IX.3.8 Áp dụng công nghệ sinh học trong sản xuất sinh phẩm chẩn đoán dư lượng kháng sinh 2Công nghệ sắc ký miễn dịch (Lateral flow rapid test): sắc ký miễn dịch hay miễn dịch nhanh có ưu điểm là không đòi hỏi thiết bị; cho kết quả nhanh và giá thành vừa phải, vì thế nên thị trường lớn, có nhiều hãng sản xuất tham gia với nhiều sản phẩm chất lượng khác nhau, cạnh tranh cao. Tuy nhiên điểm cần lưu ý là phương pháp này cần phải kiểm soát chặt chẻ về độ nhạy cũng như độ đặc hiệu.Khuếch đại nucleic acid (nucleic acid amplification): có thể áp dụng trong nhiều lĩnh vực với ưu điểm là độ nhạy và tính đặc hiệu cao nên có tiềm năng thị trường lớn. Tuy nhiên, phương pháp này đòi hỏi thiết bị, quy trình kiểm soát chất lượng và tay nghề cao vì thế phần nào hạn chế phạm vi ứng dụng thực tế. Xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme (ELISA Enzyme linked Immuno Sorbent Assay): dùng kỹ thuật sinh hóa để phát hiện kháng thể hay kháng nguyên trong mẫu cần phân tích, hiện được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như y học, nông nghiệp và đặc biệt trong các quy trình kiểm tra an toàn chất lượng các sản phẩm thực phẩm. Thị trường tiềm năng hiện nay của phương pháp này là lĩnh vực kiểm soát dư lượng trong thủy sản, thực phẩm; bệnh nhiệt đới… ELISA có rất nhiều dạng, đặc điểm chung là đều dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, trong đó kháng thể được gắn với một enzyme. Phương pháp ELISA có ưu điểm nhanh; thao tác đơn giản, dễ thực hiện; không đòi hỏi thiết bị đắt tiền; không cần nhân viên chuyên môn cao; chi phí kiểm mẫu thấp do có thể kiểm đồng thời số lượng mẫu lớn; một bộ kit có thể phân tích được 5080 mẫu. Tuy nhiên, nhược điểm do đây là sinh phẩm nên một số hóa chất phải bảo quản lạnh và có hạn sử dụng nhất định; độ chính xác không cao bằng các phương pháp hóa lý như phương pháp sắc ký vì thế chỉ thích hợp với các phân tính sàng lọc hơn là các phân tích định lượng.IX.4 Chỉ tiêu Listeria monocytogenesBài báo cáo sẽ sử dụng phương pháp để phân tích chỉ tiêu Listeria monocytogenes theo QCVN 55:2010BYT là tiêu chuẩn sau:TCVN 77002:2007 (ISO 112902:1998) VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM VÀ THỨC ĂN CHĂN NUÔI – PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG LISTERIA MONOCYTOGENES – PHẦN 2: PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG.Định lượng Listeria monocytogenes (Enumeration of Listeria monocytogenes) là xác định số lượng đơn vị hình thành khuẩn lạc (CFU) Listeria monocytogenes có trong một lượng xác định của sản phẩm, khi tiến hành thử theo tiêu chuẩn này.IX.4.1 Nguyên tắcTrong giới hạn của tiêu chuẩn này thì việc phát hiện định lượng L. monocytogenes cần đến ít nhất sáu giai đoạn liên tiếp.1. Chuẩn bị huyền phù ban đầu trong mỗi dịch pha loãng qui định.2. Hồi phục trong 1 giờ ở 20 °C.3. Cấy lên bề mặt đĩa một lượng xác định của mẫu thử dạng lỏng hoặc của huyền phù ban đầu nếu sản phẩm dạng khác, trên môi trường nuôi cấy chọn lọc đặc đựng trong hai đĩa Petri.Chuẩn bị các đĩa khác, sử dụng các dung dịch pha loãng thập phân từ mẫu thử hoặc từ huyền phù ban đầu, trong cùng điều kiện.4. Ủ các đĩa này ở 37 °C và kiểm tra sau 24 giờ hoặc 48 giờ.5. Khẳng định các khuẩn lạc Listeria monocytogenes giả định bằng các phép thử qui định.6. Từ số lượng khuẩn lạc đã khẳng định, tính số lượng Listeria monocytogenes có trong một gam hoặc một mililit mẫu thử.IX.4.2 Môi trường nuôi cấy và thuốc thửĐược trình bày trong Phụ lục 2 của bài báo cáo, cũng là Phụ lục B của TCVN 77002:2007IX.4.3 Thiết bị và dụng cụ thủy tinhSử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm vi sinh thông thường xem TCVN 6404 (ISO 7218) và