Methods in Molecular Biology 1573 Brad M Binder G Eric Schaller Editors Ethylene Signaling Methods and Protocols Methods in Molecular Biology Series Editor John M Walker School of Life and Medical Sciences University of Hertfordshire Hatfield, Hertfordshire, AL10 9AB, UK For further volumes: http://www.springer.com/series/7651 Ethylene Signaling Methods and Protocols Edited by Brad M Binder Department of Biochemistry & Cellular and Molecular Biology, University of Tennessee, Knoxville, TN, USA G Eric Schaller Department of Biological Sciences, Dartmouth College, Hanover, NH, USA Editors Brad M Binder Department of Biochemistry & Cellular and Molecular Biology University of Tennessee Knoxville, TN, USA G Eric Schaller Department of Biological Sciences Dartmouth College Hanover, NH, USA ISSN 1064-3745 ISSN 1940-6029 (electronic) Methods in Molecular Biology ISBN 978-1-4939-6852-7 ISBN 978-1-4939-6854-1 (eBook) DOI 10.1007/978-1-4939-6854-1 Library of Congress Control Number: 2017931962 © Springer Science+Business Media LLC 2017 This work is subject to copyright All rights are reserved by the Publisher, whether the whole or part of the material is concerned, specifically the rights of translation, reprinting, reuse of illustrations, recitation, broadcasting, reproduction on microfilms or in any other physical way, and transmission or information storage and retrieval, electronic adaptation, computer software, or by similar or dissimilar methodology now known or hereafter developed The use of general descriptive names, registered names, trademarks, service marks, etc in this publication does not imply, even in the absence of a specific statement, that such names are exempt from the relevant protective laws and regulations and therefore free for general use The publisher, the authors and the editors are safe to assume that the advice and information in this book are believed to be true and accurate at the date of publication Neither the publisher nor the authors or the editors give a warranty, express or implied, with respect to the material contained herein or for any errors or omissions that may have been made The publisher remains neutral with regard to jurisdictional claims in published maps and institutional affiliations Cover illustration: Apical hook of a dark-grown Arabidopsis seedling grown in the presence of ethylene The seedling was visualized by collapsing multiple Z-stack images from a confocal, with red fluorescence arising from propidium iodide staining of the cell wall Green fluorescence arises from an EIN3-GFP reporter, this appearing predominantly yellow due to overlap with red fluorescence (photograph by Yan Zubo) Printed on acid-free paper This Humana Press imprint is published by Springer Nature The registered company is Springer Science+Business Media LLC The registered company address is: 233 Spring Street, New York, NY 10013, U.S.A Preface Ethylene was the first gaseous hormone discovered, and its discovery was prompted by the pronounced effects of “illuminating gas” on plant growth and development Illuminating gas, a coal by-product, was piped throughout cities during the Victorian era as a fuel source for the lamps lighting streets and houses Gas leaking from the pipes induced early senescence as well as leaf and petal abscission in nearby plants, which prompted a search for its active component In 1901, Dimitry Neljubow demonstrated that this active component was the simple hydrocarbon ethylene In the 1930s, Richard Gane established that plants produced their own ethylene, establishing ethylene as an endogenous plant growth regulator Ethylene is now most popularly known for its role in controlling fruit ripening, but ethylene also regulates many other traits of agricultural significance including senescence, abscission, biomass, and responses to biotic and abiotic stresses As such, ethylene continues to be a focus for worldwide research This volume in the Methods in Molecular Biology series provides a collection of protocols for the research scientist appropriate to the study of ethylene signaling in plants Topics covered relate to ethylene biosynthesis, the signal transduction pathway, and the diverse ethylene responses of dicots and monocots The section on ethylene biosynthesis includes six chapters, with techniques for the measurement of activities related to the biosynthetic enzymes ACC synthase and ACC oxidase, for quantifying the levels of ethylene synthesized by plants, as well as for the treatment of plants with exogenous ethylene The section on the signal transduction pathway includes six chapters and focuses on the analysis of the novel membrane-associated proteins involved in the initial perception and transduction of the ethylene signal, including the ethylene receptors, CTR1 and EIN2 Many of these biochemical techniques were derived from work in Arabidopsis where these signaling elements were first discovered, but the approaches are readily transferable to the study of similar proteins in other species The section on ethylene responses includes seven chapters covering assays applicable to dicots and monocots, including methods related to the roles of ethylene in germination, growth, abscission, abiotic stress, and defense This section also includes information on Arabidopsis mutants and the variety of chemical inhibitors that affect ethylene responses The chapters follow the established format used throughout the Methods in Molecular Biology™ series They include an Abstract, an Introduction, a detailed Materials section with lists of chemicals, buffers, and equipment, a step-by-step Methods section, as well as Notes and References The Notes are often of particular use to investigators as these give additional background, provide alternative approaches, and describe potential difficulties and how these can be resolved The protocols are intended for both experienced and beginning researchers, for those with prior experience in the study of ethylene signaling, and for those just entering this exciting research area v vi Preface The editors thank their “scientific parents”: Michael Sussman who pushed them over the edge and down that slippery slope of plant membrane biochemistry and Tony Bleecker who enthusiastically introduced them to that deceptively simple hydrocarbon ethylene and the myriad effects