Luận văn nghiên cứu ứng dụng vật liệu nano từ trong chẩn đoán và điều trị khối u thực nghiệm

71 756 0
Luận văn nghiên cứu ứng dụng vật liệu nano từ trong chẩn đoán và điều trị khối u thực nghiệm

Đang tải... (xem toàn văn)

Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống

Thông tin tài liệu

Luận văn Thạc sỹ Khoa học Sinh học thực nghiệm MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1.Những khái niệm hạt nano từ ứng dụng 1.1.1 Vật liệu nano 1.1.2 Hạt nano từ 1.1.3 Ứng dụng hạt nano từ lĩnh vực sinh y học 1.1.3.1 Tách, phân lập tế bào thực thể sinh học khỏi môi trường hỗn hợp .7 1.1.3.2 Dẫn truyền thuốc, gen nuclide phóng xạ tới mô đích 1.1.3.3 Tăng độ tương phản ảnh phương pháp chẩn đoán chụp cộng hưởng từ .12 1.1.3.4 Liệu pháp nhiệt – từ điều trị ung thư 13 1.2.Chụp cộng hưởng từ hạt nhân (MRI) 20 1.2.1 Lịch sử phát triển kĩ thuật chụp cộng hưởng từ hạt nhân 20 1.2.2 Nguyên lý kỹ thuật chụp cộng hưởng từ hạt nhân (MRI) .21 1.2.3 Ưu điểm chụp cộng hưởng từ hạt nhân (MRI) .25 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1 Đối tượng nghiên cứu 26 2.1.1 Chuột nhắt trắng (Mus muscullus) dòng Swiss 26 2.1.2 Một số dòng tế bào ung thư tế bào lành 26 2.1.2.1 Các dòng tế bào ung thư .26 2.1.2.2 Tế bào lành Fibroblast 27 2.1.3 Vật liệu nano từ (hay chất lỏng từ) .27 2.2 Hóa chất dụng cụ thí nghiệm 28 2.2.1 Môi trường nuôi cấy 28 2.2.2 Hóa chất 28 2.2.3 Máy móc thiết bị 28 2.2.4 Vật tư tiêu hao 29 2.3 Phương pháp nghiên cứu 29 2.3.1 Phương pháp tạo u rắn da đùi cho chuột nhắt trắng Swiss cấy ghép dòng tế bào Sarcoma 180 29 Phạm Thị Hà Giang 2010) Cao học 17 (2008- Luận văn Thạc sỹ Khoa học Sinh học thực nghiệm 2.3.1.1 Tạo u rắn da 30 2.3.1.2 Tạo u đùi .30 2.3.2 Phương pháp khảo sát độc tính dung dịch nano từ H01 E6 dòng tế bào ung thư nguyên bào sợi 30 2.3.3 Phương pháp khảo sát khả tạo tương phản ảnh H01 kỹ thuật chụp cộng hưởng từ hạt nhân (MRI) 31 2.3.4 Kỹ thuật tiêm tĩnh mạch .32 2.3.5 Phương pháp khảo sát hiệu ứng đốt nhiệt – từ ex vivo .33 2.3.5.1 Khảo sát hiệu ứng đốt nhiệt - từ mẫu E6 .33 2.3.5.2 Phương pháp khảo sát hiệu ứng đốt – nhiệt từ ex vivo 33 2.3.6 Phương pháp khảo sát phân bố nguyên tố sắt (nguồn gốc vật liệu từ) số quan khối u chuột Swiss 34 2.3.6.1 Bằng phương pháp đốt nhiệt từ 34 2.3.6.2 Bằng máy quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) 35 2.3.7 Liệu pháp gia nhiệt in vivo 37 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39 3.1 Kết gây tạo u rắn da u đùi chuột Swiss 39 3.1.1 Kết gây tạo u rắn da .39 3.1.2 Kết gây u đùi chuột Swiss 39 3.2 Kết khảo sát độc tính chất lỏng nano từ H01 E6 dòng tế bào ung thư nguyên bào sợi 40 3.2.1 Kết xác định độc tính H01 41 3.2.2 Kết xác định độc tính E6 43 3.3 Kết khảo sát khả tạo tương phản ảnh H01 kỹ thuật chụp cộng hưởng từ hạt nhân (MRI) 46 3.4 Kết khảo sát liệu pháp đốt nhiệt từ sử dụng mẫu E6 47 3.4.1 Kết hiệu ứng đốt nhiệt từ mẫu E6 47 3.4.2 Kết gia nhiệt ex vivo hạt từ E6 49 3.4.3 Kết khảo sát phân bố nguyên tố sắt (nguồn gốc vật liệu từ) số quan khối u 52 3.4.3.1 Kết khảo sát phân bố nguyên tố sắt (nguồn gốc vật liệu từ) số quan phương pháp đốt nhiệt từ .53 3.4.3.2 Kết khảo sát phân bố nguyên tố sắt (nguồn gốc vật liệu từ) số Phạm Thị Hà Giang 2010) Cao học 17 (2008- Luận văn Thạc sỹ Khoa học Sinh học thực nghiệm quan khối u máy phân tích quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) 54 3.4.4 Kết khảo sát liệu pháp đốt – nhiệt từ in vivo 56 KẾT LUẬN 60 KIẾN NGHỊ 61 TÀI LIỆU THAM KHẢO 63 Phạm Thị Hà Giang 2010) Cao học 17 (2008- Luận văn Thạc sỹ Khoa học Sinh học thực nghiệm DANH MỤC VIẾT TẮT VIẾT TẮT AAS AEH CHHBM CLT DIH DMEM FBS IH MRI PBS PEG PVA Phạm Thị Hà Giang VIẾT ĐẦY ĐỦ Atomic absorption spectrometry Arterial embolization hyperthermia Chất hoạt hoá bề mặt Chất lỏng tử Direct injection hyperthermia Dulbecco's modified Eagle's medium Fetal bovine serum Intracellular hyperthermia Magnetic resonance imaging Phosphate buffered saline Polyethylene glyco Polyvinyl acetate Cao học 17 (2008-2010) Luận văn Thạc sỹ Khoa học Sinh học thực nghiệm DANH MỤC BẢNG Bảng Một số dòng tế bào ung thư sử dụng luận văn đặc điểm chúng 26 Bảng Nồng độ hạt từ E6 thí nghiệm khảo sát hiệu ứng đốt nhiệt từ in vitro 33 Bảng Bố trí thí nghiệm gia nhiệt ex vivo khối u rắn da chuột Swiss 33 Bảng Bố trí thí nghiệm gia nhiệt in vivo chuột thí nghiệm .37 Bảng Tỷ lệ sống (%) dòng tế bào ung thư tế bào lành sau ủ với hạt từ H01 nồng độ khác 42 Bảng Tỷ lệ sống (%) dòng tế bào ung thư gan HepG2 tế bào lành sau ủ với hạt từ E6 nồng độ (ng/1 tế bào) khác .45 Bảng Giá trị nhiệt độ bão hoà (Tbh) tốc độ tăng nhiệt độ ban đầu (dT/dt) 48 Bảng Nhiệt độ ban đầu nhiệt độ bão hòa khối u trình gia nhiệt 50 Bảng Nhiệt độ bão hòa nội quan chuột A B sau gia nhiệt 30 phút (oC), nhiệt độ ban đầu 30oC 53 Bảng 10 Hàm lượng sắt có 1g mẫu quan tách từ chuột A chuột B (ngFe/1g mẫu) 55 Hình Minh hoạ nguyên lý sử dụng hạt nano từ từ trường để tách thực thể sinh vật [29] Hình Minh hoạ nguyên lý vận chuyển tập trung thuốc [4] Hình Cấu trúc hệ nano – thuốc Hình Minh hoạ trình đốt nhiệt sử dụng hạt nano từ 13 Hình Quá trình phát triển khổi u thể chuột thí nghiệm Yanase cộng [35] 17 Hình Thiết bị MFH-300F (công ty MagForce) dùng nhiệt – từ trị [21] 20 Hình Hình ảnh chụp cộng hưởng từ chẩn đoán ung thư 21 Hình Sự tạo thành vector từ hoá thực .23 Hình Vector từ hoá ngang vuông góc với Oz .23 Hình 10 Chuột nhắt trắng Swiss 26 Hình 11 Ảnh SEM mẫu E6 – dung dịch hạt nano từ Fe3O4 bọc Copolime poli (axit acrylic – styrene), hạt có kích thước khoảng 100nm 28 Hình 12 Máy chụp cộng hưởng từ 1.5T (MRI 1.5 Gyroscan Philips) .32 Phạm Thị Hà Giang Cao học 17 (2008-2010) Luận văn Thạc sỹ Khoa học Sinh học thực nghiệm Hình 13.Hệ thống máy phát từ trường RDO, moel HFI (Mỹ) 34 Hình 14 Hình ảnh máy quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) (Shimadzu – Nhật Bản) 36 Hình 15 Hình ảnh khối u rắn da sau ngày (A), 10 ngày (B) 17 ngày (C) cấy truyền 39 Hình 16 Khối u đùi gây chuột Swiss .40 Hình 17 Ảnh hiển vi quang học tế bào MCF7 trước (a) sau bổ sung hạt từ H01 nồng độ 0.1ng/1 tế bào (b) (TK 10 x VK 40 x zoom 5.6) .41 Hình 18 Hình ảnh tế bào HepG2 bổ sung hạt từ H01 nồng độ khác (TK 10 x VK 20 x zoom 5.6) .42 Hình 19 Hình ảnh chuột mang u đùi tiêm tĩnh mạch 150µl hạt từ H01 sau 15 ngày 43 Hình 20 Hình ảnh tế bào HepG2 bổ sung hạt từ E6 với nồng độ khác ủ (TK10 x VK 20 x zoom 4x) .44 Hình 21 Ảnh chụp cộng hưởng từ chuột A, B C, (1) – hình ảnh cắt từ trước sau (2) hình ảnh cắt từ phải sang trái 46 Hình 22 Hình ảnh khối u chuột B C 47 Hình 23 Các đường tăng nhiệt độ mẫu chất lỏng từ E6 nồng độ khác với cường độ từ trường 60Oe, tần số dòng xoay chiều 236 kHz 48 Hình 24 Các đường tăng nhiệt độ khối u ex vivo tách từ chuột TN với IB = 60 Oe, fx = 236 kHz 51 Hình 25 Các đường tăng nhiệt độ quan tách từ chuột thí nghiệm A – 60 phút B – 180 phút với IB = 60 Oe, fx = 236 kHz 53 Hình 26 Hình ảnh chuột A – Đối chứng sinh học 56 Hình 27 Ảnh chuột B - chuột đối chứng ung thư 56 Hình 28 Hình ảnh chuột đối chứng không tiêm hạt từ có chiếu từ trường (chuột C) 18 ngày theo dõi 56 Hình 29 Hình ảnh chuột tiêm hạt từ E6 liều 400µg/lần x lần không dược chiếu từ trường (chuột D) 13 ngày theo dõi 57 Hình 30 Hình ảnh chuột tiêm hạt từ E6 liều 300µg/lần x lần điều trị liệu pháp gia nhiệt (chuột E) 21 ngày theo dõi 58 Hình 31 Hình ảnh chuột tiêm hạt từ E6 liều 400µg/lần x lần điều trị liệu pháp gia nhiệt (chuột F) 22 ngày theo dõi 58 Phạm Thị Hà Giang Cao học 17 (2008-2010) Luận văn Thạc sỹ Khoa học Sinh học thực nghiệm MỞ ĐẦU Ung thư mối đe dọa toàn cầu, thách thức hệ thống y tế quốc gia với hàng chục triệu ca mắc bệnh, khoảng triệu người chết năm Tổ chức Y tế giới (WHO) khuyến cáo bệnh có khả gây tử vong hàng đầu giới kỷ XXI Riêng Việt Nam, chuyên gia cho biết, ước tính, năm nước ta có thêm khoảng 200.000 người mắc bệnh khoảng 100.000 người tử vong Ung thư nguyên nhân hàng đầu gây tử vong giới Việt Nam nhiều thập kỉ tới Chính việc tìm phương pháp chẩn đoán sớm điều trị ung thư có hiệu