to ascertain whether or not there is a peroxisomal abnormality Since pristanic and phytanic acid are usually analyzed in the same laboratory assay, the combined analysis of all three metabolites already gives a good initial hint in favor of a peroxisomal defect or not Preferably, erythrocyte plasmalogen levels should be measured in the same blood sample as well, although plasmalogens are only deficient in severely affected ZSD patients but normal in patients affected by a milder defect in peroxisome biogenesis Furthermore, plasmalogens are also normal in patients affected by DBP- or ACOX1 deficiency If an abnormality is encountered in any of the parameters mentioned above, a peroxisomal disorder should be investigated further, notably in fibroblasts in which basically all peroxisomal pathways including fatty acid alpha and beta oxidation and etherphospholipid synthesis can be studied followed by enzymatic analysis of the individual 334 Ronald J.A. Wanders et al peroxisomal enzymes involved [19] Furthermore, microscopical analysis of peroxisomes using catalase immunofluorescence can be done which has turned out to be an extremely important and sensitive test to resolve whether there is a peroxisomal defect or not For example, in the reported Heimler syndrome patients due to mutations in PEX1 or PEX6, catalase immunofluorescence microscopy revealed abnormal peroxisomal staining confirming the peroxisome biogenesis defect in these patients, but all other peroxisomal parameters studied in fibroblasts were normal In some cases, the findings in blood are immediately indicative of a certain type of PD. Indeed, the combination of elevated plasma VLCFA levels and deficient plasmalogens in erythrocytes immediately points to a true peroxisome biogenesis defect Until now, the next step would be a full analysis in fibroblasts including enzyme assays, flux analysis of metabolic pathways in peroxisomes, as well as immunoblot and immunofluorescence microscopy analysis followed by complementation analysis to identify the defective PEX gene Subsequent Sanger sequencing needs to be performed to pinpoint the true molecular defect This procedure is laborious and is gradually being replaced by direct sequencing of all known peroxisomal genes involved in peroxisome biogenesis and peroxisomal function using either a panel or alternatively whole exome/genome sequencing It is very important to perform metabolite and/or fibroblast studies in any patient with clinical signs and symptoms indicative of a PD but in whom no mutations have been identified or only a single heterozygous mutation [see ref [19]] 4 Rhizomelic Chondrodysplasia Punctata (RCDP) Rhizomelic chondrodysplasia punctata (RCDP) is a peroxisomal disorder, clinically characterized by skeletal abnormalities, congenital cataracts, severe growth abnormalities, developmental impairments, and immobility of joints At the severe end of the spectrum RCDP is characterized by a typical facial appearance including a prominent forehead, hypoplasia of the mid-face, anteverted nares, and a long philtrum, congenital cataracts, rhizomelia, growth retardation, and neurological impairments including spastic tetraplegia, epilepsy, and profound mental deficiency Radiologic skeletal abnormalities include rhizomelia, metaphyseal cupping, punctate calcifications, and malformation of the vertebral bodies with characteristic coronal clefts At the mild end of the spectrum patients lack the characteristic rhizomelia with only limited skeletal aberrations including bone dysplasia, and limited movement of various joints These milder affected patients show congenital cataracts and developmental delay MRI studies of the brain and cervical spinal cord in 11 RCDP patients by Bams-Mengerink et al [20] revealed no abnormalities Clinical and Laboratory Diagnosis of Peroxisomal Disorders 335 on MRI in three patients with a mild phenotype, whereas delayed myelination, ventricular enlargement and increased subarachnoidal spaces, supratentorial myelin abnormalities and progressive cerebellar atrophy were observed in patients with a severe form of RCDP. The severity of the MRI abnormalities and the clinical phenotype correlated with the extent of the plasmalogen deficiency, which led the authors to conclude that plasmalogens play a dominant role in the pathophysiology of the CNS abnormalities in RCDP with little, if any, pathophysiological role for phytanic acid The neurology of RCDP has been studied in the same cohort of patients, again by Bams-Mengerink et al [21] RCDP is genetically heterogeneous with most patients carrying mutations in the PEX7 gene, which codes for the cytosolic receptor required for the correct targeting of a subgroup of peroxisomal proteins containing a so-called PTS2 signal to peroxisomes In addition to RCDP type as caused by mutations in PEX7 there are four additional forms of RCDP due to deficiencies of dihydroxyacetone phosphate acyltransferase (DHAPAT) (RCDP type 2), alkyl-glycerone phosphate synthase (AGPS) (RCDP type 3), and fatty acyl-CoA reductase (FAR1) (RCDP type 4) of which RCDP type was described only recently [2] Despite the different molecular defects in the different types of RCDP, RCDP type 1, 2, and cannot be distinguished clinically Interestingly, although the three described patients with RCDP type demonstrated profound growth retardation, developmental delay, pyramidal track dysfunction and seizures as in RCDP types 1–3, other clinical features differed from the other RCDP types Indeed, the three type patients lacked the characteristic rhizomelic shortening of the long bones despite the markedly reduced plasmalogen levels in erythrocytes and displayed symptoms of neurological regression and neonatal hypotonia, which are not generally observed in classical RCDP patients The 5th form of RCDP is caused by mutations in the PEX5 gene which only affects the synthesis of the long form of the PEX5 protein (PEX5L) involved in the uptake of PTS2 proteins while leaving the formation of the short form of PEX5 intact which explains that the uptake of all PTS1 proteins proceeds normally in RCDP type [3] 4.1 Laboratory Diagnosis of RCDP Laboratory detection of the different forms of RCDP is straightforward in the classical cases of RCDP since erythrocyte plasmalogen levels in these patients are generally extremely low However, in the milder affected patients, including for instance the patient described by Smeitink et al [22], plasmalogens may only be partially deficient or even completely normal In the absence of any other biomarker indicative for a defect in etherphospholipid synthesis, fibroblast studies should be done in milder affected patients with normal erythrocyte plasmalogen levels which includes enzyme and immunoblot analysis and plasmalogen measurement 336 Ronald J.A. Wanders et al in fibroblasts followed by sequencing of the five genes now known to be involved with RCDP if doubt remains Also for the diagnosis of RCDP direct sequencing of all genes involved either with a gene panel or next generation sequencing techniques is increasingly used, but also in these cases it should be kept in mind that mutations can be missed and in case of a clinical suspicion but negative molecular results, metabolite or fibroblasts studies should be performed 5 X-Linked Adrenoleukodystrophy (XALD) The most frequent disorder of peroxisomal beta-oxidation is X-linked adrenoleukodystrophy (X-ALD) The phenotype of X-ALD varies wildly with at least six phenotypic variants described The classification of X-ALD is somewhat arbitrary and based on the age of onset and the organs principally involved The two most frequent phenotypes are childhood cerebral ALD (CCALD) and adrenomyeloneuropathy (AMN) Onset of CCALD is usually between and 10 years of age with progressive behavioral, cognitive and neurological deterioration often leading to total disability within 3 years The cerebral phenotype is not only observed in childhood but may also present later in life in adolescence (adolescence-cerebral ALD; ACALD) or adulthood (adult-cerebral ALD) There is a marked difference between the cerebral phenotypes on the one hand and AMN on the other hand since the cerebral phenotype shows an inflammatory reaction in the cerebral white matter which resembles, but can be distinguished from, what is observed in multiple sclerosis In contrast to CCALD, the inflammatory response is absent or mild in AMN which has a much later age of onset (28 ± 9 years), and a much lower rate of progression Finally, it is important to mention that a high percentage of women heterozygous for X-ALD, develop AMN-like symptoms in middle age or later [23] However, cerebral involvement and adrenocortical insufficiency are rare For more detailed information the reader is referred to several review papers on the topic [23, 24] XALD is caused by mutations in the ABCD1 gene, which codes for a peroxisomal half-ABC transporter named adrenoleukodystrophy protein (ALDP) The general notion is that ALDP forms a homodimer in the peroxisomal membrane and transports VLCFAs in their coenzyme A-esterified form across the peroxisomal membrane [25, 26] Biochemically, X-ALD is characterized by the accumulation of VLCFAs notably C24:0 and C26:0 due to the inability to transport VLCFAs into peroxisomes, where they normally are oxidized Clinical and Laboratory Diagnosis of Peroxisomal Disorders 5.1 Laboratory Diagnosis of XALD 337 In males clinically suspected of XALD, plasma VLCFA analysis is the preferred first line test with very few if any false negatives False-positive results, however, have been reported in literature in hemolytic plasma samples and in patients on a ketogenic diet [27] Furthermore, VLCFA levels may be erroneously high in patients, who consume high amounts of peanuts either as such or in butter form [28] Elevated plasma VLCFA levels should be followed up by detailed studies in fibroblasts (C26:0 beta-oxidation measurements, ALDP immunofluorescence microscopy analysis) and/or direct gene sequencing of ABCD1 Importantly, a robust method involving the analysis of C26:0- lysophosphatidylcholine in dried blood spots has been set up, which allows newborn screening for XALD [29] In the state of New York screening has been initiated in the meantime and in the Netherlands newborn screening for XALD has just been approved and will be implemented in the near future 6 Alpha-Methylacyl-CoA Racemase (AMACR) Deficiency Different phenotypic variants of AMACR deficiency have been described in literature The first one involves a relatively mild form of the disease mimicking Refsum disease whereas the other is dominated by early-onset severe liver abnormalities In recent years yet other variants have been described, including tremor and deep white matter changes [30], relapsing encephalopathy [31], relapsing rhabdomyolysis [32], and two patients with an adult-onset phenotype with peripheral neuropathy, epilepsy and relapsing encephalopathy, bilateral thalamic lesions, cataract, pigmentary retinopathy, and tremor [33] 6.1 Laboratory Diagnosis of AMACR Deficiency Correct diagnosis of AMACR deficiency requires analysis of the bile acid intermediates di- and trihydroxycholestanoic acid since plasma VLCFAs are not increased and pristanic acid levels may be deceptively normal in view of its dietary origin Although the enzyme activity of AMACR can be determined in cultured skin fibroblasts, the assay itself is very cumbersome and requires a specifically synthesized substrate which explains why molecular analysis is the preferred choice for diagnosis 7 SCPx Deficiency and PMP70 Deficiency SCPx deficiency [34, 35] and PMP70 deficiency [1] have been described in a few patients only and are not discussed in any detail here 338 Ronald J.A. Wanders et al 8 Refsum Disease (Phytanoyl-CoA 2-Hydroxylase Deficiency) Refsum disease is the only disorder known to be caused by a deficiency of fatty acid alpha-oxidation The disease is caused by a defect in phytanoyl-CoA 2-hydroxylase [36] Clinical features of Refsum disease include retinitis pigmentosa as most frequent abnormality, which usually culminates into blindness, followed by anosmia, cerebellar ataxia, peripheral neuropathy, plus a number of other abnormalities which are less frequent [37, 38] 8.1 Laboratory Diagnosis of Refsum Disease In all patients with bona fide Refsum disease due to phytanoyl-CoA 2-hydroxylase deficiency, plasma phytanic acid levels are always abnormal although the levels may vary considerably among patients [39] If phytanic acid is the only abnormality, Refsum disease due to mutations in the phytanoyl-CoA 2-hydroxylase gene is a likely possibility, which should be followed up by detailed studies in fibroblasts (phytanic acid alpha-oxidation and phytanoyl-CoA 2-hydroxylase activity measurements) and/or molecular analysis In rare cases the genetic cause is due to mutations in the PEX7 gene [40] 9 Primary Hyperoxaluria Type Primary hyperoxaluria type (PH-1) belongs to the primary hyperoxalurias, which is a collective term encompassing an indeterminate number of genetically inherited conditions of which only PH-1, PH-2 and PH-3 have been characterized PH-1 is clinically variable both in terms of symptoms, age of onset and mode of progression Approximately one-fourth of patients have an infantile form with early nephrocalcinosis and 50% of them develop renal failure by 3 years of age; 30% of patients have recurrent urolithiasis and renal failure in adolescence or early adulthood and 21% have late onset urolithiasis diagnosed in adulthood [41] It is not unusual for the disease to go unrecognized and be first diagnosed after kidney transplantation PH-1 is due to a deficiency of the peroxisomal enzyme alanine glyoxylate aminotransferase (AGT) whereas PH-2 and PH-3 are non-peroxisomal disorders caused by a deficiency of the cytosolic enzyme glyoxylate reductase and the mitochondrial enzyme 4-hydroxy-2-oxoglutarate aldolase 1, respectively 9.1 Laboratory Diagnosis of PH-1 The most common method of investigating PH-1 is by measuring urinary oxalate excretion Markedly elevate urinary oxalate levels usually are indicative for either PH-1 or PH-2 or PH-3 For differential diagnosis urinary glycolate and L-glycerate must be measured It should be noted, however, that a significant number of Clinical and Laboratory Diagnosis of Peroxisomal Disorders 339 PH-1 patients with proven AGT deficiency have hyperoxaluria but no hyperglycolic aciduria PH-1 is caused by mutations in the AGXT gene coding for AGT rendering alanine glyoxylate aminotransferase inactive However, in a substantial number of patients the enzyme AGT is enzymatically active, at least in homogenates, but physiologically inactive due to a peculiar peroxisome–to–mitochondria mistargeting phenotype (see ref (41) for review) 10 Glycolate