Phân tích trình tự gen mã hóa Flavonol synthase từ cây chè bản địa ở Thái Nguyên (LV thạc sĩ)

Phân tích trình tự gen mã hóa Flavonol synthase từ cây chè bản địa ở Thái Nguyên (LV thạc sĩ)Phân tích trình tự gen mã hóa Flavonol synthase từ cây chè bản địa ở Thái Nguyên (LV thạc sĩ)Phân tích trình tự gen mã hóa Flavonol synthase từ cây chè bản địa ở Thái Nguyên (LV thạc sĩ)Phân tích trình tự gen mã hóa Flavonol synthase từ cây chè bản địa ở Thái Nguyên (LV thạc sĩ)Phân tích trình tự gen mã hóa Flavonol synthase từ cây chè bản địa ở Thái Nguyên (LV thạc sĩ)Phân tích trình tự gen mã hóa Flavonol synthase từ cây chè bản địa ở Thái Nguyên (LV thạc sĩ)Phân tích trình tự gen mã hóa Flavonol synthase từ cây chè bản địa ở Thái Nguyên (LV thạc sĩ)Phân tích trình tự gen mã hóa Flavonol synthase từ cây chè bản địa ở Thái Nguyên (LV thạc sĩ)Phân tích trình tự gen mã hóa Flavonol synthase từ cây chè bản địa ở Thái Nguyên (LV thạc sĩ)Phân tích trình tự gen mã hóa Flavonol synthase từ cây chè bản địa ở Thái Nguyên (LV thạc sĩ)Phân tích trình tự gen mã hóa Flavonol synthase từ cây chè bản địa ở Thái Nguyên (LV thạc sĩ)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC MAI THỊ HUYỀN TRANG PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ GEN MÃ HÓA FLAVONOL SYNTHASE TỪ CÂY CHÈ BẢN ĐỊA Ở THÁI NGUYÊN (Camellia sinensis) LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG THÁI NGUYÊN - 2016 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC MAI THỊ HUYỀN TRANG PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ GEN MÃ HÓA FLAVONOL SYNTHASE TỪ CÂY CHÈ BẢN ĐỊA Ở THÁI NGUYÊN (Camellia sinensis) Chuyên nghành: Công nghệ Sinh học Mã số: 60.42.02.01 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG Người hướng dẫn khoa học: TS Hoàng Thị Thu Yến THÁI NGUYÊN - 2016 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng Các số liệu kết trình bày luận văn trung thực chưa công bố công trình khác Mọi trích dẫn luận văn ghi rõ nguồn gốc Tác giả Mai Thị Huyền Trang ii LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Hoàng Thị Thu Yến - Giảng viên, phó trưởng khoa - Khoa Khoa học Sự sống - Trường Đại học Khoa học - người tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức kinh nghiệm quý báu để hoàn thành luận văn Tôi xin cảm ơn thầy cô tập thể cán phòng thí nghiệm Khoa Khoa học Sự sống, cảm ơn lãnh đạo Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên cán công tác Viện Nghiên cứu hệ gen - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam nhiệt tình hướng dẫn trình làm đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn Cử nhân Phạm Thị Hằng, TS Huỳnh Thị Thu Huệ, Phòng đa dạng sinh học hệ gen, Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, tận tình dẫn giúp đỡ hoàn thành đề tài nghiên cứu khoa học Nhân dịp xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS Dương Trung Dũng – Khoa Nông học – Trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên giúp đỡ thời gian thu thập vật liệu nghiên cứu làm đề tài Cuối cùng, xin bày tỏ lòng biết ơn tới toàn thể gia đình, bạn bè đồng nghiệp cổ vũ, động viên suốt thời gian qua Tác giả Mai Thị Huyền Trang iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN .ii MỤC LỤC .iii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT .v DANH MỤC CÁC BẢNG vi DANH MỤC CÁC HÌNH vii MỞ ĐẦU 1 Lý chọn đề tài Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Chương 1: TỔNG QUAN VỀ CÂY CHÈ .3 1.1 Giới thiệu chung chè 1.1.1 Nguồn gốc phân loại chè 1.1.2 Đặc điểm sinh học chè 1.1.3 Thành phần hóa học chè 1.1.4 Giá trị chè 1.2 Tình hình sản xuất chè giới Việt Nam 1.2.1 Tình hình sản xuất chè giới 1.2.2 Tình hình sản xuất chè Việt Nam 11 1.3 Tình hình nghiên cứu chè giới Việt Nam .12 1.3.1 Tình hình nghiên cứu chè giới .12 1.3.2 Tình hình nghiên cứu chè Việt Nam 13 1.4 Flavonol synthase đường sinh tổng hợp polyphenol chè 14 1.4.1 Polyphenol chè 14 1.4.2 Con đường sinh tổng hợp polyphenol chè 16 1.4.3 Flavonol synthase chè 17 Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .18 iv 2.1 Vật liệu nghiên cứu .18 2.1.1 Nguyên liệu 18 2.1.2 Hóa chất 18 2.1.3 Thiết bị 19 2.2 Phương pháp nghiên cứu 19 2.2.1 Phương pháp tách chiết RNA tổng số .19 2.2.2 Điện di RNA tổng số 20 2.2.3 Tổng hợp cDNA .20 2.2.4 Nhân gen FLS kỹ thuật PCR 21 2.2.5 Tinh sản phẩm PCR 23 2.2.6 Tách dòng gen FLS 24 2.2.7 Xác định trình tự gen 27 2.2.8 Xử lý số liệu phần mềm chuyên dụng .28 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .29 3.1 Tách RNA tổng số từ mẫu chè nghiên cứu 29 3.2 Nhân gen mã hóa Flavonol synthase từ mẫu chè nghiên cứu 31 3.3 Tạo dòng gen FLS 32 3.4 Xác định phân tích trình tự gen mã hóa Flavonol synthase 34 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41 KẾT LUẬN 41 KIẾN NGHỊ 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO 42 v DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt Nghĩa tiếng Việt Nghĩa tiếng Anh cDNA cDNA Complementary DNA DNA Axit Deoxiribonucleic Deoxyribonucleic Acid dNTP dNTP Deoxynucleoside triphosphate Đtg Đồng tác giả et al EDTA EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid EST Đoạn trình tự biểu Expressed Sequence Tag EtBr EtBr Ethidium Bromide Kb Kilô bazơ Kilo base LB Môi trường LB Luria Bertani PCR Phản ứng chuỗi trùng hợp Polymerase Chain Reaction Primer F Mồi xuôi Primer forward Primer R Mồi ngược Primer reverse RNA Axit Ribonucleic Ribonucleic Acid Rnase Enzyme phân hủy RNA Ribonuclease SDS SDS Natri Dodexyl Sulfat TAE TAE Tris Acetate EDTA Taq Vi khuẩn chịu nhiệt Thermus aquaticus HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao High Performance Liquid Chromatography FLS Flavonol synthase Flavonol synthase vi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Diện tích, suất, sản lượng chè giới giai đoạn 2001- 2010 Bảng 1.2 Diện tích, suất, sản lượng số nước trồng chè giới năm 2010 10 Bảng 1.3 Tình hình diện tích, suất, sản lượng chè Việt Nam năm gần 12 Bảng 2.1 Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA 21 Bảng 2.2 Chu trình nhiệt thực phản ứng tổng hợp cDNA 21 Bảng 2.3 Trình tự đoạn oligonucleotide sử dụng nhân gen FLS .21 Bảng 2.4 Thành phần phản ứng PCR nhân gen FLS 22 Bảng 2.5 Thành phần phản ứng nối đoạn gen FLS với vector pJET 1.2 .24 Bảng 2.6 Thành phần phản ứng ghép nối đoạn gen vector 25 Bảng 2.7 Phản ứng cắt tiến hành với thành phần 27 Bảng 3.1 Kết kiểm tra nồng độ RNA tổng số từ mẫu chè Trung Du .30 Bảng 3.2 Sự sai khác trình tự nucleotide gen FLS chè Trung du xanh chè Trung du tím với trình tự công bố Genbank 38 Bảng 3.3 Sự sai khác trình tự amino acid FLS với trình tự FLS chè Trung du xanh Trung du tím 38 vii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Một số giống chè trồng Thái Nguyên Hình 1.2 Sơ đồ đường sinh tổng hợp hợp chất polyphenol chè [26] 16 Hình 2.1 Chu kỳ nhiệt thực phản ứng nhân gen