it has on plants The editors also thank all those colleagues who so willingly shared their protocols for this Methods in Molecular Biology volume on Ethylene Signaling Knoxville, TN, USA Hanover, NH, USA Brad M. Binder G. Eric Schaller Contents Preface v Contributors ix Part I Analysis of Ethylene Biosynthesis Gas Chromatography-Based Ethylene Measurement of Arabidopsis Seedlings Gyeong Mee Yoon and Yi-Chun Chen Plant Ethylene Detection Using Laser-Based Photo-Acoustic Spectroscopy Bram Van de Poel and Dominique Van Der Straeten Treatment of Plants with Gaseous Ethylene and Gaseous Inhibitors of Ethylene Action Mark L Tucker, Joonyup Kim, and Chi-Kuang Wen Analysis of 1-Aminocyclopropane-1-Carboxylic Acid Uptake Using a Protoplast System Won-Yong Song, Sumin Lee, and Moon-Soo Soh 5 Escherichia coli-Based Expression and In Vitro Activity Assay of 1-Aminocyclopropane-1-Carboxylate (ACC) Synthase and ACC Oxidase Shigeru Satoh and Yusuke Kosugi Assay Methods for ACS Activity and ACS Phosphorylation by MAP Kinases In Vitro and In Vivo Xiaomin Han, Guojing Li, and Shuqun Zhang 11 27 41 47 59 Part II Analysis of the Ethylene Signaling Pathway Analysis of Ethylene Receptors: Ethylene-Binding Assays Brad M Binder and G Eric Schaller Analysis of Ethylene Receptors: Assay for Histidine Kinase Activity G Eric Schaller and Brad M Binder Analysis of Ethylene Receptor Interactions by Co-immunoprecipitation Assays Zhiyong Gao and G Eric Schaller 10 Localization of the Ethylene-Receptor Signaling Complex to the Endoplasmic Reticulum: Analysis by Two-Phase Partitioning and Density-Gradient Centrifugation G Eric Schaller 11 Kinase Assay for CONSTITUTIVE TRIPLE RESPONSE (CTR1) in Arabidopsis thaliana Han Yong Lee and Gyeong Mee Yoon vii 75 87 101 113 133 viii Contents 12 Circular Dichroism and Fluorescence Spectroscopy to Study Protein Structure and Protein–Protein Interactions in Ethylene Signaling 141 Mareike Kessenbrock and Georg Groth Part III Analysis of Ethylene Responses 13 The Triple Response Assay and Its Use to Characterize Ethylene Mutants in Arabidopsis Catharina Merchante and Anna N Stepanova 14 Time-Lapse Imaging to Examine the Growth Kinetics of Arabidopsis Seedlings in Response to Ethylene Brad M Binder 15 Inhibitors of Ethylene Biosynthesis and Signaling G Eric Schaller and Brad M Binder 16 Analysis of Growth and Molecular Responses to Ethylene in Etiolated Rice Seedlings Biao Ma and Jin-Song Zhang 17 Love Me Not Meter: A Sensor Device for Detecting Petal Detachment Forces in Arabidopsis thaliana Andrew Maule, Graham Henning, and Sara Patterson 18 Effects of Ethylene on Seed Germination of Halophyte Plants Under Salt Stress Weiqiang Li and Lam-Son Phan Tran 19 Assessing Attraction of Nematodes to Host Roots Using Pluronic Gel Medium 163 211 223 237 245 253 261 Valerie M Williamson and Rasa Čepulytė Index 269 Contributors Brad M. Binder • Department of Biochemistry & Cellular and Molecular Biology, University of Tennessee, Knoxville, TN, USA Rasa Čepulytė • Department of Plant Pathology, University of California, Davis, CA, USA Yi-Chun Chen • Department of Botany and Plant Pathology, Purdue University, West Lafayette, IN, USA Zhiyong Gao • State Key Laboratory of Hybrid Rice, College of Life Sciences, Wuhan University, Wuhan, China Georg Groth • Institute of Biochemical Plant Physiology, Heinrich-Heine University Düsseldorf, Düsseldorf, Germany Xiaomin Han • College of Life Sciences, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot, Inner Mongolia, P. R China Graham Henning • Department of Horticulture, University of Wisconsin, Madison, WI, USA Mareike Kessenbrock • Institute of Biochemical Plant Physiology, Heinrich-Heine University Düsseldorf, Düsseldorf, Germany Joonyup Kim • Department of Cell Biology and Molecular Genetics, University of Maryland, Biosciences Research Bldg., College Park, MD, USA Yusuke Kosugi • Faculty of Agriculture, Kagawa University, Miki-cho, Kagawa, Japan Han Yong Lee • Department of Botany and Plant Pathology, Purdue University, West Lafayette, IN, USA Sumin Lee • Department of Integrative Bioscience and Biotechnology, College of Life Science, Sejong University, Seoul, Republic of Korea Guojing Li • College of Life Sciences, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot, Inner Mongolia, P. R China Weiqiang Li • Signaling Pathway Research Unit, RIKEN Center for Sustainable Resource Science, Yokohama, Japan Biao Ma • State Key Lab of Plant Genomics, Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences, Beijing, China Andrew Maule • Department of Horticulture, University of Wisconsin, Madison, WI, USA Catharina Merchante • Departamento de Biología Molecular y Bioquímica, Instituto de Hortofruticultura Subtropical y Mediterranea (IHSM)-UMA-CSIC, Universidad de Málaga, Málaga, Spain Sara Patterson • Department of Horticulture, University of Wisconsin, Madison, WI, USA Bram Van de Poel • Faculty of Sciences, Laboratory of Functional Plant Biology, Department of Physiology, Ghent University, Gent, Belgium Shigeru Satoh • Faculty of Agriculture, Ryukoku University, Otsu, Japan G. Eric Schaller • Department of Biological Sciences, Dartmouth College, Hanover, NH, USA ix x Contributors Moon-Soo Soh • Department of Integrative Bioscience and Biotechnology, College of Life Science, Sejong University, Seoul, Republic of Korea Won-Yong Song • Department of Life Science, Pohang University of Science and Technology, Pohang, Republic of Korea Anna N. Stepanova • Department of Plant and Microbial Biology, North Carolina State University, Raleigh, NC, USA; Genetics Graduate Program, North Carolina State University, Raleigh, NC, USA Dominique Van Der Straeten • Faculty of Sciences, Laboratory of Functional Plant Biology, Department of Physiology, Ghent University, Gent, Belgium Lam-Son Phan Tran • Signaling Pathway Research Unit, RIKEN Center for Sustainable Resource Science, Yokohama, Japan Mark L. Tucker • Soybean Genomics and Improvement Lab, USDA/ARS, BARC-West, Beltsville, MD, USA Chi-Kuang Wen • National Key Laboratory of Plant Molecular Genetics, CAS Center for Excellence in Molecular Plant Sciences, Institute of Plant Physiology and Ecology, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China Valerie M. Williamson • Department of Plant Pathology, University of California, Davis, CA, USA Gyeong Mee