Luận văn nghiên cứu ứng dụng vật liệu nano từ trong chẩn đoán và điều trị khối u thực nghiệm

Nhiệt trị đã được xem như một liệu pháp đầy triển vọngtrong việc chữa trị ung thư, đặc biệt khi được kết hợp cùng với hoá trị hoặc xạ trị.Liệu pháp này dựa trên tác dụng ngăn chặn sự phá

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Những khái niệm cơ bản về hạt nano từ và ứng dụng 4

1.1.1 Vật liệu nano 4

1.1.2 Hạt nano từ 5

1.1.3 Ứng dụng của hạt nano từ trong lĩnh vực sinh y học 6

1.1.3.1 Tách, phân lập các tế bào và thực thể sinh học ra khỏi một môi trường hỗn hợp 7

1.1.3.2 Dẫn truyền thuốc, gen và các nuclide phóng xạ tới mô đích 8

1.1.3.3 Tăng độ tương phản ảnh trong phương pháp chẩn đoán bằng chụp cộng hưởng từ 13

1.1.3.4 Liệu pháp nhiệt – từ trong điều trị ung thư 13

1.2 Chụp cộng hưởng từ hạt nhân (MRI) 20

1.2.1 Lịch sử phát triển của kĩ thuật chụp cộng hưởng từ hạt nhân 20

1.2.2 Nguyên lý và kỹ thuật chụp cộng hưởng từ hạt nhân (MRI) 21

1.2.3 Ưu điểm của chụp cộng hưởng từ hạt nhân (MRI) 25

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.1 Đối tượng nghiên cứu 26

2.1.1 Chuột nhắt trắng (Mus muscullus) dòng Swiss 26

2.1.2 Một số dòng tế bào ung thư và tế bào lành 26

2.1.2.1 Các dòng tế bào ung thư 26

2.1.2.2 Tế bào lành Fibroblast 27

2.1.3 Vật liệu nano từ (hay chất lỏng từ) 27

Phạm Thị Hà Giang Cao học 17

(2008-2.2 Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm 28

2.2.1 Môi trường nuôi cấy 28

2.2.2 Hóa chất 28

2.2.3 Máy móc thiết bị 28

2.2.4 Vật tư tiêu hao 29

2.3 Phương pháp nghiên cứu 29

2.3.1 Phương pháp tạo u rắn dưới da và cơ đùi cho chuột nhắt trắng Swiss bằng cấy ghép dòng tế bào Sarcoma 180 29

2.3.1.1 Tạo u rắn dưới da 29

2.3.1.2 Tạo u đùi 30

2.3.2 Phương pháp khảo sát độc tính của dung dịch nano từ H01 và E6 trên các dòng tế bào ung thư và nguyên bào sợi 30

2.3.3 Phương pháp khảo sát khả năng tạo tương phản ảnh của H01 bằng kỹ thuật chụp cộng hưởng từ hạt nhân (MRI) 31

2.3.4 Kỹ thuật tiêm tĩnh mạch 32

2.3.5 Phương pháp khảo sát hiệu ứng đốt nhiệt từ ex vivo 33

2.3.5.1 Khảo sát hiệu ứng đốt nhiệt từ mẫu E6 33

2.3.5.2 Phương pháp khảo sát hiệu ứng đốt – nhiệt từ ex vivo 33

2.3.6 Phương pháp khảo sát sự phân bố nguyên tố sắt (nguồn gốc vật liệu từ) trong một số cơ quan và khối u của chuột Swiss 35