cụ thể như sau:Dụng cụ, thiết bịMô tảThiết bị để khử trùng khô (tủ sấy) hoặc thiết bị để khử trùng ướt (nồi hấp áp lực)Tủ sấy hoặc tủ ấmduy trì nhiệt độ từ 25 °C ± 1 °C đến 50 °C ± 1 °C.Tủ ấmcó thể duy trì môi trường, các đĩa và các ống nghiệm trong dải nhiệt độ sau:a) ở 20 °C ± 1°C (tùy chọn);b) ở 25 °C + 1°C (tùy chọn);c) 37°C ± 1°C.Nồi cách thuỷcó thể duy trì nhiệt độ ở 44 °C đến 47 °CQue cấy vòng hoặc que cấyhoặc pipet Pasteur hoặc que cấy vòng sử dụng một lần.Que dàn mẫu vô trùngbằng thủy tinh hoặc bằng chất dẻo.Máy đo pHcó thể đọc chính xác đến 0.01 đơn vị pH ở nhiệt độ 25 °C và có thể đo chính xác đến 0.1 đơn vị pH.Ống nghiệm hoặc bình cầucó dung tích thích hợp, để khử trùng và bảo quản môi trường nuôi cấy và nuôi ấm môi trường lỏng.Pipet chia độ xả hếtdung tích danh định 1 ml và 10 ml, được chia vạch tương ứng là 0,1 ml và 0,5 ml.Đĩa Petriđường kính 90 mm và 140 mm.Bìnhthích hợp cho việc ủ trong môi trường vi hiếu khí (tuỳ chọn).Hỗn hợp khí(tuỳ chọn), có thành phần qui định dùng để ủ vi hiếu khí:hàm lượng CO2 từ 5 % đến 12%, O2 từ 5 % đến 15 % và N2 đến 100 %Thiết bị dùng cho phép thử rọi HenryKính hiển vi,tốt nhất là loại phản pha, có thêm lam kính và lamen (coverslip).IX.4.4 Lấy mẫuViệc lấy mẫu không qui định trong tiêu chuẩn này. Nếu không có tiêu chuẩn riêng về lấy mẫu sản phẩm có liên quan thì các bên tự thoả thuận về vấn đề này.Điều quan trọng là mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải đúng là mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc bị biến đổi trong suốt quá trình vận chuyển và bảo quản xem TCVN 6404 (ISO 7218).
2016 GVHD: Thầy Ngô Duy Anh Triết [Company name] SVTH: Ngô Nguyễn Nhật Hà MSSV: 2022130141 SẢN PHẨM SỮA CHUA GVHD: Thầy Ngô Duy Anh Triết BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TPHCM KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM ĐỒ ÁN MÔN HỌC PHÂN TÍCH THỰC PHẨM GVHD: Thầy Ngô Duy Anh Triết SVTH: Ngô Nguyễn Nhật Hà MSSV: 2022130141 Lớp: 04DHDB2 TPHCM, 6/2016 SVTH: NGÔ NGUYỄN NHẬT HÀ SẢN PHẨM SỮA CHUA GVHD: Thầy Ngô Duy Anh Triết Mục lục Danh mục hình .4 Danh mục bảng Danh mục biểu đồ Lời cảm ơn Nhận xét giáo viên Lời mở đầu .7 Nội dung báo cáo I Tổng quan sữa lên men II Khái niệm sữa lên men .8 III Phân loại sữa lên men IV Tên sản phẩm sữa lên men .9 V Lợi ích sữa chua.[3] 10 V.1 Giúp giảm kích thước vòng eo .10 V.2 Có nhiều vi khuẩn có ích tốt cho đường ruột 10 V.3 Chứa nhiều vitamin 10 V.4 Khôi phục sức khỏe nhanh 10 V.5 Ngăn ngừa bệnh cao huyết áp .11 V.6 Chữa cảm lạnh 11 V.7 Bảo vệ miệng 11 VI Tình hình tiêu thụ sữa chua thương hiệu sữa chua thị trường Việt Nam 12 VI.1 Sữa chua Vinamilk 13 VI.2 Các thương hiệu sữa chua khác thị trường Việt Nam 17 VII Thành phần 17 SVTH: NGÔ NGUYỄN NHẬT HÀ SẢN PHẨM SỮA CHUA GVHD: Thầy Ngô Duy Anh Triết VIII Quy định kỹ thuật 18 VIII.1 Các tiêu liên quan đến an toàn thực phẩm sản phẩm sữa lên men 18 VIII.2 Các tiêu Cảm quan 18 VIII.3 Các tiêu lý hoá sản phẩm sữa lên men 19 VIII.4 Giới hạn chất nhiễm bẩn sản phẩm sữa lên men: 19 VIII.5 Chỉ tiêu vi sinh vật sản phẩm sữa lên men 29 VIII.6 Phụ gia thực phẩm 30 VIII.7 Chất nhiễm bẩn 31 VIII.8 Vệ sinh 31 IX CÁC PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA MỘT SỐ CHỈ TIÊU CỦA SẢN PHẨM 31 IX.1 Phương pháp lấy mẫu 31 IX.2 Hàm lượng protein sữa sản phẩm sữa lên men không qua xử lý nhiệt 38 IX.3 Dư lượng thuốc thú y 44 IX.4 Chỉ tiêu Listeria monocytogenes 52 Phụ lục 64 Phụ lục 67 Phụ lục 79 Tài liệu tham khảo .87 SVTH: NGÔ NGUYỄN NHẬT HÀ SẢN PHẨM SỮA CHUA GVHD: Thầy Ngô Duy Anh Triết Danh mục hình Figure 1: Thị trường sữa chua Việt Nam 12 Figure 2: Sữa chua Ba Vì 17 Figure 3: Sữa chua Kinh Đô 17 Figure 