Yoon • Department of Botany and Plant Pathology, Purdue University, West Lafayette, IN, USA Jin-Song Zhang • State Key Lab of Plant Genomics, Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences, Beijing, China Shuqun Zhang • Division of Biochemistry, Interdisciplinary Plant Group, and Bond Life Sciences Center, University of Missouri, Columbia, MO, USA Effects of Ethylene on Seed Germination of Halophyte Plants Under Salt Stress 257 Table 400 mM NaCl+ ACC working solutions Working solutions NaCl 2 M NaCl (mL) 100 mM ACC (mL) Water (mL) Final volume (mL) 400 mM NaCl 10 40 50 0.1 mM ACC+400 mM NaCl 10 0.05 39.95 50 0.5 mM ACC+400 mM NaCl 10 0.25 39.75 50 1 mM ACC+400 mM NaCl 10 0.5 39.5 50 5 mM ACC+400 mM NaCl 10 2.5 37.5 50 10 mM ACC+400 mM NaCl 10 35 50 20 mM ACC+400 mM NaCl 10 10 30 50 0.02% (v/v) Triton X solution in a 1.5 mL tube, followed by rinsing twice in 1 mL distilled water Subsequently, seeds can be washed with the working solutions (water, NaCl, ACC+NaCl or Eth+NaCl, and ACC or Eth solutions) Incubate seeds in the working solutions We use 5 mL of each working solution in the 50 × 9 mm tight-fitting plastic Petri dishes Four replicates of 50 seeds are placed on two layers of wet filter paper and the lids to the Petri dishes then closed To maintain the wetness of the filter paper, the Petri dishes are sealed with parafilm (see Note 3) Each dish is placed in a 10-cm diameter plastic Petri dish as an extra precaution against water loss by evaporation Seeds are germinated at 22 °C under continuous light (fluorescent lamp, intensity approximately 100 μmol m−2 s−1) Check germination Seeds are considered germinated when the seed radicle emerges (Sanyo, Japan) The germination percentage is recorded every day for 10 consequent days in our experimental design Germination data are arcsine transformed before statistical analysis to ensure homogeneity of variance Data can be analyzed using the Student’s t -test (P 20% PF-127 Not recommended for prolonged seedling culture Highly transparent, allowing for excellent visualization Bubbles can be trapped when gel forms reducing clarity Facilitates formation of stable chemical gradients Messy: gel sticks to surfaces (containers, pipette tips, tubes, etc.) Nontoxic: has been used in medical and cosmetic formulations Gel is soft, not rigid, making formation of wells difficult and streaking bacteria impossible Nematodes move through the gel in three dimensions Fig Hatching chamber for root-knot nematode eggs A metal screen with bent edges, Kimwipe tissue, and beaker are assembled as shown This assembly is covered with foil and autoclaved For hatching, the nematode egg solution is placed on the tissue of the sterile chamber and water is brought to a level so that the tissue is just submerged This assembly is again covered with foil and then kept at room temperature for hatching Centrifuge with a swinging bucket rotor that can accommodate 50 ml disposable plastic tubes such as Beckman Allegra 6R Dissecting microscope with ~100- to 700-fold magnification Hatching chamber: Place a metal mesh screen in a 500 ml autoclavable beaker and then place 8–10 layers of Kimwipe paper tissue on metal screen with upward bent edges (Fig 2) Wrap all with foil and autoclave 23% (w/v) Pluronic gel (100 ml): To 80 ml of cold, sterile, deionized water in a glass bottle with a magnetic stir bar inside, add 23 g of PF-127 powder with stirring Continue to stir at 4 °C until dissolved (this can take up to 24 h) (see Note 2) Tris-MES buffer (1 M stock): Combine 1.21 g Tris (2-amino-2hydroxymethyl-propane-1,3-diol), 1.95 MES (2-(N-morpholino) ethanesulfonic acid) with 7.45 ml water (see Note 3) 36% (w/v) sucrose: Place 180 g sucrose in a sterile container and bring to 500 ml with sterile water Prepare fresh 264 Valerie M Williamson and Rasa Cˇepulyte˙ 3 Methods 3.1 Nematode Culture (See Note 4) Germinate tomato vermiculite (Solanum lycopersicum) seeds in After 4 weeks, transfer seedlings to 32 oz Styrofoam cups with drainage holes in the bottom and filled with sterilized river sand After an additional 2 weeks, inoculate with 10,000 RKN eggs (see Note 5) Make at least two small holes in the surface of the sand around the roots and pipette the nematodes into the holes 3.2 Preparation of Nematode Juveniles Wash tools (bowl, plastic container, lid, scissors, sieves) and soak in hot water for at least 5 min to prevent cross infection (see Note 6) Cut off and discard the above-ground parts of tomato plant that was infected 6–8 weeks before Place the pot with roots into a bowl of cold water and gently wash the sand from the roots Cut the cleaned roots with scissors into 2–3 cm pieces and put into a plastic container (~1 l) with tight-fitting lid Add 500 ml of 0.6% (w/v) NaClO (see Note 1), close the lid, and shake vigorously for 3 min (see Note 7) Put the mesh #200 sieve on the top of mesh #500 sieve and empty the bleach-treated roots into the top sieve Rinse the roots on the sieves with abundant cold water until no bleach odor is detected Gently wash the mesh #500 sieve, which should contain the eggs, with tap water to concentrate the eggs to one corner of the sieve and collect the eggs into a 50 ml disposable centrifuge tube Centrifuge the tube at 1400 × g for 5 min and remove supernatant 10 Add 36% (w/v) sucrose to a total volume of 45 ml, shake well 11 Gently layer 5 ml of water on the top of the sucrose solution Centrifuge at 330 × g for 5 min (see Note 8) 12 Collect the eggs from the top (water) layer with a 1 ml pipetter and transfer into a new 50 ml centrifuge tube with 30 ml of water 13 Fill the tube to 50 ml with water and centrifuge at 1400 × g for 1 min, remove the supernatant 14 Add 50 ml of 0.6% (w/v) NaClO, shake for 30 sec, centrifuge at 1400 × g for 1 min, and remove the supernatant (see Note 7) 15 Add 50 ml of water and centrifuge 1400 × g for 1 min, remove the supernatant Repeat three times Nematode Attraction to Roots 265 16 Suspend the eggs in ~10 ml water and pour onto Kimwipe paper tissue in a sterile hatching chamber Add sterile water to the hatching chamber until it reaches the bottom of Kimwipe paper tissues, cover with foil, and allow to hatch for 2–3 days at room temperature (see Note 9) 17 Collect hatched J2 nematodes that settle to the bottom of the cup to a 50 ml disposable centrifuge tube 18 