2.3.6.1 Bằng phương pháp đốt nhiệt từ 35

2.3.6.2 Bằng máy quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) 36

2.3.7 Liệu pháp gia nhiệt in vivo 38

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 40

3.1 Kết quả gây tạo u rắn dưới da và u đùi trên chuột Swiss 40

3.1.1 Kết quả gây tạo u rắn dưới da 40

3.1.2 Kết quả gây u đùi ở chuột Swiss 41

3.2 Kết quả khảo sát độc tính của chất lỏng nano từ H01 và E6 trên các dòng tế bào ung thư và nguyên bào sợi 42

3.2.1 Kết quả xác định độc tính của H01 42

3.2.2 Kết quả xác định độc tính của E6 45

3.3 Kết quả khảo sát khả năng tạo tương phản ảnh của H01 bằng kỹ thuật chụp cộng hưởng từ hạt nhân (MRI) 47

3.4 Kết quả khảo sát liệu pháp đốt nhiệt từ sử dụng mẫu E6 49

3.4.1 Kết quả hiệu ứng đốt nhiệt từ mẫu E6 49

3.4.2 Kết quả gia nhiệt ex vivo bằng hạt từ E6 51

3.4.3 Kết quả khảo sát sự phân bố nguyên tố sắt (nguồn gốc vật liệu từ) trong một số cơ quan và khối u 54

3.4.3.1 Kết quả khảo sát sự phân bố nguyên tố sắt (nguồn gốc vật liệu từ) trong một số cơ quan bằng phương pháp đốt nhiệt từ 54

3.4.3.2 Kết quả khảo sát sự phân bố nguyên tố sắt (nguồn gốc vật liệu từ) trong một số cơ quan và khối u bằng máy phân tích quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) 56

3.4.4 Kết quả khảo sát liệu pháp đốt – nhiệt từ in vivo 58

KẾT LUẬN 65

KIẾN NGHỊ 66

TÀI LIỆU THAM KHẢO 67

Phạm Thị Hà Giang Cao học 17

(2008-DANH MỤC VIẾT TẮT

AAS Atomic absorption spectrometryAEH Arterial embolization hyperthermiaCHHBM Chất hoạt hoá bề mặt

DANH MỤC BẢNGBảng 1 Một số dòng tế bào ung thư sử dụng trong luận văn và đặc điểm của chúng

từ H01 tại các nồng độ (ng/1 tế bào) khác nhau trong 2 giờ 44

Bảng 6 Tỷ lệ sống (%) của dòng tế bào ung thư gan HepG2 và tế bào lành sau khi

ủ với hạt từ E6 tại các nồng độ (ng/1 tế bào) khác nhau trong 2 giờ 47

Bảng 7 Giá trị nhiệt độ bão hoà (Tbh) và tốc độ tăng nhiệt độ ban đầu (dT/dt) 49

Bảng 8 Nhiệt độ ban đầu và nhiệt độ bão hòa của từng khối u trong quá trình gia

nhiệt 52

Bảng 9 Nhiệt độ bão hòa trong 5 nội quan của chuột A và B sau khi gia nhiệt 30

phút (oC), nhiệt độ ban đầu là 30oC 55

Bảng 10 Hàm lượng sắt có trong 1g mẫu của 5 cơ quan tách ra từ chuột A và chuột

B (ngFe/1g mẫu) 57

DANH MỤC HÌNH

Hình 1 Minh hoạ nguyên lý sử dụng hạt nano từ và từ trường ngoài để tách các

thực thể sinh vật [29] 8

Hình 2 Minh hoạ về nguyên lý vận chuyển và tập trung thuốc [4] 9

Hình 3 Cấu trúc của một hệ nano – thuốc 10

Hình 4 Minh hoạ về quá trình đốt nhiệt sử dụng hạt nano từ 13

Hình 5 Quá trình phát triển khổi u trên cơ thể chuột trong thí nghiệm của Yanase và các cộng sự [35] 17

Hình 6 Thiết bị MFH-300F (công ty MagForce) dùng trong nhiệt – từ trị [21] 20

Hình 7 Hình ảnh chụp cộng hưởng từ chẩn đoán ung thư 21

Hình 8 Sự tạo thành vector từ hoá thực 22

Hình 9 Vector từ hoá ngang vuông góc với Oz 23

Hình 10 Chuột nhắt trắng Swiss 26

Hình 11 Ảnh SEM của mẫu E6 – dung dịch hạt nano từ Fe3O4 bọc bằng Copolime poli (axit acrylic – styrene), hạt có kích thước khoảng 100nm 28

Hình 12 Máy chụp cộng hưởng từ 1.5T (MRI 1.5 Gyroscan Philips) 32

Hình 13.Hệ thống máy phát từ trường RDO, moel HFI (Mỹ) 34

Hình 14 Hình ảnh máy quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) (Shimadzu – Nhật Bản) 37

Hình 15 Hình ảnh khối u rắn dưới da sau 6 ngày (A), 10 ngày (B) và 17 ngày (C) cấy truyền 40

