Cong nghe gen trong ứng dụng thực tiễn

CÔNG NGHỆ GENE (GENETICS ENGENEERING) QUY TRÌNH TIẾN HÀNH • Bước 1: Nuôi tế bào chủ tế bào cho • Bước 2: Tách DNA plasmind DNA tế bào cho • Bước 3: Cắt DNA plasmid DNA mục tiêu • Bước 4: Nối loại DNA enyme nối tạo DNA tái tổ hợp hoàn chỉnh • Bước 5: Chuyển DNA tái tổ hợp vào tế bào nhận (thường vi khuẩn E.coli) • Bước 6: Chọn lọc nhân dòng vi khuẩn mang gene tái tổ hợp • Bước 7: Nghiên cứu điều kiện để gene biểu sản phẩm Các vector chuyển gene Plasmid: - DNA vòng tròn - Sao chép độc lập tế bào - Có khả mang số gene có khả biểu thành protein Vector: - Có khả tự tái - Tồn độc lập tế bào - Mang gene mong muốn Hệ thống tế bào chủ (Host) Mục đích: - Nhân nuôi tạo số lượng lớn dùng cho thí nghiệm tạo dòng - Biểu gene - Sản xuất protein tái tổ hợp 3 Hệ thống tế bào chủ (Host) 3.1 Escherichia coli (E.coli) - Dễ nuôi cấy nhân dòng - Dễ chấp nhận loại vector khác - Vi khuẩn Gram-, hình que, - Bộ gene khoảng 4,6x10(6) cặp base 3.2 Saccharomyces cerevisiae - Đối tượng nghiên cứu vi sinh vật Eukaryote - Phân lập nhiều promotor hoạt động mạnh - Thực biến đổi sau dịch mã tạo protein có đủ hoạt tính sinh học - Sản xuất protein tái tổ hợp - Sinh vật an toàn Hệ thống tế bào chủ (Host) 3.3 Hệ thống tế bào thực vật 3.4 Hệ thống tế bào động vật - Tế bào thận khỉ xanh châu Phi (COS- African green monkey kidney) - Tế bào thận chuột đồng (BHK- Baby hamster kidney) - Tế bào thận phôi người (HEK-239- Human embryonic kidney - Tế bào tử cung chuột bạch (CHO-Chinese hamster ovary) - Tế bào côn trùng nuôi baculovirus biều protein người - Tế bào tuyến trùng Caenorhabditis elegans Kỹ thuật phương pháp Lai nucleic acid - Tách chiết tinh DNA RNA - Điện di gel Wells Large Small + Kỹ thuật phương pháp Lai nucleic acid - Lai pha rắn Dot slot blot dùng cho RNA DNA Kỹ thuật phương pháp Lai nucleic acid - Lai pha rắn - Lai chổ (in situ hybridisation): nghiên cứu nucleic acid chổ không cần phải tách chiết Kỹ thuật phương pháp Thu nhận gene - Thu nhận DNA từ gene * Shotgun * Ngân hàng/thư viện DNA gene (Bank/Library of genomic DNA) - Tổng hợp gene phương pháp hóa học - Lập ngân hàng c-DNA * Chứa trình tự mã hóa liên tục gene (no intron) * Xác định dòng gene muốn nghiên cứu : EX: hemoglobine Kỹ thuật phương pháp Thu nhận gene - Thu nhận DNA từ gene - Tổng hợp gene phương pháp hóa học - Lập ngân hàng c-DNA * Chứa trình tự mã hóa liên tục gene (no intron) * Xác định dòng gene muốn nghiên cứu : EX: hemoglobine Kỹ thuật phương pháp Tạo plasmid tái tổ hợp a) Dùng đầu so le Kỹ thuật phương pháp Tạo plasmid tái tổ hợp a) Dùng đầu so le b) Dùng đoạn nối (linkers) Kỹ thuật phương pháp Tạo plasmid tái tổ hợp a) Dùng đầu so le b) Dùng đoạn nối (linkers) c) Dùng enzyme terminal transferase Kỹ thuật phương pháp Biến nạp DNA tái tổ hợp vào tế