Pour the J2 nematode suspension into a disposable 50 ml vacuum filtration unit (e.g., 22 micron filter Steriflip, Millipore, USA) 19 Wash the J2 nematodes, which are retained on the filter, by attaching a 50 ml disposable centrifuge tube with 15 ml of sterile water to the top of the vacuum filtration unit and shaking The nematodes are released from the filter and dispersed in the water 20 Count the J2 nematodes in the tube (see Note 5) and concentrate by centrifugation if necessary 3.3 Seedling Preparation (See Note 10) Submerge seed in 70% (v/v) ethanol in a 1.5 ml microfuge tube for 5 min Remove ethanol and then soak seeds in 0.9% (w/v) NaClO for 10 min Rinse seed 4× with sterile water and suspend in 0.1% (w/v) agarose Place the seeds on 0.5× MS plates (1% (w/v) Phytogel, 0.5× Mirashige, and Skoog medium with Gamborg’s vitamins) covered with a circle of Whatman #1 filter paper and keep at 4 °C for 2 days Transfer the plates to a growth chamber (16 h light, 8 h dark; 24 °C) at an angle of 60° to promote unidirectional root growth 3.4 Attraction Assays Add 15 ml of 23% (w/v) PF-127 and 150 μl of 1 M Tris-MES buffer to a 50 ml beaker with stir bar in a 15 °C incubator (see Note 11) Add 2500 freshly hatched juveniles in 1 ml of sterile water to the PF-127 (see Note 12) and stir slowly for at least 10 min at 15 °C To each well in a 12-well tissue-culture plate add 1 ml the 23% PF-127 gel with the suspended nematodes Transfer the plate to room temperature and immediately add an intact seedling into each well Observe and record the response of juveniles to root exudates under dissecting microscope (see Note 13) 266 Valerie M Williamson and Rasa Cˇepulyte˙ 4 Notes We use diluted commercial bleach in several of our procedures The concentration of sodium hypochlorite (NaClO) in commercial bleach as listed on the container can range from about to 8% Therefore, we give concentrations as % NaClO. Use freshly diluted bleach solutions Mixing the PF-127 powder and water with a spatula and putting the mixture in an ice bath can speed up solution preparation The 23% (w/v) PF-127 stock can be stored at 4 °C for 1 month This buffer is 1 M each in Tris and MES Do not adjust the pH. The pH of dilute buffer should be about 7.1 Store at 4 °C Root-knot nematodes (RKN) are plant pathogens and generally a permit is required to maintain or ship them The requirements vary with location and local authorities should be consulted These parasites are obligate parasites and must be propagated on living plants For RKN the most commonly used host is tomato in either a greenhouse or growth chamber [14] Some tomato varieties carry the resistance gene Mi and will not support reproduction of certain RKN species [15] We generally use sterile, coarse sand as a growth medium and provide a standard nutrient solution during watering For optimal nematode reproduction, good drainage for the roots is required Follow Subheading 3.2, steps 1–8, for egg isolation Continue to step 20 for infective juveniles (J2) To estimate number of nematodes (eggs or J2) in solution, take several small aliquots (2–20 μl) of the solution and examine under a dissecting microscope As a guide, Fig shows the appearance, size, and shape of Meloidogyne hapla eggs and J2 Adjust the size of the aliquot to contain 10–100 eggs or J2 and count replicates To decontaminate equipment, the water temperature should be at least 52 °C, a temperature that is lethal to the nematodes Do not leave nematode eggs in bleach solutions for longer than or 4 min as survival is affected After layering water on the 36% (w/v) sucrose solution, separate layers will be seen in the tube Following centrifugation at slow speed, the eggs form a white band between the water and sucrose layer It is important to centrifuge at slow speed for this to work! Nematode eggs are well separated from most contaminants by this procedure Do not leave the eggs in sucrose solution longer than necessary as this is detrimental to their survival Nematode Attraction to Roots 267 Fig Eggs and juveniles of Meloidogyne hapla The oval-shaped eggs are in various stages of development ranging from the two-cell stage to fully developed J2 nematodes that are ready to hatch Vermiform J2 nematodes are approximately 350 μm in length and can be distinguished from most other nematode groups by the relatively clear anterior end Size bar is 100 μm Hatch the eggs and collect the juveniles as much as possible under aseptic conditions using a laminar hood if available After hatching, the J2 nematodes will migrate through the Kimwipes and settle at the bottom of the hatching chamber 10 The protocol presented here is for Arabidopsis We have also used tomato, Medicago truncatula, and common bean seeds Seed germination protocols, seedling age, and attraction assay conditions will need adjustment if these or other species are used (see refs 12 and 13) 11 Aliquoting 23% (w/v) PF-127 can be messy due to its viscosity Use a pipet aid such as the Drummond Portable Pipet-Aid XP2 with a 25 ml pipet Chilling the pipets at 4 °C makes the pipetting easier It is a good idea to prepare 10% extra gel volume as some of the gel sticks to the inside of the pipet and on glassware The stirrer should spin slowly, i.e., less than 155 rpm, because otherwise air bubbles form in the gel Dispense the gel into the wells carefully to reduce bubble formation 12 Equilibrate previously refrigerated PF-127 solution to around 15 °C before adding nematodes; otherwise, nematodes may enter a quiescent state 13 Incubate assays at ≥ 20 °C; a lower temperature will result in soupy medium and poor nematode mobility For best viewing, invert the plate and observe under the microscope through the plate bottom Data can be collected at multiple time points and can include a range of parameters (e.g., number J2 nematodes touching terminal 7 mm of root tip; number within 268 Valerie M Williamson and Rasa Cˇepulyte˙ 7 mm of root tip) depending on the experiment goal For these measurements, it is useful to make a template grid on transparent film and tape it to the plate bottom Acknowledgments This work was supported by the United States Department of Agriculture (Agricultural Food and Research Initiative award 2013-02577) to V.M.W. We thank George Bruening for helpful comments and suggestions References Trudgill DL, Blok VC (2001) Apomictic, polyphagous root-knot nematodes: exceptionally successful and damaging biotophic root pathogens Annu Rev Phytopathol 39:53–77 Moens, M, Perry RN, Starr JL (2009) Meloidogyne species: a diverse group of novel and important plant parasites In: Moens M, Perry RN, Starr JL (eds.) Root-knot nematodes CABI, Wallingford, UK Jones JT, Haegeman A, Danchin EG et al (2013) Top 10 plant-parasitic nematodes in molecular plant pathology Mol Plant Pathol 14:946–961 Rühm R, Dietsche E, Harloff HJ et al (2003) Characterization and partial purification of a white mustard kairomone that attracts the beet cyst nematode Heterodera schachtii Nematol 5:17–22 Spiegel Y, Burrows PM, Bar-Eyal M (2003) A chemo-attractant in onion root exudates recognized by Ditylenchus dipsaci in laboratory bioassay Phytopathology 93:127–132 Zhao LL, Wei W, Kang L et al (2007) Chemotaxis of the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, to volatiles associated with host pine, Pinus massoniana, and its vector Monochamus alternatus J Chem Ecol 33(6):1207–1216 Abou-Setta MM, Duncan LW (1998) Attraction of Tylenchulus semipenetrans and Meloidogyne javanica to salts in vitro Nematotropica 28(1):49–59 Zhao X, Schmitt M, Hawes MC (2000) Species-dependent effects of border cell, root tip exudates on nematode behavior Phytopathology 90:1239–1245 Ali JG, Alborn HT, Stelinski LL (2010) Subterranean herbivore-induced volatiles released by citrus roots upon feeding by Diaprepes abbreviatus recruit entomopathogenic nematodes J Chem Ecol 36(4):361–368 10 Gardener S, Jones JG (1984) A new solidifying agent for culture media which liquefies on cooling J Gen Microbiol 130:731–733 11 Ko MP, Van Gundy SD (1988) An alternative gelling agent for culture and studies of nematodes, bacteria, fungi, and plant tissues J Nematol 20:478–485 12 Wang C, Lower S, Williamson VM (2009) Application of pluronic gel to the study of root-knot nematode behavior Nematology 11:453–464 13 Fudali SL, Wang C, Williamson VM (2013) Ethylene signaling pathway modulates attractiveness of host roots to the root-knot nematode Meloidogyne hapla Mol Plant Microbe Interact 26(1):75–86 14 Atamian HS, Roberts PA, Kaloshian I (2012) High and low throughput screens with root-knot nematodes Meloidogyne spp J Vis Exp doi:10.3791/3629 15 Williamson VM (1998) Root-knot nematode resistance genes in tomato and their potential for future use Annu Rev Phytopathol 36:277–293 Index A Abscission leaf������������������������������������������������������������������������������245 petal�������������������������������������������������������������������� 245, 246 zone����������������������������������������������������������������������������245 ACC (1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid)������������ 3, 27, 41, 59, 103, 192, 224, 254 ACC oxidase (1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid oxidase, ACO)�������������������������3, 47, 59, 224, 225 ACC synthase (1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid synthase, ACS)�������������������������3, 41, 47–59, 166, 167, 224, 225 Aerenchyma����������������������������������������������������������������������237 Agar�������������������������������������� 4, 7, 9, 192, 195, 197, 199, 201, 212, 215, 218, 226, 228–232, 261 Agarose������������������������������4–7, 60, 64, 67, 70, 89, 90, 92–96, 102, 105, 107, 108, 143, 192, 194, 198, 200, 265 Antagonist See Inhibitor Antibody��������������60, 63, 64, 66–68, 105, 108, 110, 114, 128 Aqueous�������������������������������� 22, 90, 106, 108, 114, 116–117, 120–122, 124 Arabidopsis (Arabidopsis thaliana)���������������������������������3–9, 29, 41–44, 59, 60, 63, 67, 75, 87, 88, 94, 103, 104, 109, 113, 115–117, 120–122, 125, 133–139, 142, 143, 163–202, 211–220, 225, 226, 230, 233, 237, 245–251, 262, 267 Assay ACC uptake�����������������������������������������������������������42–45 ACS activity�����������������������������������������������������������59–70 co-immunoprecipitation (co-IP)������������������������101–110 enzyme��������������������������������������������48, 60, 62, 68, 69, 96 ethylene�������������� 101–110, 163–165, 167–169, 171–173, 175–177, 179, 181–184, 186, 187, 189–202 ethylene binding�����������������������������������������������������75–85 kinase�������������������������������63–64, 89, 90, 92–93, 133–139 AUX/IAA������������������������������������������������������������������������191 Auxin������������������������� 165, 180, 183–189, 191, 196, 224–226 AUXIN REGULATED GENE INVOLVED IN ORGAN SIZE (ARGOS)����������������������������� 102, 180, 191 AUXIN RESPONSE TRANSCRIPTION FACTOR (ARF)������������������������������������ 187, 188 B Brassinosteroid��������������������������������������������������������� 165, 254 Breakstrength�����������������������������������������������������������246–249 Buffer activity��������������������������������������������������������������������61, 91 binding������������������������������������������������������������� 49, 52, 79 density-gradient����������������������������������������������������������129 elution���������������������������������� 49, 50, 52, 53, 105, 107, 108 extraction�����������������������������������������61, 64, 66, 69, 90–93 homogenization��������������������������������������76, 79, 105, 106, 116, 117, 120, 122, 124, 128 immunoprecipitation����������������������������������������������������61 kinase�������������������������������������������61–64, 68, 90, 135–138 loading��������������������������� 43, 44, 63–65, 93, 109, 127, 129 lysis��������������������������������������������������������49, 50, 52, 53, 57 MES�������������������������������������� 79, 103, 116, 263, 265, 266 mesophyll cell protoplast (MCP)���������������������������42–45 mild����������������������������������������������������������������������������110 phosphate������������������������������������34, 38, 49, 62, 143, 150 reaction����������������������������������������50, 61–64, 68, 135–137 resuspension���������������������������84, 105–107, 117, 123, 129 solubilization����������������������������������������������������������77, 80 SP����������������������������������������������������������������������� 117, 122 SPK�������������������������������������������������������������������� 121, 127 storage��������������������������������������������������������������������61–63 