cao yêu cầu cấp bách đặt cho toàn thể nhân loại Các phương pháp điều trị ung thư truyền thống phẫu thuật, hóa trị, xạ trị, nội tiết điều trị hay miễn dịch điều trị mang lại nhiều kết tiêu diệt hạn chế phát triển khối u giết chết không mô lành gây nguy hại không nhỏ đến sức khỏe người bệnh Nguyên nhân tượng phần lớn phương thức điều trị không tác động cục lên khối u mà ảnh hưởng đến phận lớn mô quan lành thể Vì nhiệm vụ quan trọng hàng đầu nhà khoa học cần tìm phương pháp chữa trị ung thư cho vừa hiệu mà lại gây độc thể Ngày công nghệ vật liệu thay làm thay đổi sống nhờ vào khả can thiệp người kích thước nm Vật liệu nano thể nhiều tính chất đặc biệt lý thú Một nhánh quan trọng công nghệ nano, lý sinh y học nano, đó, vật liệu nano sử dụng để chẩn đoán điều trị bệnh Ở Việt Nam hạt nano có từ tính nhà khoa học thuộc viện Khoa học Vật liệu chế tạo để ứng dụng vào điều trị ung thư phương pháp gia nhiệt (hyperthermotherapy) Hạt nano từ làm từ Fe 3O4 thường bọc số vật liệu dextran, carboxydextran, tinh bột (starch), chitosan…để làm tăng phân bố đồng chất lỏng từ tăng tính tương hợp sinh học Phạm Thị Hà Giang Cao học 17 (2008-2010) Luận văn Thạc sỹ Khoa học Sinh học thực nghiệm đưa vào thể sống Khi hạt nano từ tập trung vùng thể, tác động từ trường xoay chiều tăng nhiệt độ vùng lên tới 50oC, sở liệu pháp nhiệt trị ung thư Tác dụng nhiệt chữa bệnh (nhiệt trị) người biết sử dụng từ cách lâu Nhiệt trị xem liệu pháp đầy triển vọng việc chữa trị ung thư, đặc biệt kết hợp với hoá trị xạ trị Liệu pháp dựa tác dụng ngăn chặn phát triển tế bào ung thư nhiệt độ cục khối u đẩy lên 42 oC, không ảnh hưởng tới tế bào lành xung quanh Hiện nay, nghiên cứu tập trung vào khắc phục hai khó khăn mà phương pháp nhiệt trị vấp phải để thu tác dụng triệt để khối u ung thư, (i) tập trung nhiệt lượng cục vị trí khối u (ii) điều khiển, khống chế nhiệt độ vùng có khối u cách xác Bên cạnh việc điều trị chẩn đoán sớm xuất ung thư coi mơ ước nhà khoa học Chẩn đoán ung thư giai đoạn sớm có khả cao điều trị dứt điểm bệnh quái ác mà không gây ảnh hưởng nhiều đến sức khỏe ngăn cản kịp thời di tế bào ác tính Chụp cộng hưởng từ hay MRI (Magnetic Resonance Imaging) kỹ thuật chẩn đoán y khoa tạo hình ảnh giải phẫu thể nhờ sử dụng từ trường sóng radio Phương pháp không sử dụng tia X nên có độ an toàn cao cho bệnh nhân Máy chụp cộng hưởng từ thiết bị nhạy cảm đa giúp ta thấy hình ảnh lớp cắt phận thể từ nhiều góc độ khoảng thời gian ngắn Sự chi tiết làm cho MRI trở thành công cụ vô giá chẩn đoán thời kì đầu việc đánh giá khối u thể Nhất có xuất hạt nano từ vị trí khối u, ta có hình ảnh chẩn đoán rõ nét nhờ vào khả gây tương phản hình ảnh chúng Xuất phát từ yêu cầu để góp phần đưa hạt nano từ sản xuất Việt Nam vào ứng dụng điều trị ung thư, nhận để tài “Nghiên cứu ứng dụng vật liệu nano từ chẩn đoán điều trị khối u thực Phạm Thị Hà Giang Cao học 17 (2008-2010) Luận văn Thạc sỹ Khoa học Sinh học thực nghiệm nghiệm” làm đề tài luận văn cao học nhằm thực số nhiệm vụ sau: Xác định độc tính chất lỏng từ lên số dòng tế bào ung thư Fibroblast Khảo sát khả tạo tương phản ảnh hạt nano từ phương pháp chụp cộng hưởng từ hạt nhân (MRI) Thử liệu pháp nhiệt trị mô hình ung thư thực nghiệm Đề tài thực Bộ môn Tế bào – Mô – Phôi Lý sinh, khoa Sinh học, môn Thổ nhưỡng Môi trường Đất, khoa Môi trường, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, phòng Nano Y sinh, viện Khoa học Vật liệu, trung tâm Khoa học Tự nhiên Công nghệ Quốc Gia Bệnh viện Quân đội Trung ương 108 Kết đề tài sở để đẩy mạnh thêm nghiên cứu nhằm ứng dụng hạt nano từ phương pháp chụp cộng hưởng từ hạt nhân vào việc chẩn đoán điều trị ung thư bệnh nhân Phạm Thị Hà Giang Cao học 17 (2008-2010) Luận văn Thạc sỹ Khoa học Sinh học thực nghiệm CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Những khái niệm hạt nano từ ứng dụng 1.1.1 Vật liệu nano Vật liệu nano vật liệu chiều có kích thước nm Dựa vào hình dáng vật liệu, người ta phân chia thành loại sau: - Vật liệu nano không chiều (cả ba chiều có