4: Sữa chua TH true YOGURT 17 Figure 5: Bộ khuấy trộn (dạng pittông) dùng để trộn bình xô 33 Figure 6: - Bộ khuấy trộn thích hợp (dạng pittông) dùng để trộn xitec vận chuyển đường bộ, đường sắt xitec nông trại 34 Figure 7: Gáo lấy mẫu dạng lỏng 34 Figure 8: Kit dùng phương pháp sắc ký miễn dịch 51 Figure 9: Khuếch đại nuleic acid 52 Figure 10: Cấy diễn giải đĩa thử CAMP 59 Danh mục bảng Table Bảo quản mẫu, nhiệt độ bảo quản cỡ mẫu tối thiểu 38 Table 2Các phản ứng nhận dạng Listeria spp 60 Danh mục biểu đồ Biểu đồ 1: cấu trúc thị trường sản phẩm sữa theo giá trị năm 2013 12 Biểu đồ 2: Doanh số sữa chua ăn công ty Vinamilk qua năm 14 Biểu đồ 3: Phát triển đăng ký SC phân tích DLKS thủy sản, thực phẩm .45 Biểu đồ 4: Các phương pháp nghiên cứu phân tích DLKS phổ biến theo IPC .46 SVTH: NGÔ NGUYỄN NHẬT HÀ SẢN PHẨM SỮA CHUA GVHD: Thầy Ngô Duy Anh Triết Lời cảm ơn Em xin chân thành cảm ơn Thầy Ngô Duy Anh Triết – người trực tiếp hướng dẫn em việc định hướng làm đề tài, cung cấp tài liệu tham khảo, nhận xét, góp ý… suốt trình thực đề tài Ngoài ra, em xin gửi lời cảm ơn đến bạn nhóm đồ án chia sẻ thông tin có nhiều đóng góp giúp em hoàn thành đề tài Đề tài thực nhiều hạn chế thiếu sót, em mong nhận đóng góp ý kiến quý thầy cô bạn để đề tài tốt TP Hồ Chí Minh, ngày 31 tháng 05 năm 2016 SVTH: Ngô Nguyễn Nhật Hà SVTH: NGÔ NGUYỄN NHẬT HÀ SẢN PHẨM SỮA CHUA GVHD: Thầy Ngô Duy Anh Triết Nhận xét giáo viên SVTH: NGÔ NGUYỄN NHẬT HÀ SẢN PHẨM SỮA CHUA GVHD: Thầy Ngô Duy Anh Triết Lời mở đầu Khi nói đến số thực phẩm có giá trị dinh dưỡng quý giá cho sức khỏe người tiêu dùng ta phải kể đến sữa chua Sữa chua giàu dinh dưỡng, giúp giảm stress, tăng cường hệ miễn dịch, chống lão hóa, tăng cường tuổi thọ thực phẩm làm đẹp thiếu cho phái nữ …Sữa chua biết đến nhiều sản phẩm thực phẩm hiệu vai trò tăng cường hoạt động hệ tiêu hóa Để đáp ứng nhu cầu canxi cho thể thông qua uống sữa ngày ta có nhiều lựa chọn sữa chua biện pháp hiệu Hiện nay, sữa chua chiếm lĩnh thị trường tiêu thụ rộng lớn khắp giới, người tiêu dùng yêu thích sản phẩm không giá trị dinh dưỡng mà ưu điểm giá thành rẻ, thông dụng, dễ tiêu dùng đặc biệt hương vị đặc trưng mà vi sinh vật lên men lactic sữa mang lại cho sữa chua Với lợi ích dinh dưỡng giá trị kinh tế to lớn mà sữa chua đem lại, sữa chua trở thành đề tài nghiên cứu đáng quan tâm Và đồng ý giáo viên hướng dẫn em định chọn sữa chua làm đề tài cho đồ án Phân tích thực phẩm SVTH: NGÔ NGUYỄN NHẬT HÀ SẢN PHẨM SỮA CHUA GVHD: Thầy Ngô Duy Anh Triết Nội dung báo cáo I Tổng quan sữa lên men Các tài liệu tham khảo mục I Tổng quan sữa lên men QCVN 5-5:2010/BYT: quy chuẩn kỹ thuật quốc gia sản phẩm sữa lên men TCVN 7030:2009: sữa lên men II Khái niệm sữa lên men Theo mục I.3 QCVN 5-5:2010/BYT: Sữa lên men sản phẩm sữa chế biến cách lên men sữa sản phẩm thu từ sữa có không thay đổi thành phần quy định, tác động vi sinh vật thích hợp làm giảm pH, có đông tụ Sữa lên men có hương vị sản phẩm sữa lên men, có chứa tối đa 50 % khối lượng thành phần không từ sữa (như chất tạo có giá trị dinh dưỡng giá trị dinh dưỡng, loại rau quả, nước quả, nghiền, thịt quả, chất pha chế mứt chúng, đậu đỗ, mật ong, socola, hạch, cà phê, gia vị loại thực phẩm tạo hương tự nhiên không gây hại khác) và/hoặc chất tạo hương Các thành phần không từ sữa trộn lẫn trước sau lên men Theo mục 2.1 TCVN 7030:2009: Sữa lên men sản phẩm sữa thu cách lên men sữa, chế biến từ sản phẩm thu từ sữa có không thay đổi thành phần giới hạn 3.3*, tác động vi sinh vật thích hợp làm giảm pH có đông tụ (kết tủa đẳng điện) Các vi sinh vật gốc phải vi sinh vật sống, hoạt động có nhiều sản phẩm đến thời hạn sử dụng tối thiểu Nếu sản phẩm