Oxidase Deficiency Glycolate oxidase is the main enzyme producing glyoxylate from glycolate Interestingly, the first case of glycolate oxidase deficiency was recently identified in an 8-years-old child with extremely high urinary glycolate levels since infancy without hyperoxaluria or kidney stone disease due to homozygous loss-of-function mutation in HAO1, which encodes the peroxisomal enzyme glycolate oxidase The patient was evaluated for psychomotor retardation associated with triple-A-like syndrome (anisocoria, alacrima, and achalasia) Interestingly, his brother had similar clinical features and both patients turned out to have a homozygous mutation in the GMPPA gene encoding guanosine diphosphate (GDP)-mannose pyrophosphorylase A which is now known to cause triple-A-like syndrome [42] The fact that the index patient and his brother had similar clinical signs and symptoms whereas the patient’s brother did not display glycolic aciduria led the authors to suggest that glycolate oxidase deficiency may well have no clinical consequences This would be in line with the notion that mice with glycolate oxidase deficiency also have no symptoms 11 Bile Acid Coenzyme A: Amino Acid N-Acyltransferease (BAAT) Deficiency Setchell and coworkers [43] were the first to identify defective bile acid conjugation in humans Subsequently, Carlton and coworkers [44] described a series of patients from the Amish community with bona fide mutations in the BAAT gene Patients were homozygous for a C.226A>G mutation (M76V) and showed increased bile acids which were virtually fully unconjugated Clinical features of these patients include fat malabsorption, failure to thrive, coagulopathy, pleuritis, and chronic upper respiratory infections They did not have jaundice and had normal serum gamma GT levels In 2007, Heubi et al [45] reported six additional patients with mutations in the BAAT gene The clinical phenotype included: growth delay (3/6), neonatal cholestasis (3/6) including one with fulminant liver failure, and 5/6 with fat soluble vitamin deficiency, i.e., vitamin A, E, and/or D. At diagnosis (5 months–19 years) all but one had normal bilirubin and normal or minimally elevated transaminases 340 Ronald J.A. Wanders et al 11.1 Laboratory Diagnosis of BAAT Deficiency Laboratory diagnosis of BAAT deficiency requires bile acid analysis, which can best be performed by means of tandem mass spectrometry In BAAT-deficient patients the glycine and taurine bile acid conjugates are virtually completely deficient in all body fluids with the unconjugated form of cholic acid predominating 12 Conclusions The field of peroxisomal disorders has changed considerably in the last few years both with respect to the clinical as well as laboratory diagnosis Indeed, thanks to the revolutionary developments in gene sequencing technologies new phenotypes have been discovered which would have remained undetected if the classical phenotypic description of the disorders would have been followed In addition, we have learned that the classical methods to identify candidate patients which would start with metabolite analysis in blood (plasma and erythrocytes) may fail because no abnormalities are apparent in blood in a substantial number of patients In these patients, exome and/or whole genome sequencing is of utmost importance, together with detailed studies in cultured skin fibroblasts in which peroxisomal abnormalities are much more apparent than in plasma Acknowledgments H. Waterham acknowledges support from the Marie Curie Initial Training Network (ITN) action (FP7-2012-PERFUME-316723) References Ferdinandusse S, Jimenez-Sanchez G, Koster J, Denis S, Van Roermund CW, Silva-Zolezzi I, Moser AB, Visser WF, Gulluoglu M, Durmaz O, Demirkol M, Waterham HR, Gokcay G, Wanders RJ, Valle D (2015) A novel bile acid biosynthesis defect due to a deficiency of peroxisomal ABCD3 Hum Mol Genet 24: 361–370 Buchert R, Tawamie H, Smith C, Uebe S, Innes AM, Al Hallak B, Ekici AB, Sticht H, Schwarze B, Lamont RE, Parboosingh JS, Bernier FP, Abou Jamra R (2014) A peroxisomal disorder of severe intellectual disability, epilepsy, and cataracts due to fatty acyl-CoA reductase deficiency Am J Hum Genet 95:602–610 Baroy T, Koster J, Stromme P, Ebberink MS, Misceo D, Ferdinandusse S, Holmgren A, Hughes T, Merckoll E, Westvik J, Woldseth B, Walter J, Wood N, Tvedt B, Stadskleiv K, Wanders RJ, Waterham HR, Frengen E (2015) A novel type of rhizomelic chondrodysplasia punctata, RCDP5, is caused by loss of the PEX5 long isoform Hum Mol Genet 24: 5845–5854 Sevin C, Ferdinandusse S, Waterham HR, Wanders RJA, Aubourg P (2011) Autosomal recessive cerebellar ataxia caused by mutations in the PEX2 gene Orphanet J Rare Dis 6:8 Regal L, Ebberink MS, Goemans N, Wanders RJA, De ML, Jaeken J, Schrooten M, Van CR, Waterham HR (2010) Mutations in PEX10 are a cause of autosomal recessive ataxia Ann Neurol 68:259–263 Ratbi I, Falkenberg KD, Sommen M, Al-Sheqaih N, Guaoua S, Vandeweyer G, Urquhart JE, Chandler KE, Williams SG, Roberts NA, El Alloussi M, Black GC, Clinical and Laboratory Diagnosis of Peroxisomal Disorders Ferdinandusse S, Ramdi H, Heimler A, Fryer A, Lynch SA, Cooper N, Ong KR, Smith CE, Inglehearn CF, Mighell AJ, Elcock C, Poulter JA, Tischkowitz M, Davies SJ, Sefiani A, Mironov AA, Newman WG, Waterham HR, Van Camp G (2015) Heimler syndrome is caused by hypomorphic mutations in the peroxisome-biogenesis genes PEX1 and PEX6 Am J Hum Genet 97:535–545 Bowen P, Lee CSM, Zellweger H, Lindenberg R (1964) A familial syndrome of multiple congenital defects Bull Johns Hopkins Hosp 114:402–414 Brown FR, McAdams AJ, Cummins JW, Konkol R, Singh I, Moser AB, Moser HW (1982) Cerebro-hepato-renal (Zellweger) syndrome and neonatal adrenoleukodystrophy: similarities in phenotype and accumulation of very long chain fatty acids Johns Hopkins Med J 151:344–351 Heymans HSA, Schutgens RBH, Tan R, van den Bosch H, Borst P (1983) Severe plasmalogen deficiency in tissues of infants without peroxisomes (Zellweger syndrome) Nature 306:69–70 10 Klouwer FC, Huffnagel IC, Ferdinandusse S, Waterham HR, Wanders RJ, Engelen M, Poll- The BT (2016) Clinical and biochemical pitfalls in the diagnosis of peroxisomal disorders Neuropediatrics 47(4):205–220 11 Ferdinandusse S, Denis S, Mooyer PA, Dekker C, Duran M, Soorani-Lunsing RJ, Boltshauser E, Macaya A, Gartner J, Majoie CB, Barth PG, Wanders RJA, Poll-The BT (2006) Clinical and biochemical spectrum of D-bifunctional protein deficiency Ann Neurol 59:92–104 12 Ferdinandusse S, Denis S, Hogenhout EM, Koster J, van Roermund CWT, IJlst L, Moser AB, Wanders RJA, Waterham HR (2007) Clinical, biochemical, and mutational spectrum of peroxisomal acyl-coenzyme A oxidase deficiency Hum Mutat 28:904–912 13 Goldfischer S, Collins J, Rapin I, Neumann P, Neglia W, Spiro AJ, Ishii T, Roels F, Vamecq J, Van Hoof F (1986) Pseudo-Zellweger syndrome: deficiencies in several peroxisomal oxidative activities J Pediatr 108:25–32 14 Ferdinandusse S, Barker S, Lachlan K, Duran M, Waterham HR, Wanders RJA, Hammans S (2010) Adult peroxisomal acyl-coenzyme A oxidase deficiency with cerebellar and brainstem atrophy J Neurol Neurosurg Psychiatry 81:310–312 15 Pierce SB, Walsh T, Chisholm KM, Lee MK, Thornton AM, Fiumara A, Opitz JM, Levy- Lahad E, Klevit RE, King MC (2010) Mutations in the DBP-deficiency protein HSD17B4 cause ovarian dysgenesis, hearing loss, and ataxia of Perrault Syndrome