kích thước nano, không chiều tự cho điện tử), ví dụ đám nano, hạt nano… - Vật liệu nano chiều vật liệu hai chiều có kích thước hạt nano, điện tử tự chiều (hai chiều cầm tù), ví dụ dây nano, ống nano… - Vật liệu nano hai chiều vật liệu chiều có kích thước nano, hai chiều tự do, ví dụ màng mỏng… - Ngoài có vật liệu cấu trúc nano hay nanocomposite, có phần vật liệu có kích thước nano, cấu trúc có nano không chiều, chiều, hai chiều đan xen lẫn Ngoài cách phân loại vật liệu nano dựa vào hình dáng vật liệu, người ta phân loại dựa vào độ cảm từ Bất vật liệu kim loại có hưởng ứng với từ trường ngoài, thể độ từ hoá (từ độ, M) Tỷ số c = M/H gọi độ cảm từ, H cường độ từ trường Tuỳ thuộc vào giá trị độ cảm từ phân làm loại vật liệu từ khác • Vật liệu có c nhỏ nhiều so với (xấp xỉ -10 -6) gọi vật liệu nghịch từ • Vật liệu có c xấp xỉ (chênh lệch khoảng 10 -6) gọi vật liệu thuận từ • Vật liệu có c với giá trị lớn so với vật liệu sắt từ [14] Ngoài độ cảm từ, nhiều thông số khác quan trọng việc xác định tính chất vật liệu, ví dụ như: từ độ bão hoà (từ độ đạt cực đại từ trường Phạm Thị Hà Giang Cao học 17 (2008-2010) Luận văn Thạc sỹ Khoa học M4 - Sinh học thực nghiệm 1500 31 35 Khi chiếu từ trường với khối u thu đường cong tăng nhiệt Hình 23 biểu thị tổng hợp đường tăng nhiệt Hình 24 Các đường tăng nhiệt độ khối u ex vivo tách từ chuột TN với IB = 60 Oe, fx = 236 kHz Từ bảng hình 24, rút số nhận xét sau: • Mẫu đối chứng M1 nhiệt độ hoàn toàn không thay đổi suốt trình gia nhiệt • mẫu tiêm hạt từ trực tiếp vào khối u M2 M3 nhiệt độ tăng lên nhiều Nhiệt độ ban đầu 31oC, sau tăng dần theo thời gian gia nhiệt, mẫu chênh lệch nhiệt độ bão hòa không đáng kể, xấp xỉ Phạm Thị Hà Giang Cao học 17 (2008-2010) 51 Luận văn Thạc sỹ Khoa học Sinh học thực nghiệm 42oC Nhiệt độ đủ để tiêu diệt tế bào ung thư mà không ảnh hưởng tới tế bào lành xung quanh Ở chuột tiêm trực tiếp hạt từ chắn có mặt khối u, gia nhiệt, nhiệt độ tăng lên điều dễ hiểu Giữa M2 (tiêm 400 µg hạt từ) M3 (tiêm 300 µg hạt từ), nhiệt độ cực đại chênh lệch không đáng kể, lượng hạt từ tiêm vào xấp xỉ • mẫu tiêm ven M4 với lượng hạt từ 1500 µg, nhiệt độ có gia tăng từ 31oC lên 35oC Điều chứng tỏ hạt từ có mặt khối u, lượng nhỏ Vì tăng lượng hạt từ lên 2000 µg tăng thời gian lên 60 phút nhiệt độ khối u tăng lên Từ kết trên, nhận thấy tiêm ven hạt từ có mặt khối u, Một câu hỏi đăt hạt từ sau tiêm ven theo đường máu đến phân bố phận thể chuột Để trả lời cho câu hỏi tiến hành thí nghiệm khảo sát phân bố nguyên tố sắt số quan khối u 3.4.3 Kết khảo sát phân bố nguyên tố sắt (nguồn gốc vật liệu từ) số quan khối u Các khối u ung thư người đa số nằm sâu bên thể, để đưa loại thuốc nói chung hạt từ nói riêng đến khối u để chữa trị, thông thường cần phải sử dụng kỹ thuật tiêm tĩnh mạch Theo kết thí nghiệm gia nhiệt ex vivo, tiêm ven 1500µg E6 để thời gian 30 phút nhiệt độ khối u chiếu từ trường 30 phút tăng từ 31 oC lên 35oC Tuy nhiên lượng nhiệt tăng lên thấp, không đủ để tiêu diệt tế bào ung thư Và điều chứng tỏ sau tiêm ven, hạt từ theo đường máu đến quan khác thể, không tập trung khối Chính cần tiến hành khảo sát phân bố nguyên tố sắt số quan khối u sau tiêm ven Phạm Thị Hà Giang Cao học 17 (2008-2010) 52 Luận văn Thạc sỹ Khoa học Sinh học thực nghiệm 3.4.3.1 Kết khảo sát phân bố nguyên tố sắt (nguồn gốc vật liệu từ) số quan phương pháp đốt nhiệt từ chuột Swiss mang khối u rắn da, chuột A – tiêm ven 2000µg hạt từ E6 để thời gian 60 phút, B - tiêm ven 2000µg hạt từ E6 để thời gian 180 phút Sau tách lấy phận, chiếu từ trường 30 phút đo nhiệt độ Kết đo nhiệt độ cho phép dự đoán tiêm ven, hạt từ theo đường máu đến phân bố quan đâu nhiều Bảng Nhiệt độ bão hòa nội quan chuột A B sau gia nhiệt 30 phút (oC), nhiệt độ ban đầu 30oC Chuột A (60 phút) B (180 phút) Gan 49.1 51.25 Phổi 49 44.14 Lách 38.9 42.65 U 37.3 40.04 Thận 37 37.09 Cơ quan Hình 25 Các đường tăng nhiệt độ quan tách từ chuột thí nghiệm A – 60 phút B – 180 phút với IB = 60 Oe, fx = 236 kHz Phạm Thị Hà Giang Cao học 17 (2008-2010) 53 Luận văn Thạc sỹ Khoa học Sinh học thực nghiệm Từ kết bảng hình 25 rút số nhận xét sau: - Nhiệt độ quan gan, phổi, lách, u thận chuột A B tăng lên, tức hạt từ theo đường tĩnh mạch đuôi đến quan - Sau gia nhiệt 30 phút, nhiệt độ gan chuột A B cao nhất, sau đến phổi, lách, u, thấp thận Điều chứng tỏ tiêm ven, hạt từ tập trung nhiều gan thấp thận Đặc biệt nhiệt độ khối u tăng lên, có nghĩa hạt từ theo đường tĩnh mạch đến tập trung khối u, không nhiều số quan khác gan hay phổi Điều giúp có hy vọng đưa hạt từ vào khối u nằm sâu bên thể đường tiêm tĩnh mạch - So sánh chuột A chuột B ta thấy sau tiêm tĩnh mạch để thời gian lâu nhiệt độ gan, lách u tăng lên, có phổi giảm đi, thận gần không thay đổi chứng tỏ để thời gian lâu hạt từ tiếp tục theo đường máu đến quan phân bố hạt từ quan khác Khi để thời gian tăng từ 60 phút lên 180 phút nhiệt độ bão hoà khối u tăng từ 37.3oC lên 40.04 oC Nhưng bên cạnh nhiệt độ quan khác lại không giảm mà tăng lên Điều có nghĩa muốn dùng kỹ thuật tiêm tĩnh mạch đưa hạt từ đến khối u để gia nhiệt phải tìm biện pháp ngăn cản không cho hạt từ đến quan khác nữa, gia nhiệt không làm ảnh hưởng đến tế bào lành 3.4.3.2 Kết khảo sát phân bố nguyên tố sắt (nguồn gốc vật liệu từ) số quan khối u máy phân tích quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) Phương pháp khảo sát phân bố nguyên tố sắt (nguồn gốc vật liệu từ) số quan khối u chuột Swiss đốt nhiệt từ cho biết nhiệt độ bão hoà mà biết xác hàm lượng sắt có nội quan Chính sau làm thí nghiệm mục 2.3.6.1 tiến hành thí nghiệm xác định hàm lượng sắt có khối u số quan máy quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) Phạm Thị Hà Giang Cao học 17 (2008-2010) 54 Luận văn Thạc sỹ Khoa học Sinh học thực nghiệm Sau gây u rắn da thành công chuột Swiss, tới ngày thứ chọn chuột có kích thước khối u tương đồng nhau, chuột A- đối chứng ung thư, chuột B – tiêm ven 2000µg hạt từ E6, sau 60 phút tách lấy quan gan, phổi, lách, u, thận Tiến hành tro hóa nội quan này, thu dung dịch suốt, lấy 1ml dung dịch đo máy quang phổ hấp thụ nguyên tử xác định hàm lượng sắt có mẫu Tính toán theo công thức trình bày mục 2.3.6.2, thu kết bảng 10: Bảng 10 Hàm lượng sắt có 1g mẫu quan tách từ chuột A chuột B (ngFe/1g mẫu) Chuột A - đối chứng ung B - tiêm ven 2000µg thư hạt từ E6, để 60 phút Gan 0.15 Phổi 0.06 Lách 0.03 U 0.015 Thận 0.000012 Cơ quan Nhìn bảng 10, ta thấy sau tiêm ven 60 phút, lượng hạt từ E6 có mặt nhiều gan, sau tới phổi, lách, khối u thấp thận Điều hoàn toàn phù hợp với kết trình bày mục 3.4.3.1, theo đốt – nhiệt từ nhiệt độ gan cao nhất, sau tới phổi, lách, khối u thấp thận Hàm lượng hạt từ có 1g khối u 0.015 ng, lượng nhỏ chứng tỏ đưa hạt từ đến khối u kỹ thuật tiêm tĩnh mạch Điều quan trọng phải tìm phương pháp nhằm đưa số lượng hạt từ đến khối u lớn nhất, lượng hạt từ đến quan khác không đáng kể, có chiếu từ trường không làm ảnh hưởng tới tế bào lành Phạm Thị Hà Giang Cao học 17 (2008-2010) 55 Luận văn Thạc sỹ Khoa học Sinh học thực nghiệm 3.4.4 Kết khảo sát liệu pháp đốt – nhiệt từ in vivo Mục đích cuối quan trọng toàn nghiên cứu tiêm hạt từ E6 vào khối u, gia nhiệt khối u tiêu giảm Từ thí nghiệm gia nhiệt ex vivo, nhận thấy sau tiêm trực tiếp 300 - 400µg hạt từ E6 vào khổi u (đã tách rời thể) tiến hành gia nhiệt (60 Oe, 236 kHz) nhiệt độ khối u tăng lên 11 oC (từ 31 lên 42 oC) Nhiệt độ đủ giết chết tế bào ung thư mà không làm ảnh hưởng tới tế bào lành xung quanh Kết tạo tiền đề để tiến hành thí nghiệm gia nhiệt in vivo chuột Swiss mang u rắn da Toàn kết thí nghiệm ghi lại hình ảnh Gọi ngày gia nhiệt ngày Hình 26 Hình ảnh chuột A – Đối chứng sinh học Hình 27 Ảnh chuột B chuột đối chứng ung thư Những hình ảnh cho thấy chuột B ngày thứ sau cấy truyền tế bào ung thư (được đánh dấu ngày 0) có khối u phát triển lồi, Ngày bị tròn da, kích thước 6.0x6.0mm, bắt đầu xuất lõi màu hồng (dấu hiệu u NgàyNgày hoạt tử) Các ngày sau khối u to dần với lõi hoại tử dần rõ, lan rộng Ngàyvà sâu Đến ngày thứ 18 khối u phát triển to, kích thước