sau lên men xử lý nhiệt yêu cầu vi sinh vật sống Khái niệm sữa lên men QCVN 5-5:2010/BYT TCVN 7030:2009 giống Ở TCVN 7030:2009 có quy định thêm việc: * : mục 3.3 TCVN 7030:2009 trình bày thành phần sữa lên men trình bày mục báo cáo SVTH: NGÔ NGUYỄN NHẬT HÀ SẢN PHẨM SỮA CHUA GVHD: Thầy Ngô Duy Anh Triết Nếu sản phẩm sau lên men không xử lý nhiệt vi sinh vật gốc làm giảm pH sản phẩm phải sống hoạt động đến thời hạn sử dụng tối thiểu sản phẩm Nếu sản phẩm sau lên men có xử lý nhiệt yêu cầu điều III Phân loại sữa lên men Bài báo cáo cáo phân loại sữa lên men dựa TCVN 7030:2009 Các sản phẩm sữa lên men cụ thể đặc trưng chủng gốc đặc thù dùng để lên men sau: Sữa chua (Yoghurt): Các chủng cộng sinh Streptococcus thermophilus Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus Sữa chua dùng chủng thay (Alternate Culture Yoghurt): Các chủng Streptococcus thermophilus loài Lactobacillus Sữa lên men acidophilus (Acidophilus Milk): Lactobacillus acidophilus Kefir (Kefir): Chủng gốc chuẩn bị từ hạt kefir, Lactobacillus kefiri, loài giống Leuconostoc, Lactococcus Acetobacter phát triển mối quan hệ mật thiết Các hạt Kefir tạo thành nấm men có lên men lactoza (Kluyveromyces marxianus) nấm men không lên men lactoza (Saccharomyces unisporus, Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces exiguus) Kumys (Kumys): Các chủng Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus Kluyveromyces marxianus Có thể bổ sung thêm vi sinh vật khác với chủng gốc IV Tên sản phẩm sữa lên men Theo mục 7.1.1 TCVN 7030:2009: Tên sản phẩm phải sữa lên men sữa lên men đậm đặc Tuy nhiên, tên gọi thay sữa chua Yoghurt, Acidophilus Milk, Kefir, Kumys, Stragisto, Labneh, Ymer Ylette với điều kiện sản phẩm tuân theo điều khoản cụ thể tiêu chuẩn Yoghurt đánh vần phù hợp với nước bán sản phẩm SVTH: NGÔ NGUYỄN NHẬT HÀ SẢN PHẨM SỮA CHUA GVHD: Thầy Ngô Duy Anh Triết B.6.1.1 Thành phần Dịch thuỷ phân mô động vật enzym 15 g Dịch thuỷ phân gan enzym 2,5 g Cao men 5g Natri clorua (NaCl) 5g Thạch g đến 18 g 1) Nước 000 ml 1) Tùy thuộc vào sức đông thạch B.6.1.2 Chuẩn bị Hoà tan thành phần môi trường hoàn chỉnh khô nước cách đun sôi Chỉnh pH, cho sau khử trùng 7,2 ± 0,2 25 °c, cần Phân phối môi trường vào bình có dung tích thích hợp để có lượng cần thiết cho phép thử Khử trùng 15 phút nỗi hấp áp lực nhiệt độ 121 °C B.6.2 Môi trường hoàn chỉnh B.6.2.1 Thành phần Môi trường (B.6.1) 100 ml Huyết cừu khử fibrin ml đến ml B.6.2.2 Chuẩn bị Cho huyết cừu vào môi trường làm nguội đến 47 °C Trộn Phân phối môi trường vào đĩa Petri vô trùng với lượng thích hợp cho phép thử Để yên cho đông đặc B.7 Canh thang sử dụng cacbohydrat (ramnoza xyloza) SVTH: NGÔ NGUYỄN NHẬT HÀ 74 SẢN PHẨM SỮA CHUA GVHD: Thầy Ngô Duy Anh Triết B.7.1 Môi trường B.7.1.1 Thành phần Dịch thủy phân mô động vật enzym 10 g Cao thịt 1g Natri clorua (NaCl) 5g Bromocresol tía 0,02 g Nước 000 ml B.7.1.2 Chuẩn bị Hoà tan thành phần nước cách đun nóng, cần Chỉnh pH, cho sau khử trùng 6,8 0,2 25 °C, cần Phân phối môi trường vào ống nghiệm có dung tích thích hợp để có lượng cần thiết cho phép thử Khử trùng 15 phút nồi hấp áp lực nhiệt độ 121 °C B.7.2 Dung dịch hydrat cacbon B.7.2.1 Thành phần Hydrat cacbon 1) 5g Nước 100 ml 1) L-Ramnosa D-xylosa B.7.2.2 Chuẩn bị Hòa tan riêng rẽ hydrat cacbon vào 100 ml nước Lọc để khử trùng B.7.3 Môi trường hoàn chỉnh SVTH: NGÔ NGUYỄN NHẬT HÀ 75 SẢN PHẨM SỮA CHUA GVHD: Thầy Ngô Duy Anh Triết Đối với loại hydrat cacbon, thêm xml dung dịch B.7.2 vào 9x ml môi trường B.8 Môi trường thạch di động B.8.1 Thành phần Dịch thuỷ phân casein enzym 20,0 g Dịch thuỷ phân mô động vật enzym 6,1 g Thạch 3,5 g Nước 000 ml B.8.2 Chuẩn bị Hoà tan