Am J Hum Genet 87:282–288 341 16 McMillan HJ, Worthylake T, Schwartzentruber J, Gottlieb CC, Lawrence SE, Mackenzie A, Beaulieu CL, Mooyer PA, Wanders RJA, Majewski J, Bulman DE, Geraghty MT, Ferdinandusse S, Boycott KM (2012) Specific combination of compound heterozygous mutations in 17beta-hydroxysteroid dehydrogenase type (HSD17B4) defines a new subtype of D-bifunctional protein deficiency Orphanet J Rare Dis 7:1–9 17 Mizumoto H, Akashi R, Hikita N, Kumakura A, Yoshida Y, Honda A, Shimozawa N, Hata D (2012) Mild case of D-bifunctional protein deficiency associated with novel gene mutations Pediatr Int 54:303–304 18 Lines MA, Jobling R, Brady L, Marshall CR, Scherer SW, Rodriguez AR, Lee L, Lang AE, Mestre TA, Wanders RJ, Ferdinandusse S, Tarnopolsky MA, Canadian Pediatric Genetic Disorders Sequencing Consortium (2014) Peroxisomal D-bifunctional protein deficiency: three adults diagnosed by whole-exome sequencing Neurology 82:963–968 19 Ferdinandusse S, Ebberink MS, Vaz FM, Waterham HR, Wanders RJ (2016) The important role of biochemical and functional studies in the diagnostics of peroxisomal disorders J Inherit Metab Dis 39:531–543 20 Bams-Mengerink AM, Majoie CB, Duran M, Wanders RJA, Van HJ, Scheurer CD, Barth PG, Poll-The BT (2006) MRI of the brain and cervical spinal cord in rhizomelic chondrodysplasia punctata Neurology 66:798–803 21 Bams-Mengerink AM, Koelman JH, Waterham H, Barth PG, Poll-The BT (2013) The neurology of rhizomelic chondrodysplasia punctata Orphanet J Rare Dis 8:174 22 Smeitink JA, Beemer FA, Espeel M, Donckerwolcke RA, Jakobs C, Wanders RJA, Schutgens RBH, Roels F, Duran M, Dorland L et al (1992) Bone dysplasia associated with phytanic acid accumulation and deficient plasmalogen synthesis: a peroxisomal entity amenable to plasmapheresis J Inherit Metab Dis 15:377–380 23 Engelen M, Kemp S, de Visser M, van Geel BM, Wanders RJA, Aubourg PA, Poll-The BT (2012) X-linked adrenoleukodystrophy (X-ALD): clinical presentation and guidelines for diagnosis, follow-up and management Orphanet J Rare Dis 7:51 24 Kemp S, Huffnagel IC, Linthorst GE, Wanders RJ, Engelen M (2016) Adrenoleukodystrophy— neuroendocrine pathogenesis and redefinition of natural history Nat Rev Endocrinol 12(10):606–615 25 Guimaraes CP, Domingues P, Aubourg P, Fouquet F, Pujol A, Jimenez-Sanchez G, Sa-Miranda C, Azevedo JE (2004) Mouse liver PMP70 and ALDP: homomeric interactions 342 Ronald J.A. Wanders et al prevail in vivo Biochim Biophys Acta 1689: 235–243 26 Wiesinger C, Kunze M, Regelsberger G, Forss- Petter S, Berger J (2013) Impaired very long- chain acyl-CoA beta-oxidation in human X-ALD fibroblasts is a direct consequence of ABCD1 transporter dysfunction J Biol Chem 288:19269–19279 27 Theda C, Woody RC, Naidu S, Moser AB, Moser HW (1993) Increased very long chain fatty acids in patients on a ketogenic diet: a cause of diagnostic confusion J Pediatr 122: 724–726 28 Lam C, Wong D, Cederbaum S, Lim B, Qu Y (2012) Peanut consumption increases levels of plasma very long chain fatty acids in humans Mol Genet Metab 107:620–622 29 Theda C, Gibbons K, Defor TE, Donohue PK, Golden WC, Kline AD, Gulamali-Majid F, Panny SR, Hubbard WC, Jones RO, Liu AK, Moser AB, Raymond GV (2014) Newborn screening for X-linked adrenoleukodystrophy: further evidence high throughput screening is feasible Mol Genet Metab 111:55–57 30 Clarke CE, Alger S, Preece MA, Burdon MA, Chavda S, Denis S, Ferdinandusse S, Wanders RJA (2004) Tremor and deep white matter changes in alpha-methylacyl-CoA racemase deficiency Neurology 63:188–189 31 Thompson SA, Calvin J, Hogg S, Ferdinandusse S, Wanders RJA, Barker RA (2008) Relapsing encephalopathy in a patient with alpha- methylacyl-CoA racemase deficiency J Neurol Neurosurg Psychiatry 79:448–450 32 Kapina V, Sedel F, Truffert A, Horvath J, Wanders RJA, Waterham HR, Picard F (2010) Relapsing rhabdomyolysis due to peroxisomal alpha-methylacyl-CoA racemase deficiency Neurology 75:1300–1302 33 Haugarvoll K, Johansson S, Tzoulis C, Haukanes BI, Bredrup C, Neckelmann G, Boman H, Knappskog PM, Bindoff LA (2013) MRI characterisation of adult onset alpha- methylacyl-coA racemase deficiency diagnosed by exome sequencing Orphanet J Rare Dis 8:1–10 34 Ferdinandusse S, Kostopoulos P, Denis S, Rusch H, Overmars H, Dillmann U, Reith W, Haas D, Wanders RJA, Duran M, Marziniak M (2006) Mutations in the gene encoding peroxisomal sterol carrier protein X (SCPx) cause leukencephalopathy with dystonia and motor neuropathy Am J Hum Genet 78:1046–1052 35 Horvath R, Lewis-Smith D, Douroudis K, Duff J, Keogh M, Pyle A, Fletcher N, Chinnery PF (2015) SCP2 mutations and neurodegen- eration with brain iron accumulation Neurology 85:1909–1911 36 Jansen GA, Wanders RJA, Watkins PA, Mihalik SJ (1997) Phytanoyl-coenzyme A hydroxylase deficiency—the enzyme defect in Refsum's disease N Engl J Med 337:133–134 37 Wierzbicki AS, Lloyd MD, Schofield CJ, Feher MD, Gibberd FB (2002) Refsum’s disease: a peroxisomal disorder affecting phytanic acid alpha-oxidation J Neurochem 80:727–735 38 Wanders RJA, Jakobs C, Skjeldal OH (2001) Refsum disease In: Scriver CR, Beaudet AL, Sly WS, Valle D (eds) The metabolic & molecular bases of inherited disease, 8th edn Mc Graw-Hill, New York, pp 3303–3321 39 Wanders RJA, Waterham HR, Leroy B (2006) Refsum disease Gene Rev (www.genetests org) 40 van den Brink DM, Brites P, Haasjes J, Wierzbicki AS, Mitchell J, Lambert-Hamill M, de Belleroche J, Jansen GA, Waterham HR, Wanders RJA (2003) Identification of PEX7 as the second gene involved in refsum disease Am J Hum Genet 72:471–477 41 Salido E, Pey AL, Rodriguez R, Lorenzo V (2012) Primary hyperoxalurias: disorders of glyoxylate detoxification Biochim Biophys Acta 1822:1453–1464 42 Koehler K, Malik M, Mahmood S, Giesselmann S, Beetz C, Hennings JC, Huebner AK, Grahn A, Reunert J, Nurnberg G, Thiele H, Altmuller J, Nurnberg P, Mumtaz R, BabovicVuksanovic D, Basel-Vanagaite L, Borck G, Bramswig J, Muhlenberg R, Sarda P, Sikiric A, Anyane- Yeboa K, Zeharia A, Ahmad A, Coubes C, Wada Y, Marquardt T, Vanderschaeghe D, Van Schaftingen E, Kurth I, Huebner A, Hubner CA (2013) Mutations in GMPPA cause a glycosylation disorder characterized by intellectual disability and autonomic dysfunction Am J Hum Genet 93:727–734 43 Bove KE, Daugherty CC, Tyson W, Mierau G, Heubi JE, Balistreri WF, Setchell KD (2000) Bile acid synthetic defects and liver disease Pediatr Dev Pathol 3:1–16 44 Carlton VE, Harris BZ, Puffenberger EG, Batta AK, Knisely AS, Robinson DL, Strauss KA, Shneider BL, Lim WA, Salen G, Morton DH, Bull LN (2003) Complex inheritance of familial hypercholanemia with associated mutations in TJP2 and BAAT. Nat Genet 34: 91–96 45 Heubi JE, Setchell KD, Bove KE (2007) Inborn errors of bile acid metabolism Semin Liver Dis 27:282–294 Index A ABCD3�����������������������������������������7, 9, 29, 32, 257–264, 331 ABC transporters (Abcd)������������������������� 257, 259, 261, 263 ACAD11������������������������������������������� 1, 3, 7, 9, 117, 121, 123 ACBD5�������������������������������������������������������� 71, 75, 117, 121 ACOX1���������������������������������������������������7, 9, 45, 46, 53, 335 Adaptor protein�������������������������������������������������������� 243, 244 Adrenoleukodystrophy (ALD)����������������������� 45, 51–54, 331 Adrenoleukodystrophy protein (ALDP)������������������ 338, 339 Affinity purification��������� 2, 37, 267, 270, 