lên tới 23.0x21.0 (mm) Ngày Ngày Hình 28 Hình ảnh chuột đối chứng không tiêm hạt từ có chiếu từ trường (chuột C) Phạm Thị Hà Giang Cao học 17 (2008-2010) 56 Ngày Ngày Ngày 14 Ngày Luận văn Thạc sỹ Khoa học Sinh học thực nghiệm 18 ngày theo dõi Với kích thước khối u ban đầu tương tự chuột B, chuột C không tiêm hạt từ vào u chiếu từ trường lần với cường độ từ trường 60 Oe, tần số dòng xoay chiều 236 kHz, ngày 1, ngày chiếu lần 1, lần lần Song kích thước khối u không giảm không nhỏ kích thước khối u chuột đối chứng B Tới ngày thứ 18 khối u lớn, lõi hoại tử u lan rộng gần hết vùng bụng chuột Điều cho thấy không tiêm hạt từ gia nhiệt tác dụng làm tiêu giảm khối u Hình 29 Hình ảnh chuột tiêm hạt từ E6 liều 400µg/lần x lần không dược chiếu từ trường (chuột D) 13 ngày theo dõi Ngày Ngày Quan sát hình ảnh nhận thấy sau lần thứ tiêm trực NgàyNgày Ngày Ngày N gày 11 13 tiếp 400µg hạt từ E6 vào khối u (ngày 1), bề mặt khối u xuất lớp vảy đen tương tự khối u tiêm trực tiếp hạt từ E6 có gia nhiệt Nhưng quan sát kỹ lớp vảy đen màu đen hoàn toàn, khô cứng, đặc biệt không lan rộng lớp vảy đen khối u tiêm trực tiếp hạt từ có gia nhiệt Sau tiêm thêm lần nữa, vào ngày thứ thứ lớp vảy đen giữ nguyên ban đầu, vành khối u tiếp tục mở rộng, kích thước khối u tăng lên nhanh Điều cho thấy có tiêm trực tiếp hạt từ E6 vào khối u mà không gia nhiệt tác dụng làm teo giảm khối u Phạm Thị Hà Giang Cao học 17 (2008-2010) 57 Ngày Ngày80 Ngày Ngày1 Ngày Luận văn Thạc sỹ Khoa học Sinh học thực nghiệm Hình 30 Hình ảnh chuột tiêm hạt từ E6 liều 300µg/lần x lần điều trị liệu pháp gia nhiệt (chuột E) 21 ngày theo dõi Hình 30 hình ảnh chuột E - chuột tiêm trực tiếp hạt từ E6 vào khối u với lượng 300µg/lần x lần vào ngày 1, sau cấy truyền tế bào ung thư Ngay sau ngày gia nhiệt (ngày 1), bề mặt khối u xuất vảy đen khô cứng, khối u không gia tăng kích thước Sau gia nhiệt lần thứ (ngày 4) vảy đen lan rộng ra, khối u có dấu hiệu xẹp xuống không lan rộng thêm Đặc biệt sau lần gia nhiệt thứ (ngày 7), vảy đen lan rộng khắp khối u, khối u không lồi tròn ban đầu mà xẹp dần xuống đến ngày thứ khối u hoàn toàn xẹp xuống Điều chứng tỏ tiêm hạt từ gia nhiệt, nhiệt độ khối u tăng lên giết chết tế bào ung thư Vảy đen khô cứng tế bào ung thư chết tạo thành Khi theo dõi ngày khối u xẹp xuống, không tăng kích thước, vảy đen ngày thu hẹp đến ngày 21 bong hoàn toàn, để lại vết sẹo nhỏ da bụng chuột Tiếp tục theo dõi đến ngày thứ 35 thấy chuột hoàn toàn khỏe mạnh, khối u không tái phát, lại vết sẹo nhỏ da Hình 31 Hình ảnh chuột tiêm hạt từ E6 liều 400µg/lần x lần điều trị liệu pháp gia nhiệt (chuột F) 22 ngày theo dõi Ngày Ngày Ngày Hình hình Ngày 31 Ngày ảnh chuộtNgày F 8– tiêm trực tiếp Ngày 400µg hạt từ E6 vào khối u11và gia nhiệt lần Trước điều trị chuột F có khối u lồi tròn, kích thước 6.5x6.5 (mm), sau gia nhiệt lần (ngày 1), khối u xuất vảy đen nhỏ, khối u chưa có dấu hiệu xẹp xuống Nhưng sau gia nhiệt lần thứ (ngày 4) vảy đen đầu khối u lan rộng hơn, tới ngày thứ khối u xẹp xuống nhiều, không lồi tròn ban đầu Sau gia nhiệt lần thứ khối u xẹp hoàn toàn, ngày sau vảy đen ngày khô cứng thu nhỏ dần lại, đến ngày 22 bong hoàn toàn, để lại vết sẹo da bụng chuột Phạm Thị Hà Giang Cao học 17 (2008-2010) 58 Ngày 14 18 22 Luận văn Thạc sỹ Khoa học Sinh học thực nghiệm Chúng theo dõi đến ngày thứ 35 mà chưa phát chuột D bị tái phát lại Chuột hoạt động ăn uống bình thường, khỏe mạnh da có vết sẹo nhỏ So sánh chuột E – tiêm trực tiếp với lượng 300µg chuột F – tiêm trực tiếp với lượng 400µg dung dịch hạt từ E6 thấy khác biệt nhiều Ở hai trường hợp, khối u tiêu giảm, xẹp hẳn để lại vết sẹo nhỏ da, không phát bị tái phát sau tuần kể từ lần điều trị gia nhiệt cuối Từ kết khả quan trên, lặp lại thí nghiệm gia nhiệt in vivo, để khẳng định chắn khối u chuột E, F tiêu giảm tác dụng hạt từ E6, tiêm trực tiếp vào khối u chiếu từ trường Kết thí nghiệm lặp lại tương tự thí nghiệm lần Từ đưa kết luận sau: • Hạt từ E6 tiêm trực tiếp vào khối u rắn Sarcoma da chuột nhắt trắng Swiss