thành phần nước cách đun sôi Chỉnh pH, cho sau khử trùng 7,3 ± 0,2 25 °C, cần Phân phối môi trường với lượng ml vào ống nghiệm Khử trùng 15 phút nồi hấp áp lực nhiệt độ 121 °C B.9 Môi trường CAMP (Christie, Atkins, Munch-Paterson) chủng xét nghiệm Đối với phép thử sử dụng đĩa thạch huyết cừu, tốt sử dụng đĩa thạch hai lớp có lớp môi trường huyết cừu mỏng B.9.1 Môi trường Xem B.6.1 B.9.2 Môi trưởng huyết cừu Xem B.6.2 B.9.3 Môi trường hoàn chỉnh Phân phối môi trường (B.9.1) vào đĩa Petri vô trùng, với lượng khoảng 12 ml cho đĩa Petri đường kính 90 mm, để yên cho đông đặc Rót lớp mỏng môi trường huyết cừu (B.9.2) với lượng không lớn ml đĩa Để yên cho đông đặc SVTH: NGÔ NGUYỄN NHẬT HÀ 76 SẢN PHẨM SỮA CHUA GVHD: Thầy Ngô Duy Anh Triết Nếu cho môi trường huyết cừu vào đĩa môi trường chuẩn bị trước, phải làm ấm đĩa 20 phút cách đặt chúng vào tủ ấm để 37 °C trước rót lớp môi trường huyết cừu B.9.4 Các chủng phản ứng CAMP Chủng phân giải huyết S.aureus (ví dụ: NCTC 1803 ATCC 25923), chủng R.equi (ví dụ: NCTC 1621 ATCC 6939) chủng L monocytogenes (ví dụ: NCTC 11994) cần phải qua phép thử CAMP Không phải tất chủng S aureus chủng L monocytogenes thích hợp phép thử CAMP Bảo quản chất cấy gốc S aureus, R equi, L monocytogenes, L innocua L ivanivii cách nuôi cấy lên môi trường TSVEA (B.4) đổ nghiêng, nuôi ấm 37°C từ 24 đến 28 giờ, thấy mọc bảo quản tủ lạnh +3 °C ± °C Cấy truyền lần tháng khẳng định độ khiết chúng cách ria cấy lên đĩa thạch TSYEA (B.4) B.10 Dung dịch hydro peroxit Sử dụng dung dịch % (m/m) B.11 Dung dịch muối đệm phosphat (PBS) (tùy chọn) B.11.1 Thành phần Dinatri hydro phosphat ngậm hai phân tử nước 8,98 g (Na2HPO4.2H2O) Natri dihydro phosphat (NaH2PO4) 2,71 g Natri clorua (NaCl) 8,5 g Nước 000 ml B.11.2 Chuẩn bị Hoà tan thành phần nước Chỉnh pH, cho sau khử trùng 7.2 ± 0,2 25 °C, cần Khử trùng 15 phút nồi hấp áp lực nhiệt độ 121 °C SVTH: NGÔ NGUYỄN NHẬT HÀ 77 SẢN PHẨM SỮA CHUA GVHD: Thầy Ngô Duy Anh Triết B.12 Huyền phù huyết cầu cừu (tùy chọn) Giữ tế bào huyết cừu +3 °C ± °C truớc sử dụng Trước sử dụng phải kiểm tra dấu hiệu phân giải huyết (bị đỏ) lớp huyết phía Nếu không phân giải huyết, lấy ml lớp tế bào đỏ phía cho vào 98 ml dung dịch đệm PBS (B.11) Nếu thấy xuất phân giải huyết, hòa khoảng ml lớp tế bào đỏ 10 ml dung dịch đệm PBS trộn nhẹ, ly tâm Nếu thấy có lớp phía màu đỏ chứng tỏ có phân giải huyết, không sử dụng loại bỏ huyền phù gốc Nếu không gạn lớp phía cho ml huyền phù tế bào vào 98 ml dung dịch đệm PBS Bảo quản huyền phù đến ngày +3 °C ± °C Nếu thấy xuất phân giải huyết loại bỏ SVTH: NGÔ NGUYỄN NHẬT HÀ 78 SẢN PHẨM SỮA CHUA GVHD: Thầy Ngô Duy Anh Triết Phụ lục (Thành phần cách chuẩn bị môi trường thuốc thử cho phương pháp phát dư lượng thuốc thú y Benzylpenicilin) Trình bày dựa TCVN 8106:2009 Vi sinh vật thử nghiệm, môi trường nuôi cấy, dung dịch chuẩn mẫu kiểm chứng Chỉ sử dụng thuốc thử tinh khiết phân tích nước cất nước loại khoáng nước có độ tinh khiết tương đương, trừ có quy định khác 5.1 Vi sinh vật thử nghiệm Dùng huyền phù Geobacillus stearothermophilus ATCC 10149 (tương tự chủng C953 NIZO)1) , điều chỉnh để đếm khoảng 000 000 đơn vị hình thành khuẩn lạc mililit Kiểm tra chất lượng mẻ huyền phù vi sinh vật cách xác định độ nhạy dung dịch chuẩn nêu Bảng Bảng - Các dung dịch chuẩn dùng để thử độ nhạy huyền phù vi sinh vật thử nghiệm Dung dịch chuẩn Hàm lượng sữa µg/kg Benzylpenicillin (Xenixillin-G) Sulfadiazine 150 Neomycin 30 Erythromycin 10 Oxytetracycline 100 1) Huyền phù Geobacillus stearothermophilus ATCC 10149 chủng C953 NIZO ví dụ sản phẩm có bán sẵn Thông tin đưa tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn này, ISO không ấn định