FLS .22 Hình 2.2 Sơ đồ vector tách dòng pJET 1.2 24 Hình 3.1 Kết điện di kiểm tra sản phẩm tách chiết RNA tổng số .30 Hình 3.2 Kết PCR nhân gen FLS từ cDNA hai mẫu chè Trung du xanh (chè xanh) chè Trung du tím (chè tím) 31 Hình 3.3 Hình ảnh điện di tách plasmid mẫu chè Trung du tím 32 Hình 3.4 Hình ảnh điện di tách plasmid mẫu chè xanh 33 Hình 3.5 Hình ảnh điện di kiểm tra dòng plasmid 34 Hình 3.6 Kết phân tích trình tự gen FLS phân lập từ mẫu chè xanh chè tím 37 Hình 3.7 So sánh trình tự amino acid suy diễn FLS công bố (DQ198089.1) với FLS chè Trung du xanh (FLS CX) chè Trung du tím (FLS CT) 40 MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Chè (Camellia sinensis (L) O Kuntze) loại công nghiệp lâu năm, có nguồn gốc vùng nhiệt đới Á nhiệt đới Cây chè sinh trưởng phát triển tốt điều kiện khí hậu nóng ẩm, tập trung chủ yếu Châu Á Châu Phi Chè thứ nước uống tự nhiên lâu đời nhất, tiêu thụ rộng rãi với chi phí thấp Sản phẩm từ chè sử dụng rộng rãi khắp giới nhiều công dụng khác phổ biến đồ uống Uống chè chống lạnh, khắc phục mệt mỏi bắp hệ thần kinh trung ương, kích thích vỏ đại não làm cho tinh thần minh mẫn sảng khoái, hưng phấn thời gian lao động căng thẳng trí óc chân tay Lá chè có khả chữa số bệnh đường ruột kiết lị, tiêu chảy (do chứa tamin), lợi tiểu (do chứa theofilin, theobromin), chống lão hóa Hơn nữa, kích thích tiêu hoá mỡ, chống béo phì, chống sâu răng, hôi miệng, phòng ngừa ung thư (do chứa catesin), phòng ngừa bệnh tăng huyết áp, tiểu đường ngăn ngừa cholesteron tăng cao… Trong chè chứa nhiều loại vitamin C, B2, PP, K, E, F… amino acid cần thiết cho thể Ngoài ra, chè có khả bảo vệ da khỏi tác hại tia cực tím, chè cho ức chế xâm nhiễm sinh sản HIV Hầu hết đặc tính có lợi cho sức khỏe liệt kê chứng minh hợp chất polyphenol có chè Thành phần hóa học chất rắn chiết xuất từ chè xanh polyphenol, thành phần chất hóa học chè đen giống với chè xanh Tuy nhiên, hàm lượng số hợp chất polyphenol thay đổi trình oxi hóa Hàm lượng polyphenol định đến màu sắc, độ chát nước chè góp phần tạo hương vị chè Có nhiều hợp chất polyphenol tìm thấy chè Tuy nhiên, tùy vào loại sản phẩm chè mà 32 Kết hình 3.2 cho thấy kỹ thuật PCR nhiệt độ gắn mồi tốt 600C với 30 chu kì Sau tối ưu nhiệt độ gắn mồi đặc hiệu, tiến hành khuếch đại gen mã hóa FLS phục vụ tách dòng gen 3.3 Tạo dòng gen FLS Do sản phẩm PCR thu sau phản ứng khuếch đại gen có tạp chất mồi, đệm PCR, nucleotide, dư chứa sản phẩm phụ ảnh hưởng đến kết trình tách dòng Do vậy, tiến hành tinh (thôi gel) sản phẩm PCR mẫu chè Các đoạn gen sau tinh kiểm tra điện di gel agarose 0,8% để kiểm tra chất lượng xác định sơ hàm lượng DNA tinh Sau đó, sản phẩm PCR gắn vào vector pJET1.2, biến nạp vào tế bào vi khuẩn E.coli DH10 cấy trải môi trường LB đặc chọn lọc Để xác định dòng vi khuẩn mang vector pJET1.2 chứa đoạn sản phẩm PCR, lựa chọn số dòng vi khuẩn để tiến hành tách chiết plasmid Kết tách plasmid thể hình 3.3 hình 3.4 Hình 3.3 Hình ảnh điện di tách plasmid mẫu chè Trung du tím (-): vector pJET1.2; 1-12: plasmid thu từ kết biến nạp 33 Qua ảnh điện di hình 3.3 ra, dòng 6, 12 plasmid thu có kích thước cao đối chứng Tương tự kết tách dòng sản phẩm PCR khuếch đại gen FLS mẫu chè Trung du tím, mẫu chè Trung du xanh thu dòng: 4, 11, 12, 13, 15, 16, 19 22 có kích thước cao so với đối chứng (Hình 3.4) Do đó, bước đầu khẳng định dòng mang vector pJET1.2 có gắn đoạn sản phẩm PCR Hình 3.4 Hình ảnh