272, 276, 282, 314 Agarose cushion����������������������������������������������� 143, 144, 148 ALD See Adrenoleukodystrophy (ALD) Aldehyde fixation���������������������������������������������������������93, 95 ALDP See Adrenoleukodystrophy protein (ALDP) Alkaline methanolysis�������������������������������������������� 56, 59, 60 Anesthesia����������������������������������������������������������������������5, 96 Antibody detection�����������������������������������������������������������129 Antibody-gold-conjugate�������������������������������������������������101 Antibody incubation���������������������������������������������������������128 Anti-fading reagent�������������������������������������������������� 116, 128 Arabidopsis thaliana������������������������������������������� 291–303, 320 Atg8����������������������������������������������������������������� 250, 251, 254 Autophagy�����������������������������������������165, 243, 244, 247, 249 Autoradiography����58, 60, 202, 223–225, 228–229, 231, 270, 287 B BAAT��������������������������������������������������������������� 332, 341, 342 Beta-oxidation����������������������� 45–54, 131, 332, 335, 338, 339 Bile acid���������������������������������������������243, 332, 339, 341, 342 Biological Safety����������������������������� 71, 73, 74, 114, 118, 154, 156, 166, 169, 183–185 Blocking�������������������������������������� 24, 116, 128, 195, 251, 253 Blue Native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE)�������������������������������������������197–204 BV-2 microglial cells��������������������������������������������������������257 C Calibration����������������������������48–52, 182, 184–189, 298, 299 Catalase���������������������7, 14, 16, 21, 25, 28, 30, 34, 75, 93–95, 97–99, 117, 121, 123, 129, 247, 325, 332, 336 Cell culture������������������������3, 6, 46, 49, 56, 64, 71, 73, 81, 82, 84, 102, 103, 106, 113–115, 118, 119, 126, 142, 143, 154, 155, 160, 161, 166–169, 172, 173, 176, 177, 183, 186, 229, 244, 308, 320 Cell death���������������������������������� 165, 166, 170, 171, 176, 188 Cell disruption��������������������������������������������������������������40, 41 Cell-free synthesis������������������������������������������������������������207 Central nervous system (CNS)����������������� 14, 15, 17–19, 337 Chinese hamster ovary (CHO) cells�������������������������� 60, 202, 214–217, 246, 320–324 Chloroquine��������������������������������������������� 115, 119, 127, 247 CHO-K1 cells���������������������������������57, 58, 60, 215, 217, 321 Clinical������������������������������������������������������� 95, 264, 331–342 CNS See Central nervous system (CNS) Colocalization�������������������������������������������������� 117, 145, 217 Colony PCR�������������������������������������������������������������139–140 Competent cells�������������������������������������������� 83, 89, 136–140 Confocal microscopy������������������������������������������������ 182, 183 Coomassie Blue�������������������������������������������������������� 274, 279 COS-7 cells���������������������� 70, 71, 73, 75, 102, 114, 118–123, 126, 183–186, 188, 225 Counting����������������������� 73, 77, 118, 156, 160, 168, 174, 246 Crossing��������������������������������������������������� 308, 310, 311, 313 Cryo-immuno electron microscopy��������������������������101–111 Cryo-protection������������������������������������������������ 102, 104–107 Cryosection���������������������������������������������� 102–105, 107–110 Cultivation mammalian cells������������������������������������������������� 244, 320 yeast cells������������������������������������������������������ 40, 131, 193 Cytochemistry��������������������������������������������������������������94, 96 Cytosol�������������� 4, 7, 9, 22–24, 123, 129, 153, 154, 162, 186, 197, 198, 201–202, 207, 208, 214, 217, 218, 222 D Data analysis���������������� 84, 269, 271, 275, 281, 282, 299–301 Deficiency(ies)���������������������������� 13, 45, 46, 52, 71, 258, 293, 320–322, 325, 331, 332, 335–337, 339–342 Deficiency and bifunctional protein (DBP)����������� 45, 46, 53, 335–336 Density gradient centrifugation Nycodenz��������������������������������������������������������������������2, Optiprep�����������������������������������������������������������������2, 4–6 Michael Schrader (ed.), Peroxisomes: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, vol 1595, DOI 10.1007/978-1-4939-6937-1, © Springer Science+Business Media LLC 2017 343 Peroxisomes: Methods and Protocols 344 Index Diagnosis������������������������������������������������������������ 63, 331–342 Diamidino-2-phenylindole (DAPI)��115, 119, 120, 126–128 Diaminobenzidine (DAB)��������������������������������������������93–99 Differential permeabilization���������������������������� 122–123, 128 Digitonin������������������������������ 39, 42, 116, 123, 128, 129, 199, 200, 202, 203, 214, 215 Direct import���������������������������������������������������� 207, 208, 210 Disease(s)����������������������13, 45, 166, 173, 182, 213, 258, 319, 320, 331, 333, 334, 339–341 DNA purification�����������������������������������������������������������������136 staining�����������������������������������������������������������������������126 template�������������������������������������������������������������� 210, 211 Docosanoic acid������������������������������������������������������������45–54 DRP1������������������������������������������������������������� 70, 71, 75, 198 DsRed���������������������������������������������������������������� 78, 117, 191 Dual reporter system����������������������������������������������������81–91 E Electron microscopy������������������������������������� 93–99, 101–111 Electrophoresis����������������������� 24, 83, 90, 198, 200–202, 228, 229, 231, 233, 268, 274, 278, 279 Elongation������������������������������������������������ 46, 52, 70–72, 230 Embedding���������������������� 95, 97, 99, 101, 102, 104, 105, 107 Emission����������������������������� 85, 115, 120, 142, 152, 155, 167, 182, 185, 188 Endogenous protein��������������������������������������������������� 28, 117 EndoH����������������������������������������������223, 225, 228, 229, 231 Endoplasmic reticulum (ER)������������������������3, 9, 22, 93, 110, 152, 165, 207, 221–231 entry��������������������������������������������������� 222–224, 228–230 integration����������������������������������������������������������228–229 Epitope tag������������������������������������������������� 28, 271, 272, 282 Epon����������������������������������������������������������94, 95, 97, 99, 110 ER See Endoplasmic reticulum (ER) Escherichia coli (E coli)����������������������133, 140–141, 201, 224, 226–228, 281, 284, 285 Etherphospholipids�������������������������������������������������� 335, 337 Excitation��������������������������������� 115, 120, 148, 152, 155, 157, 161, 162, 167, 182, 185, 188 Exogenous protein���������������������������������������� 28, 29, 122, 124 F Fatty acid�������������������������� 45–54, 56, 59, 113, 131, 202, 207, 243, 292–294, 296–303, 306, 319, 333, 335, 340 β-oxidation������������������������������45–54, 131, 202, 296, 335 content������������������������������������������������ 293, 298, 300, 303 extraction�������������������������������������294, 297–298, 302, 303 metabolism�����������������������������������������������������������������306 