Hình 16 Khối u đùi gây trên chuột Swiss 41

Hình 17 Ảnh hiển vi quang học tế bào MCF7 trước (a) và sau khi bổ sung hạt từ H01 nồng độ 0.1ng/1 tế bào (b) (TK 10 x VK 40 x zoom 5.6) 43

Hình 18 Hình ảnh tế bào HepG2 khi bổ sung hạt từ H01 ở các nồng độ khác nhau (TK 10 x VK 20 x zoom 5.6) 43

Hình 19 Hình ảnh chuột mang u đùi tiêm tĩnh mạch 150µl hạt từ H01 sau 15 ngày

45

Hình 20 Hình ảnh tế bào HepG2 khi bổ sung hạt từ E6 với các nồng độ khác nhau

và ủ trong 2 giờ (TK10 x VK 20 x zoom 4x) 46

Hình 21 Ảnh chụp cộng hưởng từ 3 chuột A, B và C, (1) – hình ảnh cắt từ trước ra

sau và (2) - hình ảnh cắt từ phải sang trái 48

Hình 22 Hình ảnh khối u của chuột B và C 48 Hình 23 Các đường tăng nhiệt độ của mẫu chất lỏng từ E6 ở các nồng độ khác

nhau với cường độ từ trường 60Oe, tần số dòng xoay chiều 236 kHz 50

Hình 24 Các đường tăng nhiệt độ trong các khối u ex vivo tách từ chuột TN với IB

(chuột C) trong 18 ngày theo dõi 60

Hình 29 Hình ảnh chuột được tiêm hạt từ E6 liều 400µg/lần x 3 lần nhưng không

dược chiếu từ trường (chuột D) trong 13 ngày theo dõi 61

Hình 30 Hình ảnh chuột được tiêm hạt từ E6 liều 300µg/lần x 3 lần điều trị bằng

liệu pháp gia nhiệt (chuột E) trong 21 ngày theo dõi 62

Hình 31 Hình ảnh chuột được tiêm hạt từ E6 liều 400µg/lần x 3 lần điều trị bằng

liệu pháp gia nhiệt (chuột F) trong 22 ngày theo dõi 63

MỞ ĐẦU

Ung thư hiện nay đang là mối đe dọa trên toàn cầu, thách thức hệ thống y tếcủa mọi quốc gia với hàng chục triệu ca mắc bệnh, khoảng 7 triệu người chết mỗinăm Tổ chức Y tế thế giới (WHO) khuyến cáo đây là bệnh có khả năng gây tửvong hàng đầu trên thế giới trong thế kỷ XXI Riêng tại Việt Nam, các chuyên giacho biết, ước tính, mỗi năm nước ta có thêm khoảng 200.000 người mắc bệnh này

và khoảng 100.000 người sẽ tử vong Ung thư có thể vẫn sẽ là nguyên nhân hàngđầu gây tử vong trên thế giới và Việt Nam trong nhiều thập kỉ tới Chính vì thế việctìm ra phương pháp chẩn đoán sớm và điều trị ung thư có hiệu quả cao hơn là yêucầu cấp bách đặt ra cho toàn thể nhân loại

Các phương pháp điều trị ung thư truyền thống như phẫu thuật, hóa trị, xạ trị,nội tiết điều trị hay miễn dịch điều trị tuy mang lại nhiều kết quả tiêu diệt và hạnchế sự phát triển của khối u nhưng cũng giết chết không ít mô lành gây nguy hạikhông nhỏ đến sức khỏe của người bệnh Nguyên nhân của hiện tượng này là dophần lớn các phương thức điều trị không chỉ tác động cục bộ lên khối u mà còn ảnhhưởng đến một bộ phận lớn các mô và cơ quan lành của cơ thể Vì vậy nhiệm vụquan trọng hàng đầu của các nhà khoa học hiện nay là cần tìm ra một phương phápchữa trị ung thư sao cho vừa hiệu quả mà lại ít gây độc đối với cơ thể

Ngày nay công nghệ vật liệu đang thay làm thay đổi cuộc sống của chúng tanhờ vào khả năng can thiệp của con người tại kích thước nm Vật liệu nano thể hiệnrất nhiều tính chất đặc biệt và lý thú Một nhánh quan trọng của công nghệ nano, đó

là lý sinh y học nano, trong đó, vật liệu nano được sử dụng để chẩn đoán và điều trịbệnh