điện di tách plasmid mẫu chè xanh (-): vector pJET1.2; 1-22: plasmid thu từ kết biến nạp Từ kết tách chiết plasmid, tiếp tục phân tích số plasmid enzyme giới hạn, plasmid dòng từ mẫu chè Trung du tím (ký hiệu T1 T6) dòng 19 22 (ký hiệu X19 X22) từ mẫu chè Trung du xanh xử lý enzyme giới hạn BglII Kết cắt kiểm tra enzyme giới hạn thể hình 3.5 34 Hình 3.5 Hình ảnh điện di kiểm tra dòng plasmid M: maker 1kb; (+): sản phẩm tinh đoạn FLS; (-): vector pJET1.2 không chứa đoạn chèn; plasmid T1, T6, X19, X22 cắt enzyme BglII Sau phân tích dòng plasmid tái tổ hợp enzyme BglII Kết điện di cho thấy, plasmid T1 X19 bị cắt thành đoạn có kích thước tương ứng vector pJET1.2 (~3 kb), chứng tỏ vector pJET1.2 tự nối lại, plasmid T6 X22 bị cắt thành hai đoạn: đoạn lớn có kích thước tương ứng với vector pJET1.2 (~3 kb) đoạn nhỏ có kích thước kb tương ứng với sản phẩm PCR nhân gen FLS, với tính toán lý thuyết cắt plasmid pJET1.2 BglII thêm 39 nucleotide vector nên sản phẩm cắt cao so với sản phẩm PCR Như vậy, bước đầu khẳng định dòng plasmid có gắn gen FLS Để khẳng định chắn đoạn chèn có phải gen FLS hay không, tiếp tục tinh dòng plasmid để giải trình tự 3.4 Xác định phân tích trình tự gen mã hóa Flavonol synthase Chúng xác định trình tự gen FLS gắn với vector pJET 1.2 Sau phân tích trình tự, khẳng định chắn đoạn cDNA 35 phân lập trình tự ORF hoàn chỉnh mã hóa FLS Gen có kích thước 996 bp, mã hóa 331 amino acid mã kết thúc TAA Tiếp theo, tiến hành phân tích, so sánh trình tự gen FLS thu với trình tự công bố (DQ198089.1) Kết so sánh trình tự nucleotide amino acid thể hình 3.6 FLS FLS CT FLS CX FLS FLS CT FLS CX FLS FLS CT FLS CX FLS FLS CT FLS CX FLS FLS CT FLS CX FLS FLS CT FLS CX FLS ATGGAGGTAGAGAGAGTGCAAGCCCTGTCCCATGTAACTCTCCATGAGCTCCCTGTAAAA M E V E R V Q A L S H V T L H E L P V K .C M E V E R V Q A L S H V T L H E L P A K .C M E V E R V Q A L S H V T L H E L P A K 60 60 60 TTTATCCGACCGGTCCACGAGCAACCGGAGAACAGCAAGGCTATCGAAGGTGTCACCGTC 120 F I R P V H E Q P E N S K A I E G V T V .C 120 F I R P A H E Q P E N S K A I E G V T V 120 F I R P V H E Q P E N S K A I E G V T V CCCGTGATCTCCCTCTCTCAACCACACGATGTGGTGGTCGATGCATTATCAAAGGCTTGT 180 P V I S L S Q P H D V VV D A L S K A C G 180 P V I S L S R P H D V VV D A L S K A C 180 P V I S L S Q P H D V VV D A L S K A C AGTGAATGGGGATTTTTCCTCATCACGGATCACGGTGTCGAGCCCTCGTTGATCGGACGG 240 S E W G F F L I T D H G V E P S L I G R 240 S E W G F F L I T D H G V E P S L I G R 240 S E W G F F L I T D H G V E P S L I G R CTAAAAGAGGTTGGGGAGGAGTTCTTTAAGCTCCCACAGGAGGAGAAAGAGAGCTATGCA 300 L K E V G E E F F K L P Q E E K E S Y A .A 300 L K E V G E E F F K L P Q K E K E S Y A 300 L K E V G E E F F K L P Q E E K E S Y A AATGATCCTTCAAGTGGGAGTTTTGAAGGGTATGGAACAAAGATGACTAAAAATTTTGAT 360 N D P S S G S F E G Y G T K M T K N F D 360 N D P S S G S F E G Y G T K M T K N F D 360 N D P S S G S F E G Y G T K M T K N F D GAGAAAGTTGAGTGGATTGATTATTATTTTCACGTCATGCACCCTCCTAAGAAGCTCAAT 420 E K V E W I D Y Y F H V M H P P K K L N 36 FLS CT FLS CX FLS FLS CT FLS CX FLS FLS CT FLS CX FLS FLS CT FLS CX FLS FLS CT FLS CX FLS FLS CT FLS CX FLS FLS CT FLS CX FLS FLS CT 420 E K V E W I D Y Y F H V M H P P K K L N 420 E K V E W I D Y Y F H V M H P P K K L N CTTGACATGTGGCCTAAGAACCCTTCTTCATACAGGGGAGTGACAGAGGAATACAATGTG 480 L D M W P K N P S S Y R G V T E E Y N V 480 L D M W P K N P S S Y R G V T E E Y N V 480 L D M W P K N P S S Y R G V T E E Y N V