bào a) Hóa biến nạp Tế bào vi khuẩn plasmid có khả dung nạp (competent cell) Ủ hỗn hợp, xử lý CaCl2 lạnh + sốc nhiệt (42oC, phút) Kỹ thuật phương pháp Biến nạp DNA tái tổ hợp vào tế bào a) Hóa biến nạp b) Điện biến nạp (electroporation) Kỹ thuật phương pháp Biến nạp DNA tái tổ hợp vào tế bào a) Hóa biến nạp b) Điện biến nạp (electroporation) c) Vi tiêm (micro-injection) d) Bắn gene Kỹ thuật phương pháp Chọn lọc, tạo dòng biểu gene a) Xác định dòng vi khuẩn chứa plasmid tái tổ hợp b) Tạo dòng c) Sự biểu gene tạo dòng Vector biểu Yêu cầu: Số lượng hợp lý cho tế bào Promotor biểu Trình tự bám vào ribosome (rbs) DNA phụ cho dịch mã tốt Sự ổn định lâu dài Tránh thủy giải protein (proteolysis) enzyme tế bào Ứng dụng công nghệ gene Khai thác DNA gene 1.1 Genomics: Xác định trình tự nucleotide gene chức chúng Phát hiện, bảo tồn đa dạng sinh học, sử dụng chúng 1.2 Proteomics Nghiên cứu cấu hình (conformation), vị trí (localization), biến đổi (modification), tương tác (interactions), chức (function) Tạo hormone, vaccin tái tổ hợp dùng chữa trị bệnh 1.3 Human Genome Projet 1.4 Các ngành học khác Cellomics Metabolomics Ionomics Ứng dụng công nghệ gene Khai thác DNA gene Công nghệ RNA rRNA, mRNA, tRNA Thụ động - ribozyme Slipcing Antisense RNA Interfering RNA microRNA Các ribozyme RNAi, microRNA Postranscriptional regulation Mạng lưới RNA Công nghệ RNA Ứng dụng công nghệ gene Khai thác DNA gene Công nghệ RNA Công nghệ protein tái tổ hợp - Sản xuất r-protein STT Sản phẩm Các bệnh điều trị Năm hết patent Insulin Tiểu đường 2001 Interferon alpha Viêm gan siêu vi B, ung thư, 2002 Interferon beta Xơ cứng 2003 Hormon tăng tưởng người Thiểu tăng trưởng 2003 Erythropoetin Thiếu máu 2004 T-PA (tissu plasminogen activator) Nhồi máu tim 2005 G-CSF (granulocyte – COLONY Stimulating Factor Chemotherapy-induced neutropenia 2006 Ứng dụng công nghệ gene - Khai thác DNA gene Công nghệ RNA Công nghệ protein tái tổ hợp Sản xuất r-protein Chế tạo protein * Nối đoạn gene tạo protein dung hợp (fusion protein) * Làm đoạn tăng đoạn gene * Thay nucleotide Ứng dụng công nghệ gene - Khai thác DNA gene Công nghệ RNA Công nghệ protein tái tổ hợp Chẩn đoán phân tử Dựa phương pháp lai DNA DNA marker Biomarker DNA fingerprinting Micro array Biochips Vi sinh vật chuyển gene Thực vật chuyển gene Động vật chuyển gene Ứng dụng công nghệ gene Khai thác DNA gene Công nghệ RNA Công nghệ protein tái tổ hợp Chẩn đoán phân tử Vi sinh vật chuyển gene Thực vật chuyển gen Động vật chuyển gene Công nghệ gene sức khỏe người Xét nghiệm SNP (Single Nucleotide Polymorphism) * Thiết kế thuốc cho bệnh nhân * Nhận dạng nhóm bệnh, xác định phương thức điều trị Pharmacogenomics: Cung cấp cách chữa bệnh an toàn hiệu cho cá nhân Gene therapy: * Dùng rprotein bổ sung enzyme * Thay gene [...]