phải sử dụng sản phẩm SVTH: NGÔ NGUYỄN NHẬT HÀ 79 SẢN PHẨM SỮA CHUA GVHD: Thầy Ngô Duy Anh Triết Tiến hành kiểm tra với dung dịch chuẩn sữa kiểm chứng lần theo quy trình mô tả Điều Xác định độ nhạy huyền phù vi sinh vật thử nghiệm benzylpenicillin oxytetracycline với ống A (5.2.5) độ nhạy sulfadiazine, neomycin erythromycin với ống B (5.2.6) Tất ống nghiệm phải thu kết dương tính 5.2 Môi trường nuôi cấy Để tăng độ tái lập phương pháp, nên sử dụng thành phần khô môi trường hoàn chỉnh khô chuẩn bị môi trường nuôi cấy Tiến hành theo hướng dẫn nhà sản xuất 5.2.1 Môi trường 5.2.1.1 Thành phần Casein tryton 5,0 g Chất chiết nấm men 2,5 g Gluccoza khan 1,0 g Thạch 10 g đến 15 g Nước 000 ml CHÚ THÍCH: Môi trường khô có bán sẵn, chẳng hạn Thạch Đếm Đĩa 5.2.1.2 Chuẩn bị Hòa tan thành phần nước đun nóng Chỉnh pH cho sau khử trùng pH 7,0 ± 0,2 Khử trùng nồi hấp áp lực nhiệt độ 120 oC ± 1oC 15 Môi trường chuẩn bị lưu giữ tối đa tháng bảo quản nơi tối nhiệt độ oC đến +5 oC 5.2.2 Dung dịch bromocrezol tía 5.2.2.1 Thành phần SVTH: NGÔ NGUYỄN NHẬT HÀ 80 SẢN PHẨM SỮA CHUA GVHD: Thầy Ngô Duy Anh Triết Bromocrezol tía 250 g Etanol, 96% ml Nước 100 ml 5.2.2.2 Chuẩn bị Hòa tan bromocrezol tía etanol Thêm nước đến 100 ml Dung dịch bromocrezol tía lưu giữ tối đa tháng bảo quản nơi tối nhiệt độ từ oC đến +5 oC 5.2.3 Dung dịch chloramphenicol (CAP) 5.2.3.1 Thành phần Chloramphenicol 20,0 mg Metanol ml Nước 100 ml 5.2.3.2 Chuẩn bị Hòa tan chloramphenicol metanol Thêm nước đến 100 ml Dung dịch chloramphenicol lưu giữ tối đa tháng bảo quản nơi tối nhiệt độ từ oC đến +5 oC 5.2.4 Dung dịch trimethoprim (TMP) 5.2.4.1 Thành phần Trimethoprim 25,0 mg Etanol, 96% ml Nước 000 ml 5.2.4.2 Chuẩn bị Hòa tan trimethoprim etanol Thêm nước đến 000 ml SVTH: NGÔ NGUYỄN NHẬT HÀ 81 SẢN PHẨM SỮA CHUA GVHD: Thầy Ngô Duy Anh Triết Dung dịch TMP lưu giữ tối đa tháng bảo quản nơi tối nhiệt độ từ oC đến +5 oC 5.2.5 Ống nghiệm A (pH = 7) Làm tan chảy môi trường (5.2.1) Để nguội môi trường nồi cách thủy tới nhiệt độ 63 oC ± 1oC Thêm 1,5 ml dung dịch CAP (5.2.3) ml dung dịch bromocrezol tía (5.2.2) vào 100 ml môi trường gia nhiệt, đồng thời giữ môi trường nồi cách thủy nhiệt độ 63 oC Trộn kỹ môi trường Tiếp tục giữ môi trường nồi cách thủy nhiệt độ 63 oC, dùng dung dịch NaOH mol/l HCl mol/l để chỉnh pH đến 7,0 ± 0,1 nhiệt độ nói Sau đó, thêm thể tích (khoảng ml) huyền phù vi sinh vật thử nghiệm (5.1) vào 100 ml môi trường, sau ủ nồi cách thủy nhiệt độ 63 oC h 15 ± 30 mà không đổi màu chứng tỏ chất kháng sinh Trộn phân phối vào ống nghiệm ống ml môi trường thử nghiệm môi trường đông đặc Các ống A bảo quản tối đa ngày nhiệt độ từ từ oC đến +5 oC, với điều kiện ống giữ kín để không làm bay (ví dụ dùng parafilm) 5.2.6 Ống nghiệm B (pH = 8) Làm tan chảy môi trường (5.2.1) Để nguội môi trường nồi cách thủy tới nhiệt độ 63 oC ± 1oC Thêm 0,6 ml dung dịch TMP (5.2.4) ml dung dịch bromocrezol tía (5.2.2) vào 100 ml môi trường gia nhiệt trước, đồng thời giữ môi trường nồi cách thủy nhiệt độ 63 oC Trộn kỹ môi trường Tiếp tục giữ môi trường nồi cách thủy nhiệt độ 63 oC, dùng dung dịch NaOH mol/l HCl mol/l để chỉnh pH đến 8,00 ± 0,02 nhiệt độ nói Trong chỉnh, ý không để pH môi trường vượt 8,05 Sau đó, thêm thể tích (khoảng ml) huyền phù vi sinh vật thử nghiệm (5.1) vào 100 ml môi trường, sau ủ nồi cách thủy nhiệt độ 63 oC h 15 ± 30 mà không đổi màu chứng tỏ chất kháng sinh Trộn phân phối vào ống nghiệm ống ml môi trường thử nghiệm môi trường đông đặc SVTH: NGÔ NGUYỄN NHẬT HÀ 82 SẢN PHẨM SỮA CHUA GVHD: Thầy Ngô Duy Anh Triết Các ống B bảo quản tối đa ngày nhiệt độ từ oC đến +5 oC, với điều kiện ống giữ kín để tránh bị bay (ví dụ dùng