GAAATAATGAGAACAACCAACAAGTTATTTGAACTTCTCTCAGAGGGACTAGGTTTGGAT 540 E I M R T T N K L F E L L S E G L G L D C G G 540 E I L R T T N K L L E L L S E G L G L D 540 E I M R T T N K L F E L L S E G L G L D GGGAAGGTTTTGAATTCTTCTTTGGGTGGTGATGAAATTGAATTTGAAATGAAAATCAAC G K V L N S S L G G D E I E F E M K I N G K V L N S S L G G D E I E F E M K I N G K V L N S S L G G D E I E F E M K I N 600 600 600 ATGTACCCACCATGCCCACAACCTCAGCTCGCCCTCGGAGTTGAACCTCACACTGACATG 660 M Y P P C P Q P Q L A L G V E P H T D M G 660 M Y P P C P Q P E L A L G V E P H T D M 660 M Y P P C P Q P Q L A L G V E P H T D M TCTGCTCTCACTTTACTTGTCCCCAATGACGTTCCCGGTCTTCAAGTTTGGAAAGACGGT 720 S A L T L L V P N D V P G L Q V W K D G A G 720 S A L T L L I P N D V P G L Q V W K D G A 720 S A L T L L V P N D V P G L Q V W K D G AATTGGGTAGCTGTCAATTACTTGCCAAATGCACTCTTCGTCCATGTTGGTGATCAACTT 780 N W V A V N Y L P N A L F V H V G D Q L G 780 N W V A V N Y L P N A L F V H V G D Q L G 780 N W V A V N Y L P N A L F V H V G D Q L GAGGTACTAAGCAATGGTAAGTACAAGAGTGTTCTTCACAGGAGCTTGGTGAACAAAGAA 840 E V L S N G K Y K S V L H R S L V N K E T 840 37 FLS CX FLS FLS CT FLS CX FLS FLS CT FLS CX FLS FLS CT FLS CX E V L S N G K Y K S V L H R S L V N K E T 840 E V L S N G K Y K S V L H R S L V N K E AGGACAAGAATGTCTTGGGCTGTGTTTGTCGTGCCTCCTCATGAAGCAGTGATTGGACCT 900 R T R M S W A V F V V P P H E A V I G P 900 R T R M S W A V F V V P P H E A V I G P 900 R T R M S W A V F V V P P H E A V I G P CTTCCAGAGCTCATTGATGAGAAAAACCCAGCAAAATATTCAACCAAAACATATGCCGAG 960 L P E L I D E K N P A K Y S T K T Y A E 960 L P E L I D E K N P A K Y S T K T Y A E 960 L P E L I D E K N P A K Y S T K T Y A E TACCGTTATCGCAAATTCAATAAGATTCCCCAATAA 996 Y R Y R K F N K I P Q * .A 996 Y R Y R K F N K I P Q * .A 996 Y R Y R K F N K I P Q * Hình 3.6 Kết phân tích trình tự gen FLS phân lập từ mẫu chè xanh chè tím FLS: Trình tự gen FLS từ chè công bố Genbank với mã số DQ198089.1; FLS CT: trình tự gen FLS phân lập từ mẫu chè Trung du tím; FLS CX: trình tự gen FLS phân lập từ mẫu chè Trung du xanh; Trình tự nucleotide thay đổi làm thay đổi trình tự amino acid ( ); Trình tự nucleotide thay đổi không làm thay đổi trình tự amino acid ( ) Trình tự nucleotide gen FLS phân lập từ chè Trung du xanh Trung du tím có vị trí sai khác nucleotide (0,009%), dẫn đến sai khác vị trí amino acid (0,007%) Khi so sánh trình tự gen FLS từ mẫu nghiên cứu với trình tự đăng ký ngân hàng GenBank (DQ198089.1), thấy có sai khác 13 vị trí nucleotide (Bảng 3.2), đặc biệt vị trí nucleotide 57, 756, 38 825 990 gen FLS hai mẫu chè nghiên cứu tương ứng C, G, T A trình tự gen FLS công bố tương ứng A, C, C C Trong 13 vị trí sai khác nucleotide, gen FLS từ mẫu chè Trung du xanh có vị trí sai khác với hệ số tương đồng di truyền 99,5%, mẫu chè trung du tím có 13 vị trí sai khác với hệ số tương đồng di truyền 98,7% Như vậy, gen FLS chè có tính bảo thủ cao Bảng 3.2 Sự sai khác trình tự nucleotide gen FLS chè Trung du xanh chè Trung du tím với trình tự công bố Genbank TT Vị trí FLS FLS CT FLS CX 57 A C C 74 T C T 140 A G A 280 G A G 488 T C T 514 C G C 625 C G C 679 G A G 696 C G C 10 720 T T A 11 756 C G G 12 825 C T T 13 990 C A A Trình tự amino acid suy diễn protein FLS công bố Genbank trình tự chè Trung du tím chè Trung du xanh có kích thước 331 amino acid Sự sai khác trình tự nucleotide dẫn đến sai khác trình tự amino acid FLS chè Trung du xanh, chè Trung du tím với trình tự công bố