stringent���������������������������������������������������������������������110 TBS�����������������������������������������������������90, 92, 93, 96, 110 Tris�����������������������61, 62, 84, 90, 124, 143, 263, 265, 266 wash�������������� 50, 52, 53, 61, 64, 67, 91, 92, 105, 107, 110 C Camera������������������������������ 192, 202, 212, 213, 215, 218, 220 cDNA��������������������������������������������������������������� 48, 49, 51, 56 Cell disruption bead beating������������������������������������������������������������������76 French press������������������������������������������������������ 76, 79, 84 Change, conformational������������������������������������������� 142, 147 Chemotaxis�����������������������������������������������������������������������261 Chromophore�������������������������������������������������������������������141 Clamps alligator������������������������������������������������������� 246–249, 251 paddle�����������������������������������������������������������������246–247 Cleavage, proteolytic��������������������������������������������������������134 Cloning������������������������������������������������������������ 56, 60, 68, 75 Closed system��������������������������������������������������������� 30–35, 48 Cofactor, copper���������������������������������������������������������������226 Coleoptile������������������������������������������164, 237, 238, 240, 241 CONSTITUTIVE TRIPLE RESPONSE1 (CTR1)����������88, 102–104, 114, 115, 125, 133–139, 174, 190 Brad M Binder and G Eric Schaller (eds.), Ethylene Signaling: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, vol 1573, DOI 10.1007/978-1-4939-6854-1, © Springer Science+Business Media LLC 2017 269 Ethylene Signaling: Methods and Protocols 270 Index Cytokinin�������������������������4, 5, 8, 88, 165, 167, 174, 178, 254 Cytosol��������������������������������������������������������������� 41, 102, 113 Dark-grown�������������������������������� 4, 8, 41, 109, 197, 211, 212, 226, 231–233, 237 Detergent lysophosphatidyl choline (LPC)������������������������� 103, 105 sulfobetaine-16 (SB-16)�����������������������������������������77, 79 Development������������������������������������ 11, 47, 48, 59, 164, 197, 223, 226, 237, 251, 267 Dextran-polyethylene glycol (PEG)���������������������������������114 Dicot������������������������������������������������������������������������ 164, 196 Dimorphic (heteromorphic)������������������������������������� 254, 255 Dormancy��������������������������������������������������������� 239, 253, 254 Drought����������������������������������������������������������������������������242 ERS1 (ETHYLENE RESPONSE SENSOR1)�����������87, 113, 171 ERS2 (ETHYLENE RESPONSE SENSOR2)�����������87, 113, 172 ETR1 (ETHYLENE RESPONSE1)����������������������87–92, 94–96, 104, 113–115, 121, 128, 142–144, 147, 149, 153, 154, 157, 171, 184, 225 ETR2 (ETHYLENE RESPONSE2)���������������� 87, 113, 115, 125, 171 interactions����������������������������������101–110, 113, 133, 134 isoforms����������������������������������������������������������������������225 subfamilies��������������������������������������������������������������������87 ETHYLENE RESPONSE FACTOR1 (ERF1)��������������������������������������������������� 178, 191 Eudicot See Dicot Exudate�������������������������������������������������������������������� 262, 265 E F Ecotype�������������������������������������������������������������������� 248, 249 Effects, off-target��������������������������������������������� 224–226, 230 EIN3-like (EIL1)��������������������������������������������� 168, 175, 191 Endoparasites�������������������������������������������������������������������261 Epinasty����������������������������������������������������������������������������211 Equilibrium density-gradient centrifugation������������ 114, 115 Escherichia coli������������������������������������������47, 62, 88, 142, 143 ETD-300���������������������������������������������������������������������12, 19 Ethephon�������������������������������������������30, 32–35, 38, 254, 256 Ethylene binding���������28, 29, 87, 88, 101, 113, 147, 169, 178, 225 biosynthesis���������������������������������� 3, 4, 8, 41, 48, 59, 165, 169, 184, 191, 196, 219, 223, 225–233 detection����������� 11–25 (see also Ethylene, measurements) measurements�����������������������������������������������������������3, 13 precursor����������������������������� 3, 27, 41, 103, 108, 191, 192, 195, 196, 231, 254 production�������������������������������� 3, 4, 8, 11, 12, 14, 16–18, 21, 23, 25, 47, 48, 67, 167, 196 signal transduction���������238 (see also Ethylene, signaling) signaling������������������� 41, 59, 88, 102, 109, 114–129, 133, 136, 138, 141–158, 165, 171, 172, 174–176, 178, 179, 181–183, 191, 223, 225–233, 237, 238, 262 trap�������������������������������������������������������������������������48, 81 ETHYLENE INSENSITIVE2 (EIN2)��������������� 88, 102, 114, 115, 133–138, 142–144, 147, 149, 153, 168–170, 173, 174, 177, 180, 262 ETHYLENE INSENSITIVE3 (EIN3)������������������ 88, 134, 168, 170, 175, 176, 183 ETHYLENE INSENSITIVE ROOT1 (EIR1)���������������������������������������������������� 165, 189 Ethylene receptor dimer������������������������������������������������������������������ 101, 124 disulfide�������������������������������������������������������� 88, 101, 124 EIN4 (ETHYLENE INSENSITIVE4)������������ 87, 113, 171, 172 Flower������������������������������������������������������29, 30, 47, 48, 230, 234, 248, 249, 251 Flow system������������������������������������������������ 13, 30–32, 35–37 Force transducer��������������������������������������� 246–247, 249, 251 Fruit, ripening����������������������������������������������������������������������3 Fungi��������������������������������������������������������������������������������261 Fusion protein�������������������������������������������� 57, 88, 90–94, 97 D G Gas chromatography (GC)���������������������������������� 3–9, 11, 37, 55, 61, 66, 67 Gaseous�������������������������������������� 27–36, 77, 84, 85, 191, 225, 226, 228, 229, 232, 233 Germination������������3, 47, 184, 195, 196, 201, 202, 215, 229, 239–242, 253–258, 267 Gibberellin�����������������������������������������������������������������������254 