không gây ảnh hưởng đến hoạt động, trạng thái sinh lí chuột mang u • Hạt từ E6 tiêm liều 300-400μg trực tiếp vào khối u áp dụng liệu pháp gia nhiệt (60 Oe, 236kHz) có tác dụng làm teo hoàn toàn khối u thực nghiệm chuột Phạm Thị Hà Giang Cao học 17 (2008-2010) 59 Luận văn Thạc sỹ Khoa học Sinh học thực nghiệm KẾT LUẬN Từ kết thu được, đưa số kết luận sau: Đã khảo sát độc tính in vitro H01 E6 số dòng tế bào ung thư tế bào lành Nồng độ độc ngưỡng H01 tế bào dòng H358 0.2ng/1 tế bào, H460 0.4 ng/1 tế bào, MCF7 0.2 ng/1 tế bào, HepG2 0.3 ng/1 tế bào Fibroblast 0.4 ng/1 tế bào Nồng độ độc ngưỡng E6 tế bào dòng HeG2 0.5 ng/1 tế bào, Fibroblast 1.0 ng/1 tế bào Sự có mặt H01 làm tăng độ tương phản ảnh khối u đùi chuột thực nghiệm chụp cộng hưởng từ hạt nhân (MRI) Mẫu hạt từ E6 chiếu từ trường (60 Oe, 236 kHz) có khả làm gia tăng nhiệt độ Nồng độ E6 cao, tốc độ gia tăng nhiệt độ ban đầu lớn nhiệt độ bão hoà cao Khi E6 có mặt khối u thực nghiệm cách tiêm trực tiếp 400µg, chiếu từ trường ex vivo 30 phút, nhiệt độ u tăng từ 31oC lên 42 oC Mẫu E6 tiêm tĩnh mạch cho chuột mang u rắn da liều 2000µg sau 60 phút phát có mặt quan sau (sắp xếp theo thứ tự nhiều đến nhất): gan, phổi, lách, u, thận phương pháp đốt – nhiệt từ kỹ thuật quang phổ hấp thụ nguyên tử Mẫu E6 tiêm liều 300 – 400 µg trực tiếp vào khối u chiếu từ trường (60 Oe, 236 kHz) 30 phút, lặp lại lần có tác dụng teo hoàn toàn khối u rắn da chuột nhắt trắng dòng Swiss Phạm Thị Hà Giang Cao học 17 (2008-2010) 60 Luận văn Thạc sỹ Khoa học Sinh học thực nghiệm KIẾN NGHỊ Khảo sát lại phân bố hạt từ E6 quan thể chuột tiêm tĩnh mạch, tìm biện pháp nhằm tập trung hạt từ khối u chủ yếu, nội quan khác không đáng kể Phạm Thị Hà Giang Cao học 17 (2008-2010) 61 Luận văn Thạc sỹ Khoa học Sinh học thực nghiệm Phạm Thị Hà Giang Cao học 17 (2008-2010) 62 Luận văn Thạc sỹ Khoa học Sinh học thực nghiệm TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Phan Hà Châu, Nguyên lý kĩ thuật chụp cộng hưởng từ, Khoa chẩn đoán hình ảnh – Đại học Y dược TP Hồ Chí Minh Nguyễn Hoàng Hải, Chế tạo ứng dụng hạt nano từ tính Y sinh, Báo cáo hội nghị Vật lý toàn quốc (2007) Trần Đức Quang, Nguyên lý kĩ thuật chụp cộng hưởng từ (2007), NXB ĐHQG TP Hồ Chí Minh TÀI LIỆU TIẾNG ANH Alexiou C and Jurgons R (2007), “Magnetic drug targeting”, Magnetism in medicine: a handbook, second edition, edited by W Andra and H Howak, Willey, Berlin, pp 597-605 Alexiou C., Arnold W., Klein R J., Parak F G., Hulin P., Bergemann C., Erhardt W., Wagenpfeil S., and Lubbe A S (2000), “Locoregional cancer treatment with magnetic drug targeting”, Cancer Res., 60, pp 6641–6648 Allen L M., Kent J., Wolfe C., Ficco C., and Johnson J (1997), “MTCTM: a magnetically targetable drug carrier for paclitaxel”, Scientific and clinical applications of magnetic carriers, edited by Hafeli U., Schutt W., Teller J., and Zborowski M., Plenum Press, New York, London, pp 481-494 Chan D.C.F., Kirpotin D.B., Bunn P.A (1993), “Synthesis and evaluation of colloidal magnetic iron oxides for the site-specific radiofrequency-induced hyperthermia of cancer”, J Magn Magn Mater., 122, pp 374-378 Gilchrist R.K., Medal R., Shorey W.D., Hanselman R.C., Parrot J.C., and Talor C.B (1957), “Sellective inductive heating of lymph nodes”, Ann Surgery, 146, pp 596-606 Gneveckow U., Jordan A., Scholz R., Brub V., Waldofner N., Ricke J., Feussner A., Hildebrandt B., Rau B., and Wust P (2004), “Description and characterization of the novel hyperthermia- and thermoablation-system MFH(300F for clinical magnetic fluid hyperthermia”, Med Phys., 31, pp 1444-1451 10 Gneveckow U., Jordan A., Scholz R., Eckelt L., Maier-Hauff K., Johannsen M., and Wust P (2005), “Magnetic force nanotherapy: with nanoparticles against cancer Experiences from three Phạm Thị Hà Giang Cao học 17 (2008-2010) 63 Luận văn Thạc sỹ Khoa học Sinh học thực nghiệm Phạm Thị Hà Giang Cao học 17 (2008-2010) 64 Luận văn Thạc sỹ Khoa học Sinh học thực nghiệm Phạm Thị Hà Giang Cao học 17 (2008-2010) 65