ngân hàng gen giới thống kê bảng 3.3 thể hình 3.7 39 Bảng 3.3 Sự sai khác trình tự amino acid FLS với trình tự FLS chè Trung du xanh Trung du tím TT Vị trí FLS FLS CT FLS CX 19 V A A 25 V A V 47 Q R Q 94 E K E 163 M L M 170 F L F 209 Q E Q 227 V I V Trình tự amino acid FLS chè Trung du tím khác với trình tự FLS công bố vị trí (Bảng 3.3), với hệ số tương đồng 97,6% Trong đó, trình tự amino acid FLS chè Trung du xanh khác với trình tự FLS công bố vị trí (19V→A) (Bảng 3.3), với hệ số tương đồng 99,7% Do đó, cho trình tự nucleotide trình tự amino acid suy diễn FLS từ chè Trung du tím chè Trung du xanh có độ tương đồng cao với mẫu công bố ngân hàng gen quốc tế Genbank FLS FLS CT FLS CX MEVERVQALSHVTLHELPVKFIRPVHEQPENSKAIEGVTVPVISLSQPHDVVVDALSKAC 60 A A R 60 A 60 N terminal Motif FLS FLS CT FLS CX SEWGFFLITDHGVEPSLIGRLKEVGEEFFKLPQEEKESYANDPSSGSFEGYGTKMTKNFD 120 K 120 120 FLS FLS CT FLS CX EKVEWIDYYFHVMHPPKKLNLDMWPKNPSSYRGVTEEYNVEIMRTTNKLFELLSEGLGLD 180 L L 180 180 2-oxoglutarate binding motif FLS FLS CT FLS CX GKVLNSSLGGDEIEFEMKINMYPPCPQPQLALGVEPHTDMSALTLLVPNDVPGLQVWKDG 240 E .I 240 240 Fe(II) binding motif 40 FLS FLS CT FLS CX NWVAVNYLPNALFVHVGDQLEVLSNGKYKSVLHRSLVNKERTRMSWAVFVVPPHEAVIGP 300 300 300 Name: “2OG-FeII_Oxy” 2OG-Fe(II) oxygenase superfamily FLS FLS CT FLS CX LPELIDEKNPAKYSTKTYAEYRYRKFNKIPQ 331 331 331 Hình 3.7 So sánh trình tự amino acid suy diễn FLS công bố (DQ198089.1) với FLS chè Trung du xanh (FLS CX) chè Trung du tím (FLS CT) Theo Cheng đtg [18], FLS dioxygenase thuộc siêu họ 2OG-Fe(II) oxygenase Enzyme thực chức chuyển hóa dihydroflavonol tạo flavonol thông qua domain đặc trưng cho siêu họ 2OGFe(II) oxygenase (phần xám), domain có cấu trúc bảo thủ bao gồm 95 amino acid (từ vị trí 199→291) Trong domain này, mẫu chè Trung du xanh sai khác so với trình tự công bố, mẫu chè Trung du tím có vị trí amino acid so với Trung du xanh trình tự công bố (209Q→E; 227M→L) Domain vùng chức quan trọng FLS nên sai khác ảnh hưởng đến hoạt động enzyme Hơn nữa, nghiên cứu chứng minh số motif định đến chức FLS [18] Motif PxxxIRxxx-EQP đầu N (18→29) định đến hoạt tính FLS, thay đổi trình tự nucleotide motif làm hoạt tính FLS Kết so sánh mẫu nghiên cứu với trình tự công bố thay đổi vị trí amino motif (19/25V→A) Mặt khác, FLS có hoạt tính chức đầy đủ có mặt Fe (II) 2-oxoglutarate Motif mà Fe (II) bám amino acid có tính bảo thủ cao (217H, 219D 273H) mẫu chè phân tích, motif CPQ/RPxLAL (205→212) vị trí bám 2-oxoglutarate có vị trí amnio acid sai khác FLS mẫu chè Trung du tím với chè Trung du xanh trình tự công bố (209Q→E) Như vậy, kết nghiên cứu đặt vấn đề cần nghiên cứu sâu SNPs gen FLS chè 41 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Đã tách chiết RNA tổng số khuếch đại thành công gen mã hóa FLS kỹ thuật PCR mẫu chè nghiên cứu Gen FLS có kích thước 996 bp tách dòng vector pJET1.2 Đã xác định phân tích trình tự gen mã hóa Flavonol synthase từ mẫu chè nghiên cứu Gen FLS có ORF 996 nucleotide, mã hóa 331 amino acid mã kết TAA Trình tự gen FLS từ mẫu chè nghiên cứu có sai khác 13 vị trí nucleotide, dẫn đến sai khác vị trí amino acid, sai khác amino acid xảy số motif thực chức FLS KIẾN NGHỊ Kết nghiên cứu đặt vấn đề cần nghiên cứu sâu đa hình trình tự nucleotide đơn (các SNPs) gen FLS chè 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Trần Quang Anh (2005) , “Trà sức khỏe”, Báo sức khỏe đời sống Hoàng Văn Chung, (2012), “Nghiên