Fatty acid methyl ester (FAMEs)������������� 293, 297–300, 303 Filamentous fungi�������������������������������������������������������������131 Fixation���������������������������� 93–96, 98, 99, 101, 102, 104–106, 108, 110, 120, 127, 274, 279, 325 FLAG������������������������������������������������117, 128, 203, 239, 282 Flow cytometric analysis������������������������������������ 85, 257–264 Flow cytometry�������������������������������������� 82, 84–88, 257–264 Fluorescence microscopy����������������������63, 65, 115–117, 142, 155, 162, 167, 170–172, 175, 176, 250, 253, 259, 261–263, 325 Fluorescent protein��������������������� 66, 125, 132, 135, 152, 182, 183, 250, 305, 321 Fractionation������������������������������� 2, 17, 18, 20, 191, 211, 269 Freeze substitution����������������������������������� 102, 103, 106–107 Freezing��8, 101, 105–107, 109, 110, 282, 284, 307–310, 317 Functional complementation�������������������������������������� 63, 213 Fusion proteins�����������������������������������78, 117, 119–120, 125, 135, 174, 191, 249, 250, 253 G Gas-chromatography��������������������������������������������������������293 Gateway technology������������������������������������������������� 225, 227 GC-MS analysis���������������������������������������������������������������298 Gene silencing��������������������������������������������������������������69, 77 Genetic screen������������������������������������������������������������������308 Germination��������������������������������������������� 293–296, 301–303 GFP See Green fluorescent protein (GFP) GFP-PTS1����������������������������������������������������������� 70, 78, 102 GFP-SKL������������������������������������������������������������ 63, 66, 144 Glutathione����������������������������������������������������������������������152 Glycerophospholipids��������������������������������������� 55, 56, 59, 60 GMO guidelines�������������������������������������������������������� 77, 125 Gradient gels������������������������������������������������������������199–203 Green fluorescent protein (GFP)���������������������70, 82, 86, 91, 101, 102, 104, 105, 107, 108, 110, 124, 128, 135, 142, 145, 148, 170, 191, 217, 249–251, 253, 305–308, 310–316, 318, 321, 324 Green light irradiation������������������������������������������������������167 H Hansenula polymorpha�������������������������������������������������������234 Harvesting�������������������������������� 38, 41, 50, 57, 58, 65, 73–75, 118, 138, 139, 155, 168, 173, 194, 215, 228, 235, 238, 252, 285, 296 HEK293 cells����������������������������������������������������������� 201, 203 High content���������������������������������������������������� 305, 306, 308 High pressure freezing (HPF)�����������101, 103, 105–108, 110 Histochemistry�������������������������������������������������������������95–99 Homogenate������������������������ 5, 17, 20, 33, 38, 41, 42, 50, 341 Human������������������������������� 51–53, 63–66, 70, 71, 73–75, 81, 94, 113, 125, 131, 132, 181, 183, 184, 186, 243, 258, 260, 268, 273, 283, 319–321, 341 Human hepatoblastoma cells (HepG2) hepatoma cells�������������������� 3, 4, 6, 9, 25, 71–73, 75–77, 121 Hydrogen peroxide (H2O2)���������������������������������������� 16, 93, 94, 96, 97, 99, 151, 153, 161, 165, 182, 207, 243, 244, 332 Hyperoxaluria����������������������������������������������������������� 340, 341 Hyphal formation�������������������������������������������������������������143 Peroxisomes: Methods and Protocols 345 Index I Image acquisition����������������������������������������������������� 162, 185 Image collection������������������������������������������������������� 157, 185 Image processing������� 145, 162, 163, 176, 182, 185–187, 303 Immersion fixation�������������������������������������������������������94–96 Immunoblotting�������������� 24, 74, 76, 203, 214, 234, 237–239 Immunofluorescence���������������������� 9, 27, 70, 72, 74–76, 114, 116–118, 121, 127, 191–196, 214, 216, 224, 245–247, 260, 336, 339 Immuno-gold����������������������������������������������������������� 105, 109 Immuno-precipitation�������������������37, 38, 233, 236, 237, 282 Immunostaining������������������������191, 216, 261–263, 324, 325 Import assay��������������������������������������208, 210, 211, 214–217 Import receptor�������������������������������������������������������� 124, 208 In situ calibration������������������������������������������������������ 182, 184 Integral membrane proteins���������������������������������������������222 Intensity profile�������������������������������������������������������� 145, 147 Internal standard������� 47–48, 50, 51, 293, 294, 297–301, 303 In vitro kinase assay��� 270, 271, 274, 279–280, 284, 286, 287 In vitro translation���������������������������������������������������� 209, 210 Isolated peroxisomes������������������������������2, 3, 17, 94, 207–211 K KillerRed������������������������������������������������������������������165–178 Kinase-substrate relationship���������������������������� 270, 279–280 Kinesin����������������������������������������������������� 142, 145, 146, 148 Knockdown������������������������������������������������ 3, 69–71, 77, 247 Kymograph������������������������������������������������������� 144–146, 149 L Labelling��� 56–58, 60, 70, 102, 120, 122, 124, 131–149, 191, 314, 324 LC/MS analysis���������������� 269–272, 275, 279, 281–283, 286 Libraries����������������������������������������������������������� 230, 305–318 Light microscopy������������� 71, 93–99, 114, 154, 166, 172, 262 Live cell imaging������������������������������117, 131–149, 155, 167, 170, 172, 183 Luciferase��������������������������������������������������������������� 82, 84–88 Luminescence��������������������������������������������������������� 84–87, 91 Lysis����������������������������������������82, 84, 85, 272–273, 276–278 Medium�����������������������2, 6, 46–47, 49, 50, 54, 56, 57, 64–66, 71, 73, 74, 76–78, 83, 84, 86, 94–99, 102–104, 106, 115, 116, 118–120, 126–128, 132–134, 136, 139–143, 146–148, 153–157, 159–161, 167–170, 173, 175, 176, 183–185, 193, 215, 235, 245, 249, 251–254, 259, 262, 272, 276, 282, 293–296, 302, 307, 309, 313–317, 322–324 MEFs See Mouse embryonic fibroblasts (MEFs) Membrane protein(s)����������������������������29, 39, 120–123, 191, 198, 200, 203, 207, 209, 213–216, 218, 221, 222, 233, 234, 244, 273, 277, 320 Metabolic labeling��������������������������������������������������������������58 Metabolomics�������������������������������������������������������������������336 1-Methyl-3-nitro-1-nitrosoguanidine (MNNG)������������������������������������������������321–325 Microperoxisomes��������������������������������������������������������������14 Microscope slides�������������� 122, 123, 128, 135, 143, 192–196 Microtome������������������������������������������������������������������������107 Mitochondria��������������������������� 2–7, 9, 10, 13, 18, 20, 22, 24, 25, 30, 70, 71, 75, 93, 98, 99, 114, 124, 131, 153, 154, 159, 162, 165, 170, 171, 174, 198, 203, 244, 340, 341 Motility���������������������������������������������132, 144–147, 149, 170 Mounting���� 74, 108, 119, 123, 124, 127, 128, 155, 169, 192, 193, 195, 196, 245, 246, 262 Mouse������������ 7, 9, 13–26, 28, 30, 31, 82, 117, 120, 122–124, 166, 243, 245, 251, 253, 258, 260, 268, 341 