Ngày đăng: 28/10/2016, 00:53

Từ khóa liên quan

Mục lục

  • MỞ ĐẦU

  • CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

    • 1.1. Những khái niệm cơ bản về hạt nano từ và ứng dụng

      • 1.1.1. Vật liệu nano

      • 1.1.2. Hạt nano từ

      • 1.1.3. Ứng dụng của hạt nano từ trong lĩnh vực sinh y học

        • 1.1.3.1. Tách, phân lập các tế bào và thực thể sinh học ra khỏi một môi trường hỗn hợp

        • 1.1.3.2. Dẫn truyền thuốc, gen và các nuclide phóng xạ tới mô đích

        • 1.1.3.3. Tăng độ tương phản ảnh trong phương pháp chẩn đoán bằng chụp cộng hưởng từ.

        • 1.1.3.4. Liệu pháp nhiệt – từ trong điều trị ung thư

    • 1.2. Chụp cộng hưởng từ hạt nhân (MRI)

      • 1.2.1. Lịch sử phát triển của kĩ thuật chụp cộng hưởng từ hạt nhân

      • 1.2.2. Nguyên lý và kỹ thuật chụp cộng hưởng từ hạt nhân (MRI)

      • 1.2.3. Ưu điểm của chụp cộng hưởng từ hạt nhân (MRI)

  • CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

    • 2.1. Đối tượng nghiên cứu

      • 2.1.1. Chuột nhắt trắng (Mus muscullus) dòng Swiss

      • 2.1.2. Một số dòng tế bào ung thư và tế bào lành

        • 2.1.2.1. Các dòng tế bào ung thư

        • 2.1.2.2. Tế bào lành Fibroblast

      • 2.1.3. Vật liệu nano từ (hay chất lỏng từ)

    • 2.2. Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm

      • 2.2.1. Môi trường nuôi cấy

      • 2.2.2. Hóa chất

      • 2.2.3. Máy móc thiết bị

      • 2.2.4. Vật tư tiêu hao

    • 2.3. Phương pháp nghiên cứu

      • 2.3.1. Phương pháp tạo u rắn dưới da và cơ đùi cho chuột nhắt trắng Swiss bằng cấy ghép dòng tế bào Sarcoma 180

        • 2.3.1.1. Tạo u rắn dưới da

        • 2.3.1.2. Tạo u đùi

      • 2.3.2. Phương pháp khảo sát độc tính của dung dịch nano từ H01 và E6 trên các dòng tế bào ung thư và nguyên bào sợi

      • 2.3.3. Phương pháp khảo sát khả năng tạo tương phản ảnh của H01 bằng kỹ thuật chụp cộng hưởng từ hạt nhân (MRI)

      • 2.3.4. Kỹ thuật tiêm tĩnh mạch

      • 2.3.5. Phương pháp khảo sát hiệu ứng đốt nhiệt – từ ex vivo

        • 2.3.5.1. Khảo sát hiệu ứng đốt nhiệt - từ mẫu E6

        • 2.3.5.2. Phương pháp khảo sát hiệu ứng đốt – nhiệt từ ex vivo

      • 2.3.6. Phương pháp khảo sát sự phân bố nguyên tố sắt (nguồn gốc vật liệu từ) trong một số cơ quan và khối u của chuột Swiss

        • 2.3.6.1. Bằng phương pháp đốt nhiệt từ

        • 2.3.6.2. Bằng máy quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS)

      • 2.3.7. Liệu pháp gia nhiệt in vivo

  • CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

    • 3.1. Kết quả gây tạo u rắn dưới da và u đùi trên chuột Swiss

      • 3.1.1. Kết quả gây tạo u rắn dưới da

      • 3.1.2. Kết quả gây u đùi ở chuột Swiss

    • 3.2. Kết quả khảo sát độc tính của chất lỏng nano từ H01 và E6 trên các dòng tế bào ung thư và nguyên bào sợi

      • 3.2.1. Kết quả xác định độc tính của H01

      • 3.2.2. Kết quả xác định độc tính của E6

    • 3.3. Kết quả khảo sát khả năng tạo tương phản ảnh của H01 bằng kỹ thuật chụp cộng hưởng từ hạt nhân (MRI)

    • 3.4. Kết quả khảo sát liệu pháp đốt nhiệt từ sử dụng mẫu E6

      • 3.4.1. Kết quả hiệu ứng đốt nhiệt từ mẫu E6

      • 3.4.2. Kết quả gia nhiệt ex vivo bằng hạt từ E6

      • 3.4.3. Kết quả khảo sát sự phân bố nguyên tố sắt (nguồn gốc vật liệu từ) trong một số cơ quan và khối u

        • 3.4.3.1. Kết quả khảo sát sự phân bố nguyên tố sắt (nguồn gốc vật liệu từ) trong một số cơ quan bằng phương pháp đốt nhiệt từ

        • 3.4.3.2. Kết quả khảo sát sự phân bố nguyên tố sắt (nguồn gốc vật liệu từ) trong một số cơ quan và khối u bằng máy phân tích quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS)

      • 3.4.4. Kết quả khảo sát liệu pháp đốt – nhiệt từ in vivo

  • KẾT LUẬN

  • KIẾN NGHỊ

  • TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu cùng người dùng

  • Đang cập nhật ...

Tài liệu liên quan