cứu tuyển chọn đầu dòng số biện pháp kỹ thuật nhân giống, trồng chè Shan vùng núi cao tỉnh Bắc Kạn”, Luận án tiến sỹ Khoa học Nông nghiệp, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, Đại học Thái Nguyên Đường Hồng Dật, (2004), “Cây chè biện pháp nâng cao suất chất lượng sản phẩm”, NXB Lao động – xã hội Chu Thúc Đạt (2003), "Đánh giá tiềm phát triển chè nghiên cứu đặc điểm sinh trưởng, phát triển, suất chất lượng số giống chè Thái Nguyên'', Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Nguyễn Thị Thu Hương, Nguyễn Thị Thu Phương, Hoàng Văn Chung, Hoàng Thị Thu Yến (2010), "Bước đầu nghiên cứu đa dạng di truyền số dòng chè shan (Camellia sinensis var assamica (Mast) Pierre sec Phamh) kỹ thuật RAPD", Tạp chí Khoa học Công nghệ Thái Nguyên, 65 (3), 149-157 Lê Tất Khương (1997), “Nghiên cứu đặc điểm sinh trưởng, phát triển số giống chè biện pháp kĩ thuật nâng cao suất chất lượng chè vụ Đông – Xuân Bắc Thái”, Luận án PTS Khoa học Nông nghiệp Lê Tất Khương, Hoàng Văn Chung (1999), Giáo trình chè, Nxb Nông nghiệp Hà Nội Trần Đình Long, Mai Hoàng Thạch, Hoàng Tuyết Minh (1997), Chọn giống trồng, Giáo trình cao học Nông Nghiệp, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội Đỗ Ngọc Quỹ (1991), Sự thành lập hoạt động trạm nghiên cứu nông nghiệp Phú Hộ 1918 – 1945, Viện nghiên cứu chè 43 10 Đỗ Ngọc Quỹ, Lê Tất Khương (2000), Giáo trình chè dùng cho sau đại học NXB Nông nghiệp 11 Đỗ Ngọc Quỹ, Đỗ Thị Ngọc Oanh (2008), Kỹ thuật trồng chế biến chè suất cao - chất lượng tốt, NXB Nông nghiệp, tr: – 66 12 Đỗ Ngọc Quỹ, Lê Thất Khương (2000), giáo trình chè sản xuất, chế biến tiêu thụ, NXB Nông nghiệp Hà Nội 13 Lê Ngọc Tú (1995), Hóa sinh công nghiệp, NXB khoa học kỹ thuật Hà Nội 14 Lương Thị Hồng Vân, Trần Thị Hồng (2010), Sự tồn lưu chì, cadmi sản phẩm chè trồng vùng mỏ thiếc huyện Đại từ, tỉnh Thái Nguyên, Tạp chí Nghiên cứu phát triển bền vững, tập 26, số 1, năm 2010, tr 46-50 15 Hoàng Thị Thu Yến, Nguyễn Thị Huế, Nguyễn Thị Thu Hương, Nghiêm Thị Nhật, Hoàng Văn Chung (2010) Nhân gen mã hóa rRNA 18S dòng chè shan (Camellia sinensis var Assamica (Mast) Pierre sec Phamh) BV04 BV19 Tạp chí Khoa học Công nghệ Thái Nguyên 70(8): 111-114 16 Hoàng Thị Thu Yến, Nguyễn Văn Tuấn, Hoàng Thị Ngà (2012), "Nghiên cứu đa dạng di truyền genome số dòng chè (Camellia sinensis) trồng xã Tân Cương – Thành phố Thái Nguyên kỹ thuật RAPD", Tạp chí Khoa học Công nghệ Thái Nguyên, 96 (8), 139 -143 TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI 17 Ashihara H., Deng W W., Mullen W., Crozier A "Distribution and biosynthesis of flavan-3-ols in Camellia sinensis seedlings and expression of genes encoding biosynthetic enzymes", Phytochemistry, 71 (5-6), 559-566 44 18 Cheng A X., Han X Z., Wu Y F., Lou H X (2014), “The Function and Catalysis of 2-Oxoglutarate-Dependent Oxygenases Involved in Plant Flavonoid Biosynthesis”, Int J Mol Sci, 15, 1080-1095 19 Eungwanichayapant P D., Popluechai S (2009), "Accumulation of catechins in tea in relation to accumulation of mRNA from genes involved in catechin biosynthesis", Plant Physiol Biochem, 47 (2), 94-97 20 Harbowy M E., Balentine D A (1997), "Tea chemistry", Critical Reviews ill Plant Sciences, 16 (5), 415-480 21 Holton T A., Brugliera F., Tanaka Y (1993), "Cloning and expression of flavonol synthase from Petunia hybrida", Plant J, (6), 1003-1010 22 Kirita M., Honma D., Tanaka Y., Usui S., Shoji