... đoạn hoặc tăng đoạn gene * Thay thế nucleotide Ứng dụng công nghệ gene 1 2 3 4 - Khai thác DNA các bộ gene Công nghệ RNA Công nghệ protein tái tổ hợp Chẩn đoán phân tử Dựa trên phương pháp lai DNA DNA marker Biomarker DNA fingerprinting Micro array và Biochips 5 Vi sinh vật chuyển gene 6 Thực vật chuyển gene 7 Động vật chuyển gene Ứng dụng công nghệ gene 1 Khai thác DNA các bộ gene 2 Công nghệ RNA... Projet 1.4 Các ngành học khác Cellomics Metabolomics Ionomics Ứng dụng công nghệ gene 1 2 Khai thác DNA các bộ gene Công nghệ RNA rRNA, mRNA, tRNA Thụ động - ribozyme Slipcing Antisense RNA Interfering RNA và microRNA Các ribozyme RNAi, microRNA Postranscriptional regulation Mạng lưới RNA Công nghệ RNA Ứng dụng công nghệ gene 1 Khai thác DNA các bộ gene 2 Công nghệ RNA 3 Công nghệ protein tái tổ hợp - Sản... bào Ứng dụng công nghệ gene 1 Khai thác DNA các bộ gene 1.1 Genomics: Xác định trình tự nucleotide của bộ gene và chức năng của chúng Phát hiện, bảo tồn sự đa dạng sinh học, sử dụng chúng 1.2 Proteomics Nghiên cứu cấu hình (conformation), vị trí (localization), các biến đổi (modification), sự tương tác (interactions), chức năng (function) Tạo hormone, vaccin tái tổ hợp dùng chữa trị bệnh 1.3 Human Genome... sinh vật chuyển gene 6 Thực vật chuyển gen 7 Động vật chuyển gene 8 Công nghệ gene đối với sức khỏe con người Xét nghiệm SNP (Single Nucleotide Polymorphism) * Thiết kế thuốc cho từng bệnh nhân * Nhận dạng từng nhóm bệnh, xác định phương thức điều trị Pharmacogenomics: Cung cấp cách chữa bệnh an toàn và hiệu quả cho từng cá nhân Gene therapy: * Dùng rprotein hoặc bổ sung enzyme * Thay thế gene ... beta Xơ cứng 2003 4 Hormon tăng tưởng người Thiểu năng tăng trưởng 2003 5 Erythropoetin Thiếu máu 2004 6 T-PA (tissu plasminogen activator) Nhồi máu cơ tim 2005 7 G-CSF (granulocyte – COLONY Stimulating Factor Chemotherapy-induced neutropenia 2006 Ứng dụng công nghệ gene 1 2 3 - Khai thác DNA các bộ gene Công nghệ RNA Công nghệ protein tái tổ hợp Sản xuất r-protein Chế tạo protein * Nối các đoạn gene tạo...Kỹ thuật và phương pháp căn bản 2 Thu nhận gene - Thu nhận DNA từ bộ gene - Tổng hợp gene bằng phương pháp hóa học - Lập ngân hàng c-DNA * Chứa trình tự mã hóa liên tục của một gene (no intron) * Xác định đúng dòng gene muốn nghiên cứu : EX: hemoglobine Kỹ thuật và phương pháp căn bản 3 Tạo plasmid tái tổ hợp a) Dùng đầu so le Kỹ... Bắn gene Kỹ thuật và phương pháp căn bản 5 Chọn lọc, tạo dòng và sự biểu hiện gene a) Xác định dòng vi khuẩn chứa plasmid tái tổ hợp b) Tạo dòng c) Sự biểu hiện của gene được tạo dòng Vector biểu hiện Yêu cầu: Số lượng hợp lý bản sao cho mỗi tế bào Promotor biểu hiện Trình tự bám vào ribosome (rbs) và DNA phụ cho dịch mã tốt Sự ổn định lâu dài Tránh sự thủy giải protein (proteolysis) do các enzyme trong