parafilm) 5.3 Dung dịch chuẩn mẫu kiểm chứng Chỉnh khối lượng cân để có độ tinh khiết hàm lượng muối phù hợp với ISO 13969 Để chuẩn bị dung dịch chuẩn mẫu kiểm chứng, giả sử ml dung dịch tương đương với g dung dịch 5.3.1 Dung dịch chuẩn mẫu kiểm chứng benzylpenicillin Để benzylpenixillin đạt độ bền giới hạn, cần chuẩn bị dung dịch chuẩn benzylpenixillin trước sử dụng làm lạnh đông mẫu sữa kiểm chứng ngày sử dụng nhiệt độ -18 oC 5.3.1.1 Dung dịch gốc chuẩn benzylpenicillin Hòa tan 20,0 mg ± 0,1 mg benzylpenixillin 000 ml nước trộn Dung dịch gốc chuẩn chứa benzylpenixillin 20 mg/l Dung dịch gốc chuẩn benzylpenixillin lưu giữ tối đa ngày bảo quản nhiệt độ từ oC đến +5 oC 5.3.1.2 Dung dịch làm việc chuẩn benzylpenicillin Pha loãng 10 ml dung dịch gốc chuẩn benzylpenixillin (5.3.1.1) nước đến 000 ml trộn Dung dịch gốc làm việc chứa benzylpenixillin 200 µg/l 5.3.1.3 Mẫu sữa kiểm chứng Benzylpenicillin Pha loãng ml dung dịch làm việc chuẩn benzylpenixillin (5.3.1.2) mẫu sữa âm tính với chất kháng sinh (5.4) đến 100 ml trộn Mẫu sữa kiểm chứng chứa benzylpenixillin µg/l Mẫu sữa kiểm chứng benzylpenicillin lưu giữ tối đa tháng bảo quản ống nghiệm nhiệt độ -18 oC CHÚ THÍCH: mg muối kali penixillin-G tinh khiết tương đương với 595 UI (đơn vị quốc tế) penixillin G mg muối natri penixillin-G tinh khiết tương đương với 670 UI penixillin G SVTH: NGÔ NGUYỄN NHẬT HÀ 83 SẢN PHẨM SỮA CHUA GVHD: Thầy Ngô Duy Anh Triết 5.3.2 Dung dịch chuẩn oxytetracycline mẫu kiểm chứng oxytetracycline 5.3.2.1 Dung dịch gốc chuẩn oxytetracycline Hòa tan 5,0 mg ± 0,1 mg oxytetracycline 10 ml dung dịch HCl 0,1 mol/l Pha loãng nước đến 100 ml trộn Dung dịch gốc chuẩn chứa oxytetracycline 50 mg/l Dung dịch gốc chuẩn oxytetracycline lưu giữ tối đa tuần bảo quản nơi tối nhiệt độ từ oC đến +5 oC 5.3.2.2 Dung dịch làm việc chuẩn oxytetracycline Pha loãng 10 ml dung dịch gốc chuẩn oxytetracycline (5.3.2.1) nước đến 100 ml trộn Dung dịch gốc làm việc chứa oxytetracycline 000 µg/l 5.3.2.3 Mẫu sữa kiểm chứng oxytetracycline Pha loãng ml dung dịch làm việc chuẩn oxytetracycline (5.3.2.2) với mẫu sữa âm tính (5.4) đến 100 ml trộn Mẫu sữa kiểm chứng chứa oxytetracycline 100 µg/l Mẫu sữa kiểm chứng oxytetracycline lưu giữ tối đa tháng bảo quản ống nghiệm nhiệt độ -18 oC 5.3.3 Dung dịch chuẩn sulfadiazine mẫu kiểm chứng sulfadiazine 5.3.3.1 Dung dịch gốc chuẩn sulfadiazine Hòa tan 15,0 mg ± 0,1 mg sulfadiazine 100 ml nước trộn Dung dịch gốc chuẩn chứa sulfadiazine 150 mg/l Dung dịch gốc chuẩn sulfadiazine lưu giữ tối đa tuần bảo quản nhiệt độ từ oC đến +5 oC 5.3.3.2 Dung dịch làm việc chuẩn sulfadiazine Pha loãng 10 ml dung dịch gốc chuẩn sulfadiazine (5.3.3.1) nước đến 100 ml nước trộn Dung dịch gốc làm việc chứa sulfadiazine 15 000 µg/l 5.3.3.3 Mẫu sữa kiểm chứng sulfadiazine Pha loãng ml dung dịch làm việc chuẩn sulfadiazine (5.3.3.2) mẫu sữa âm tính (5.4) đến 100 ml trộn Mẫu sữa kiểm chứng chứa sulfadiazine 150 µg/l SVTH: NGÔ NGUYỄN NHẬT HÀ 84 SẢN PHẨM SỮA CHUA GVHD: Thầy Ngô Duy Anh Triết Mẫu sữa kiểm chứng sulfadiazine lưu giữ tối đa tháng bảo quản ống nghiệm nhiệt độ -18 oC 5.3.4 Dung dịch chuẩn neomycin mẫu kiểm chứng neomycin 5.3.4.1 Dung dịch gốc chuẩn neomycin Hòa tan 30,0 mg ± 0,1 mg neomycin ml đệm phosphat 0,1 mol/l (pH = 8,0 ± 0,1) trộn Pha loãng nước đến 000 ml trộn Dung dịch gốc chuẩn chứa neomycin 30 mg/l Dung dịch gốc chuẩn neomycin lưu giữ tối đa tuần bảo quản nhiệt độ từ oC đến +5 oC 5.3.4.2 Dung dịch làm việc chuẩn neomycin Pha loãng 10 ml dung dịch gốc chuẩn neomycin (5.3.4.1) nước đến 100 ml nước trộn Dung dịch gốc làm việc chứa neomycin 000 µg/l 5.3.4.3 Mẫu sữa kiểm chứng neomycin Pha loãng ml dung dịch