Mouse embryonic fibroblasts (MEFs)��������������������� 153–155, 159, 166, 171, 246 Mowiol����������������������������������������������116, 122–124, 128, 193 MRI������������������������������������������������������������������������� 336, 337 MTT cell viability assay����������������������������������� 168, 173, 176 Mutagenesis���������������182, 224, 225, 227, 228, 230, 321, 322 Myc���������������������������������������������������������� 117, 128, 237–239 Mycoplasma��������������������������������������������� 154, 156, 167, 169 Myc tagged ubiquitin��������������������������������������� 234, 237–239 Myelin����������������������������������� 14, 15, 17, 19, 23, 24, 258, 337 N N-glycosylation�������������������������������������������������������� 222, 223 Nigericin����������������������������������������������������������� 182, 184, 188 M O Maintenance�������������������������������� 73, 118, 181, 233, 307, 309 Marker enzymes������������������������������������������������� 6, 14, 21–23 Marker protein����������������������������� 3, 7, 72, 75, 101–111, 117, 122, 124, 125, 129, 135, 283 Mass spectrometry (MS)����������������������38, 51, 233, 268–272, 274–275, 279–287, 293, 295, 342 Matrix protein������������������������������ 30, 55, 121, 123–126, 128, 129, 174, 175, 191, 192, 197, 203, 207, 211, 213–218, 221, 258, 268, 321, 324, 325 mCherry������������������������������������ 135, 142, 145, 148, 307, 310 Opsin-tag��������������������������������������������������������� 223–228, 230 Organelle cross talk����������������������������������������������������������170 Organelle purification brain�����������������������������������������������������������������������13, 14 kidney������������������������������������������������������������� 1–3, 13–26 liver����������������������������������������������������������������� 1, 2, 13–26 mammalian cells�����������������������13, 69–79, 113, 151–164, 181–189, 213–219, 221–232, 243–248 Overexpression����������������������������������������������������� 3, 245, 246 Oxidative stress����������������� 151, 159, 162, 165–178, 182, 258 Peroxisomes: Methods and Protocols 346 Index P Passaging��������������������������������������������������������������������������183 Patient cells������������������������������������������������������ 125, 188, 321 PBDs See Peroxisome biogenesis disorders (PBDs) PCR See Polymerase chain reaction (PCR) Perfusion fixation����������������������������������������������������������95–96 Permeabilization����������������������������������������������� 122–123, 128 Peroxins (PEX) genes�� 29, 197, 202, 207, 214, 320, 321, 337 Peroxisomal diseases��������������������������������� 331, 333, 339–341 Peroxisomal localization��������������������������� 117, 121, 124, 324 Peroxisomal membrane protein (PMP)����������������������� 39, 70, 120–123, 198, 200, 203, 207–211, 213–218, 221–228, 230, 231, 234, 244, 320 Peroxisomal protein��������������������������3, 27–34, 113–129, 132, 191–196, 214, 233–240, 244, 257–264, 267–287, 306, 307, 310, 311, 313, 337 Peroxisome biogenesis��������������������������������������13, 45, 63, 69, 197–204, 207, 213, 214, 221, 222, 243, 314, 320, 321, 332, 333, 335, 336 Peroxisome biogenesis disorders (PBDs)��������������������� 13, 45, 53, 54, 213, 243, 258, 319–321, 332 Peroxisome-deficient mutant cells����������������������������319–325 Peroxisome distribution����������������������������������������������������147 Peroxisome isolation�������������������������������������������������������1–10 Peroxisome targeting signal (PTS)�����78, 102, 117, 123, 132, 135, 182, 192, 197 Pex1����������������������������������������������������������������������������������221 Pex3���������������������������������������������������������� 237, 244, 246, 247 Pex5���������������������������������������������������������������������������� 14, 124 Pex11������������������������������������������������������������������������ 249, 250 Pex13����������������������������������������������������������������������������������14 Pex14�������������������������������������������������7, 9, 117, 121, 123, 244 Pex19��������������������������������������������������������������������������������221 Pexophagy���������������������������������233, 243–247, 249–255, 268 pH homeostasis����������������������������������������������������������������181 pH measurement���������������������������������������������� 182–183, 186 Phosphatase��������267, 268, 271–273, 278, 279, 282, 283, 285 Phosphomimicking mutants������������������������������������� 270, 287 Phosphorylation site localization������������������������������ 271, 282 Phos-tag SDS-PAGE���������������270, 271, 278, 280, 284–287 Photoactivation��������������������������������������������������������170–173 Photobleaching����������������������������������122, 146, 152, 161, 176 Photosensitizer��������������������������������������������������������� 166, 176 pHRed����������������������������������������������������������������������181–189 Pichia pastoris�������������������������������������������� 234, 250, 253, 254 Plant growth�������������������������������������������������������������293–294 Plant seedling��������������������������������������������������� 293–296, 303 Plasmalogen������������������ 55–60, 319, 321, 325, 333, 335–337 Plasmid����������������������������������� 63–66, 89, 114, 115, 118, 119, 125–127, 132, 136–141, 147, 153–160, 166, 167, 169–171, 174, 175, 183, 225, 245, 308, 310, 312, 314, 316, 317 PMP See Peroxisomal membrane protein (PMP) PNGase F������������������������������������������������� 223, 225, 228, 229 Polymerase chain reaction (PCR)���������83, 89, 126, 134, 136, 138–140, 147, 225, 226, 230, 260, 261, 312, 316 Postfixation�������������������������������������������������������������������������99 Preincubation���������������������������������������������������������������������99 Primary antibody������������������������������110, 116, 120, 123, 127, 128, 192, 238, 246, 263, 325 Primary skin fibroblasts������������������������������ 45, 53, 63–66, 71 Protease inhibitors���������������������� 15, 27, 30, 38, 40, 200, 215, 224, 235, 283 Protease protection assay�������������������������������������� 27–34, 129 Protein A����������������������� 37–39, 104, 109, 234–236, 239, 240 Proteinase K (PK)�������������������������������������������� 28, 29, 31–34 Protein complex(es)�������������������29, 37–43, 69, 198, 201–204 Protein degradation����������������������������������������������������������233 Protein import�������������������������� 162, 175, 191–198, 203, 210, 213–218, 321, 325 Protein phosphorylation�������������������������������������������267–287 Protein tagging��������������������������������������������������������� 224, 230 Protein targeting������������������������������������������������������� 214, 230 Protein topology�����������������������������������������������������������27–34 Protein trafficking������������������������������������������������������������233 Proteomics������������������������������������������������ 113–114, 267–287 Protoplasts���������������������������������������������������������������� 141, 142 PTS See Peroxisome targeting signal (PTS) Q Quantitation�������������������������������������������������������������299–301 Quenching������������������������������������������������������������������������102 R