T., Sami M., Yokota T., Tagashira M., Muranaka A., Uchiyama M., Kanda T., Maeda-Yamamoto M "Cloning of a novel O- methyltransferase from Camellia sinensis and synthesis of o-methylated EGCG and evaluation of their bioactivity", J Agric Food Chem, 58 (12), 7196-7201 23 Lee M J., Lambert J D., Prabhu S., Meng X., Lu H., Maliakal P., Ho C T., Yang C S (2004), "Delivery of tea polyphenols to the oral cavity by green tea leaves and black tea extract", Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 13 (1), 132-137 24 Lin G Z., Lian Y J., Ryu J H., Sung M K., Park J S., Park H J., Park B K., Shin J S., Lee M S., Cheon C I (2007), "Expression and purification of His-tagged flavonol synthase of Camellia sinensis from Escherichia coli", Protein Expr Purif, 55 (2), 287-292 25 Punyasiri P A., Abeysinghe I S., Kumar V., Treutter D., Duy D., Gosch C., Martens S., Forkmann G., Fischer T C (2004), "Flavonoid biosynthesis in the tea plant Camellia sinensis: properties of enzymes of the prominent epicatechin and catechin pathways", Arch Biochem Biophys, 431 (1), 22-30 45 26 Rani A., Singh K., Ahuja P S., Kumar S (2012), "Molecular regulation of catechins biosynthesis in tea [Camellia sinensis (L.) O Kuntze]", Gene, 495 (2), 205-210 27 Rani A., Singh K., Sood P., Kumar S., Ahuja P S (2009), "pCoumarate:CoA ligase as a key gene in the yield of catechins in tea [Camellia sinensis (L.) O Kuntze]", Funct Integr Genomics, (2), 271-275 28 Saslowsky D., Winkel-Shirley B (2001), "Localization of flavonoid enzymes in Arabidopsis roots", Plant J, 27 (1), 37-48 29 Singh K., Paul A., Kumar S., Ahuja P S (2009), "Cloning and differential expression of QM like protein homologue from tea [Camellia sinensis (L.) O Kuntze]", Mol Biol Rep, 36 (5), 921- 927 30 Singh K., Rani A., Kumar S., Sood P., Mahajan M., Yadav S K., Singh B., Ahuja P S (2008), "An early gene of the flavonoid pathway, flavanone 3-hydroxylase, exhibits a positive relationship with the concentration of catechins in tea (Camellia sinensis)", Tree Physiol, 28 (9), 1349-1356 31 Singh K., Rani A., Paul A., Dutt S., Joshi R., Gulati A., Ahuja P S., Kumar S (2009), "Differential display mediated cloning of anthocyanidin reductase gene from tea (Camellia sinensis) and its relationship with the concentration of epicatechins", Tree Physiol, 29 (6), 837- 846 32 Yang D., Liu Y., Sun M., Zhao L., Wang Y., Chen X., Wei C., Gao L., Xia T (2012), "Differential gene expression in tea (Camellia sinensis L.) calli with different morphologies and catechin contents", J Plant Physiol, 169 (2), 163-175 Tài liệu internet 33 Các thành phần hóa học chè http://chemvn.net/chemvn/showthread.php?t=1274 34 Giá trị chè 46 http://bannhanong.vietnetnam.net 35 Lịch sử chè wwww.Wikipedia the free encyclopedia The history of tea ... Phân tích trình tự gen mã hóa Flavonol synthase từ chè địa Thái Nguyên Mục tiêu nghiên cứu Tạo dòng, xác định phân tích trình tự gen mã hóa Flavonol synthase từ chè địa Thái Nguyên Nội dung nghiên... số từ mẫu chè nghiên cứu 29 3.2 Nhân gen mã hóa Flavonol synthase từ mẫu chè nghiên cứu 31 3.3 Tạo dòng gen FLS 32 3.4 Xác định phân tích trình tự gen mã hóa Flavonol synthase. ..ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC MAI THỊ HUYỀN TRANG PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ GEN MÃ HÓA FLAVONOL SYNTHASE TỪ CÂY CHÈ BẢN ĐỊA Ở THÁI NGUYÊN (Camellia sinensis) Chuyên