Glutathione-S-transferase (GST)�������������� 76, 84, 88–95, 97 Growth����������������������������������������� 3, 6, 11, 21, 29, 41, 47, 48, 59, 75, 76, 82, 84, 88–91, 93–95, 103–106, 109, 115–116, 119, 120, 122, 126, 163, 164, 191, 195, 196, 199, 201, 211–220, 223, 226–231, 237–242, 248, 255, 263, 265, 266 H Halophyte�����������������������������������������������������������������253–258 Headspace������������������������������������������������������4–8, 12, 13, 16, 21, 23–25, 66 Heterologous�������������������������������������������������������� 88, 89, 142 Hook, apical����������������������������������������������������� 164, 167, 211 HOOKLESS1 (HLS1)������������������������������������ 165, 181, 188 Hormone�������������������������������������� 3, 11, 27, 42, 75, 136, 138, 164, 165, 196, 238, 254 Hypocotyl�������������������������������������������88, 164–166, 168, 172, 176–178, 180–182, 186, 188–190, 196, 201, 211, 212, 216, 229, 231 Hyponasty������������������������������������������������������������������������211 Ethylene Signaling: Methods and Protocols 271 Index I ImageJ������������������������������������������������������ 195, 216, 220, 232 Imaging, time-lapse���������������������������������� 211–213, 215–220 Inhibitor competitive��������������������������������������29, 35, 196, 225, 242 ethylene biosynthesis 2-aminoisobutyric acid�������������������������������������������48 aminooxyacetic acid�������������������������������� 48, 225, 257 2-aminooxyisobutyric acid��������������������������������������48 AVG (2-aminoethoxyvinyl glycine)���������������������196, 224–226, 232 1,1-dimethyl-4-(phenylsulfonyl)semicarbazide��������48 2,4-pyridinedicarboxylic acid����������������������������������48 ethylene receptor 1-MCP (1-methylcyclopropene; MCP)����������������29, 30, 32, 34–35, 38, 196, 225 2,5-NBD (2,5-norbornadiene; norbornadiene)�������������������������������������������32, 35 silver������������������������������������������������������������� 196, 225 silver nitrate�������������������������������������������������� 196, 225 silver thiosulfate�������������������������������������������� 196, 225 trans-cyclooctene (TCO)��������������������������������������225 light-sensitive�������������������������������������������������������������226 Instron stress analyzer������������������������������������������������������246 Interactions, protein����������������������������������������� 102, 141–158 Internode��������������������������������������������������������������������������237 In vitro�����������������������������������47, 59, 67–69, 87–89, 133–137 In vivo���������������������������������������������������������������������������������59 J Juvenile����������������������������������������������������� 261, 262, 264–267 K Kinase calcium-dependent protein (CPK)�������������������������������60 histidine�������������������������������������������������� 87–97, 101, 121 mitogen-activated protein (MAPK)��������������������� 60, 168 Raf-like������������������������������������������88, 102–104, 114, 115 serine/threonine������������������������������������������������������������87 Kinetics, growth��������������������������������������� 211–213, 215–220 L Ligand�������������������������������������������������������� 75, 142, 147, 154 LMN-meter (Love me not meter; breakstrength meter)��������������������������������������������� 245–249, 251 Localization�����������������������������������������87, 104, 114–129, 134 M Measurements, real-time����������������������������������������������12, 23 Media dropout�������������������������������������������������������������������������91 galactose/raffinose��������������������������������������������������������95 LB���������������������������������������������������������49, 51, 52, 60, 62 liquid���������������������������������������������������� 78, 103, 105, 116 minimal������������������������������������������������������������������������91 Murashige and Skoog (MS)�����������������������������������4, 191 plant growth����������������������������������������������� 116, 226–227 Purafil Select����������������������������������������������������������37, 38 SOC�����������������������������������������������������������������������������60 yeast growth������������������������������������������������������������82, 90 Medium See Media Meloidogyne hapla (M hapla)���������������������������� 262, 266, 267 Membrane endoplasmic reticulum�������������������������� 42, 104, 114–129 plasma������������������������������ 41, 42, 109, 114, 121, 122, 128 Mercuric perchlorate���������������������������76–78, 80–83, 85, 242 Mesophyll���������������������������������������������������������������������42–44 Micromanipulator�������������������������������������������� 246–247, 249 Microscopy scanning electron��������������������������������������������������������245 transmission electron��������������������������������������������������245 Microsome������������������������ 102, 115, 120, 121, 123, 127, 129 Monocot������������������������������������������������������������������� 164, 212 Mutant constitutive������������������������������������������� 61, 125, 133, 165 ethylene-insensitive (ethylene resistant)��������������������165, 197, 198, 241 ethylene-response��������������������������������������� 125, 193, 238 etr1-1��������������������������� 164, 165, 168, 170, 171, 182, 199 mhz�����������������������������������������������������������������������������238 screen (genetic screen)���������������������������������� 41, 165, 191 N Nematode (root-knot nematode; RKN)�������������������261–267 Nucleus��������������������������������������������������������������������� 134, 136 Nutation���������������������������������������������������������������������������211 O Olefin���������������������������������������������������������������������������������75 Osmotic effect������������������������������������������������������������������253 Overproducer, ethylene����������������������������� 165, 167, 190, 262 P Parasite, obligate����������������������������������������������� 261, 262, 266 Pathogen�����������������������������������������������������������������������4, 266 Pathway�������������������������������47, 59, 60, 70, 88, 114, 133, 134, 142, 144–147, 165, 