Racemase������������������������������������������������������������������ 332, 339 Rat���������������������������������1–10, 14, 24, 30, 31, 94, 96, 98, 208, 210, 246, 260, 324 Ratiometric analysis������������������������������������������ 152, 157–158 Reactive oxygen species (ROS)��� 13, 113, 151, 152, 165, 166, 170, 306 Readthrough induction�������������������������������������������������������82 Recovery����������������������������������������������������������� 211, 298–299 Redox measurements���������������������������������������� 152, 157–158 Redox signaling����������������������������������������������������������������165 Redox state������������������������������������������������������� 158–162, 170 Refsum disease������������������������������������������������� 332, 339, 340 Rehydration���������������������������������������102, 103, 105–107, 110 Replicating����������������������������������������������� 307, 309, 310, 314 Reporter system������������������������������������������������������������81–91 RFP���������������������������������������������������������86, 88, 91, 135, 145 RNA interference (RNAi)��������������������������������������������69, 77 RoGFP2����������������������������������������������������������� 151–163, 170 ROS See Reactive oxygen species (ROS) S Saccharomyces cerevisiae See Yeast Sample preparation��32, 50–51, 101, 105, 200, 272, 274–275, 280–281 Peroxisomes: Methods and Protocols 347 Index Saponin�������������������������������������������������������������������� 262, 263 SCC See Stop codon context (SCC) SCPx See Sterol carrier protein x (SCPx) 35 S-cysteine������������������������������������������������������� 209, 210, 228 SDS-PAGE See Sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) Secondary antibody����������������������������24, 116, 122–124, 128, 192, 237, 238, 245, 246 Sectioning����������������������������������������������95, 96, 102, 107, 108 Sedimentation��������������������������������������������������������������30, 41 Seed production��������������������������������������������������������293–296 Selection������������������38, 40, 82, 162, 187, 203, 295, 307–309, 311–315, 317, 318, 321, 322, 324, 325 Semi-intact cells����������������������������������������������� 208, 213–218 SGA See Synthetic genetic array (SGA) siRNA See Small interfering RNA (siRNA) Small interfering RNA (siRNA)���������������������������� 63, 69–78 35 S-methionine������������������������������������������������� 209, 210, 228 Sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)���������������27, 29–33, 38, 39, 41–43, 198, 200, 201, 203, 204, 211, 228, 231, 233, 237, 251, 253, 268–271, 273–274, 278–279, 284–287 Spheroplasts����������������������������������������������������� 193, 194, 196 Sprague-Dawley�����������������������������������������������������������������94 Stable-isotope���������������������������������������������������������������45–54 Sterol carrier protein x (SCPx)����������������������� 29, 30, 32, 339 Stop codon context (SCC)������������������������������� 83, 84, 87–91 Stop codon readthrough����������������������81, 82, 87–89, 91, 132 Storage oil mobilization�������������������������������������������291–303 Stream acquisition������������������������������������������������������������145 Subcellular fractionation������������������������������������������� 3, 9, 211 Subcellular proteomics����������������������������������������������������������9 Superoxide anion radical������������������������������������������ 151, 165 SWAp-Tag (SWAT)������������������������ 305–308, 310, 312–318 Synthetic genetic array (SGA)������������������������� 306–308, 311, 312, 314, 317, 318 T Tagged proteins����������������������������������������������� 228, 246, 282, 311, 316 TAP-tagged proteins��������������������������������������������������������282 Targeting signal�������������������������������������������������� 81, 120, 152 TCA See Trichloroacetic acid (TCA) Thawing����������������������������������������8, 282, 284, 309–310, 317 Thin-layer chromatography (TLC)������������������ 17, 23, 56–59 Time-lapse microscopy������������������������������������� 157, 161, 162 Tokuyasu�������������������������������������������101, 102, 104–106, 110 Topology analysis�����������������������������������������������������122–123 Transfection DEAE Dextran���������������������������������� 118–120, 126, 127 efficiency��������������������������� 63–66, 76, 122, 124, 126, 127, 160, 170, 171, 174, 175 electroporation����������������������������63, 72, 75–78, 125–127, 155–157, 160, 167–170, 173, 175, 183, 188, 247 lipofection����������������������������������70, 76–77, 125, 126, 188 microporation������������������������������������73–75, 77, 125, 188 nucleofection����������������������������������������������������������63–66 PEI������������������������������������������������������������� 125, 126, 188 Transformation����������������������������91, 132–134, 136–142, 148 Translational readthrough��������������������������������������������81–91 Transmission electron microscope���������������������������� 102, 109 Trichloroacetic acid (TCA)����������������������30–32, 56–60, 210, 211, 234, 235, 239, 251, 252, 255 Triton X-100���������������������������� 15–17, 21–23, 25, 29, 31, 39, 116, 120, 123, 124, 128, 133, 198, 217, 234, 245, 273, 277, 283, 294, 295 Trypsinization���������������������������������������������������� 65, 126, 261 Tryptic digest��������������������� 270, 271, 274–275, 279–281, 284 U Ubiquitin���������������������������������������������������������� 234, 238, 244 Ultracentrifugation������������������������������41, 208, 211, 276, 277 Ustilago maydis���������������������������������������������������������� 131–149 UV-resistant�������������������������������������������������������������322–325 V Vacuole��������������������������������������������������������������������� 249, 250 Vectors64–66, 77, 83, 84, 86, 89–91, 120, 122, 123, 135, 136, 138, 139, 183, 224–228, 230 Venus-luciferase assay��������������������������������� 82, 86–88, 90, 91 Very-long-chain fatty acids (VLCFA)���������������� 45–54, 207, 243, 319, 333, 335, 336, 338, 339 Viability test�������������������������������������������������������������298–299 Vinyl-ether bond����������������������������������������������������������55–57 VLCFA See Very-long-chain fatty acids (VLCFA) W Western blotting�������������� 28, 30–33, 200, 204, 237, 260, 285 X X-ALD See Adrenoleukodystrophy (ALD) Y Yeast����������������������������� 37–43, 126, 131–134, 136–140, 143, 153, 191–196, 221–231, 233–240, 243, 244, 249–255, 268, 272, 276, 282, 284, 285, 305–309, 313, 314, 319–321 Yeast recombination cloning��������������������� 132–133, 135–141 Z Zellweger syndrome (ZS)���������������������������14, 213, 319, 320, 331, 333–335 ... start working on this fascinating organelle Due to their growing importance in health and development, there is increasing interest in the study of peroxisomes Furthermore, peroxisomes combine properties... Morphologically, peroxisomes appear in varying sizes and shapes in different tissues and contain a differing subset of proteins Accordingly, there is no standard procedure for peroxisome isolation and protocols. .. (ed.), Peroxisomes: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, vol 1595, DOI10.1007/978-1-4939-6937-1_2, â Springer Science+Business Media LLC 2017 13 14 Miriam J Schửnenberger and Werner