làm việc chuẩn neomycin (5.3.4.2) sữa âm tính (5.4) đến 100 ml trộn Mẫu sữa kiểm chứng chứa neomycin 30 µg/l Mẫu sữa kiểm chứng neomycin lưu giữ tối đa tháng bảo quản ống nghiệm nhiệt độ -18 oC 5.3.5 Dung dịch chuẩn erythromycin mẫu kiểm chứng erythromycin 5.3.5.1 Dung dịch gốc chuẩn erythromycin Hòa tan 20,0 mg ± 0,1 mg erythromycin ml metanol Pha loãng nước đến 000 ml trộn Dung dịch gốc chuẩn chứa erythromycin 20 mg/l Dung dịch gốc chuẩn erythromycin lưu giữ tối đa tuần bảo quản nhiệt độ từ oC đến +5 oC 5.3.5.2 Dung dịch làm việc chuẩn erythromycin Pha loãng ml dung dịch gốc chuẩn erythromycin (5.3.5.1) nước đến 100 ml trộn Dung dịch gốc làm việc chứa erythromycin 000 µg/l 5.3.5.3 Mẫu sữa kiểm chứng erythromycin SVTH: NGÔ NGUYỄN NHẬT HÀ 85 SẢN PHẨM SỮA CHUA GVHD: Thầy Ngô Duy Anh Triết Pha loãng ml dung dịch làm việc chuẩn erythromycin (5.3.5.2) sữa âm tính (5.4) đến 100 ml trộn Mẫu sữa kiểm chứng chứa erythromycin 10 µg/l Mẫu sữa kiểm chứng Sulfadiazine lưu giữ tối đa tháng bảo quản ống nghiệm nhiệt độ -18 oC 5.4 Mẫu sữa âm tính (sữa không chứa chất kháng sinh) Xem phương pháp thu sữa kiểm chứng ISO 13969, sử dụng sữa nguyên chất tiệt trùng UHT không chứa chất ức chế vi sinh vật SVTH: NGÔ NGUYỄN NHẬT HÀ 86 SẢN PHẨM SỮA CHUA GVHD: Thầy Ngô Duy Anh Triết Tài liệu tham khảo Các tiêu chuẩn, quy chuẩn Việt Nam QCVN 5-5:2010/BYT: Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia với sản phẩm sữa lên men TCVN 6400:2010 (ISO 707:2008) Sữa sản phẩm sữa - hướng dẫn lấy mẫu TCVN 7774:2007(ISO 5542:1984) sữa - xác định hàm lượng protein - phương pháp nhuộm đen amido (phương pháp thông thường) TCVN 8106:2009 (ISO/TS 26844:2006) sữa sản phẩm sữa - xác định dư lượng kháng sinh - phép thử phân tán ống nghiệm TCVN 7700-2:2007 (ISO 11290-2:1998) vi sinh vật thực phẩm thức ăn chăn nuôi – phương pháp phát định lượng listeria monocytogenes – phần 2: phương pháp định lượng Tài liệu tham khảo khác [1] báo cáo tổng kết đề tài Xác định dư lượng penicilin G V thực phẩm phương pháp sắc kí lỏng hiệu cao, chủ nhiệm đề tài ThS Trần Quang Thúy, viện dinh dưỡng Bộ Y Tế, 2009 [2] http://www.cesti.gov.vn/khong-gian-cong-nghe/du-luong-khang-sinh-trong-thuy- san/content/view/7980/286/81/1.html [3]http://afamily.vn/suc-khoe/10-loi-ich-suc-khoe-bat-ngo-cua-sua-chua20100930095552450.chn [4] http://www.brandsvietnam.com/5441-Sua-chua-va-cuoc-dua-gianh-ngoi-vi-so-2 [5] http://dairyvietnam.com/vn/Sua-Viet-Nam/Thi-truong-sua-chua-Viet-giau-tiem- nang.html [6] http://www.doanhnhansaigon.vn/chuyen-lam-an/sua-chua-phan-chia-lai-thi-truongsua/1075062/ [7] http://songmoi.vn/kinh-te-thi-truong/thi-truong-sua-chua-them-san-pham-tang- canh-tranh [8] Trần Linh Thước (2003), Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mỹ phẩm, NXB Giáo Dục SVTH: NGÔ NGUYỄN NHẬT HÀ 87 SẢN PHẨM SỮA CHUA GVHD: Thầy Ngô Duy Anh Triết [9] FAO (1992), “Chapter 11 Listeria”, in Microbiologycal analysis, 119 - 130 [10] Harrigan, Wilkie F (1998), Laboratory methods in Food microbiology, Academic Press, 198 - 200 SVTH: NGÔ NGUYỄN NHẬT HÀ 88 ...SẢN PHẨM SỮA CHUA GVHD: Thầy Ngô Duy Anh Triết BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TPHCM KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM ĐỒ ÁN MÔN HỌC PHÂN TÍCH THỰC PHẨM GVHD: Thầy Ngô... đồ 2: Doanh số sữa chua ăn công ty Vinamilk qua năm 14 Biểu đồ 3: Phát triển đăng ký SC phân tích DLKS thủy sản, thực phẩm .45 Biểu đồ 4: Các phương pháp nghiên cứu phân tích DLKS phổ biến... SỮA CHUA GVHD: Thầy Ngô Duy Anh Triết Biểu đồ 2: Doanh số sữa chua ăn công ty Vinamilk qua năm Sản phẩm sữa chua Vinamilk Sữa chua Vinamilk SVTH: NGÔ NGUYỄN NHẬT HÀ 14 SẢN PHẨM SỮA CHUA Sữa chua