224, 237 [γ-32P] ATP����������������������������������������������61, 63, 65, 69, 134, 135, 137, 139 PCR����������������������������������������������������51, 56, 60–62, 68, 137 Pea������������������������������������������������������������������������������ 75, 163 Petal detachment���������������������������������������������� 245–249, 251 Phosphorylation���������������������������������������������������� 59, 89, 94, 96, 134, 138 Pichia pastoris (see Yeast) Pluronic gel (Pluronic F-127; PF-127)��������������������261–267 Primers��������������������������������������������������48, 49, 51, 60, 62, 68 Ethylene Signaling: Methods and Protocols 272 Index Protein endogenous������������������������������������������� 60, 63, 67–68, 70 expression������������������������������������������49, 51–52, 108, 143 membrane�������������������������������������42, 101–103, 105–107, 109, 120, 123, 127 recombinant���������������������������������61–62, 68, 69, 142, 149 soluble������������������������������������������102, 106, 120, 127, 129 stability����������������������������������������������������������� 3, 142, 151 Protein-A�������������������������� 60, 64, 67, 70, 102, 104, 108–110 Protoplast��������������������������������������������������������������� 41–44, 63 Purification, affinity�����������������������������������88, 89, 92, 94, 102 R Radioligand������������������������������������������������������������������������75 Random coil���������������������������������������������������������������������141 Response submergence���������������������������������������������������������������237 triple���������������������������������������������41, 133–139, 163–165, 167–184, 186, 187, 189–202, 237 Rice������������������������������������������������������������������ 164, 237–242 Root��������������������������������� 88, 106, 120, 122, 126, 164–166, 168, 169, 172, 173, 178, 181, 182, 184–191, 194–196, 199–201, 211, 212, 229, 230, 237, 238, 240–242, 261–268 RTE1��������������������������������������������������������������� 102, 173, 174 S Saccharomyces cerevisiae (see yeast) S-adenosyl methionine (SAM)���������������������3, 41, 59, 61, 66 Schizosaccharomyces pombe (see Yeast) Seawater���������������������������������������������������������������������������253 Seed germination������������������� 47, 195, 215, 239–242, 253–258 sterilization�������������������������� 103, 115, 192, 193, 196, 198 stratification�������������������������������������������������������� 195, 229 Seedling dark-grown������������ 4, 8, 41, 197, 211, 226, 231–233, 237 etiolated���������������������238 (see also Seedling, dark-grown) growth�������������������������������������������47, 229, 230, 239–241 triple response (see Response, triple) Senescence������������������������������������������������������ 29, 47, 48, 223 Signaling complex�������������������������������������������� 104, 114–129 Soil�����������������������������������������������������������115, 120, 122, 198, 253–255, 261 Solanum lycopersicum (see Tomato) Spectra���������������������������������������������� 141, 144–147, 151–157 Spectroscopy circular dichroism (CD)�������������������������������������141–158 fluorescence��������������������������������������������������������141–158 laser-based photo-acoustic��������������������������������������������11 Stop-flow���������������������������������������������� 12–14, 17–20, 23–25 Stress abiotic�������������������������������������������������������������������������223 biotic���������������������������������������������������������������������������223 drought���������������������������������������������������������������������������4 flooding��������������������������������������������������������������������������4 herbivore�������������������������������������������������������������������������4 NaCl (see Stress, salt) pathogen�������������������������������������������������������������������������4 salinity (see Stress, salt) salt���������������������������������������������������������� 49, 50, 253–258 temperature���������������������������������������������������������������������4 Structure α-helix������������������������������������������������������������������������141 protein����������������������������������������������������������������141–158 secondary�������������������������������������������� 141, 142, 144–147 β-sheet������������������������������������������������������������������������141 Suaeda salsa�����������������������������������������������������������������������254 Subfunctionalization�����������������������������������������������������������88 Substrate������������������������������ 21, 42, 63, 65, 67, 134–138, 142 T Tandem affinity purification (TAP)��������� 102–105, 108–110 TAR���������������������������������������������������������������������������������191 Tomato (Solanum lycopersicum)����������4, 28, 60, 264, 266, 267 Transgenic�������������������������������������� 63, 67, 88, 169, 172, 174, 196, 212, 226, 238 Transporter amino acid��������������������������������������������������������������������41 LYSINE HISTIDINE TRANSPORTER1 (LHT1)���������������������������������������������������� 41, 184 Tryptophan����������������������������������������142, 147–150, 156, 157 Two-phase partitioning��������������������������������������������114–129 V Volatile������������������������������������������������������������������� 11, 32, 35 Voltmeter (multimeter)������������������������������������� 246–247, 249 W WEI2 (WEAK ETHYLENE INSENSITIVE2)����������������������������������� 184, 191 Y Yeast���������������������������� 49, 75, 76, 78–79, 81–84, 88–96, 183 YUC (YUCCA)����������������������������������������������� 185, 186, 191 ... alternative Brad M Binder and G Eric Schaller (eds.), Ethylene Signaling: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, vol 1573, DOI 10.1007/978-1-4939-6854-1_2, © Springer Science+Business Media... resolved The protocols are intended for both experienced and beginning researchers, for those with prior experience in the study of ethylene signaling, and for those just entering this exciting research... Protein Structure and Protein–Protein Interactions in Ethylene Signaling 141 Mareike Kessenbrock and Georg Groth Part III Analysis of Ethylene Responses 13 The Triple Response Assay and