Ở Việt Nam hạt nano có từ tính đang được các nhà khoa học thuộc việnKhoa học Vật liệu chế tạo để ứng dụng vào điều trị ung thư bằng phương pháp gianhiệt (hyperthermotherapy) Hạt nano từ được làm từ Fe3O4 và thường được bọcbằng một số vật liệu như dextran, carboxydextran, tinh bột (starch), chitosan…đểlàm tăng sự phân bố đồng đều trong chất lỏng từ và tăng tính tương hợp sinh học

khi đưa vào cơ thể sống Khi hạt nano từ được tập trung tại một vùng nào đó trong

cơ thể, dưới tác động của từ trường xoay chiều có thể tăng nhiệt độ của vùng đó lêntới 50oC, đó chính là cơ sở của liệu pháp nhiệt trị ung thư

Tác dụng của nhiệt trong chữa bệnh (nhiệt trị) đã được con người biết và sửdụng từ cách đây rất lâu Nhiệt trị đã được xem như một liệu pháp đầy triển vọngtrong việc chữa trị ung thư, đặc biệt khi được kết hợp cùng với hoá trị hoặc xạ trị.Liệu pháp này dựa trên tác dụng ngăn chặn sự phát triển của tế bào ung thư khinhiệt độ cục bộ tại khối u được đẩy lên trên 42 oC, trong khi không ảnh hưởng tớicác tế bào lành xung quanh

Hiện nay, các nghiên cứu đều đang tập trung vào khắc phục hai khó khăn màcác phương pháp nhiệt trị đang vấp phải để thu được những tác dụng triệt để trêncác khối u ung thư, đó là (i) tập trung nhiệt lượng cục bộ tại vị trí khối u và (ii) điềukhiển, khống chế được nhiệt độ tại vùng có khối u một cách chính xác

Bên cạnh việc điều trị thì chẩn đoán sớm sự xuất hiện của ung thư có thể coi

là mơ ước của các nhà khoa học hiện nay Chẩn đoán được ung thư ở giai đoạn sớm

là có khả năng cao điều trị dứt điểm được căn bệnh quái ác này mà không gây ảnhhưởng nhiều đến sức khỏe vì ngăn cản kịp thời sự di căn của tế bào ác tính Chụpcộng hưởng từ hay MRI (Magnetic Resonance Imaging) là một kỹ thuật chẩn đoán

y khoa tạo ra hình ảnh giải phẫu của cơ thể nhờ sử dụng từ trường và sóng radio.Phương pháp này không sử dụng tia X nên có độ an toàn cao cho bệnh nhân Máychụp cộng hưởng từ là một thiết bị nhạy cảm và đa năng giúp ta thấy hình ảnh cáclớp cắt của các bộ phận cơ thể từ nhiều góc độ trong khoảng một thời gian ngắn Sựchi tiết làm cho MRI trở thành công cụ vô giá trong chẩn đoán thời kì đầu và trongviệc đánh giá các khối u trong cơ thể Nhất là nếu có sự xuất hiện của hạt nano từ tại

vị trí khối u, ta sẽ có những hình ảnh chẩn đoán rõ nét nhờ vào khả năng gây tươngphản hình ảnh của chúng

Xuất phát từ những yêu cầu trên và để góp phần đưa hạt nano từ được sảnxuất tại Việt Nam vào ứng dụng trong điều trị ung thư, chúng tôi nhận để tài

“Nghiên cứu ứng dụng vật liệu nano từ trong chẩn đoán và điều trị khối u thực

nghiệm” làm đề tài luận văn cao học nhằm thực hiện một số nhiệm vụ cơ bản sau:

1 Xác định độc tính của chất lỏng từ lên một số dòng tế bào ung thư vàFibroblast

2 Khảo sát khả năng tạo tương phản ảnh của hạt nano từ bằng phương phápchụp cộng hưởng từ hạt nhân (MRI)

3 Thử liệu pháp nhiệt trị trên mô hình ung thư thực nghiệm.

Đề tài được thực hiện tại Bộ môn Tế bào – Mô – Phôi và Lý sinh, khoa Sinhhọc, bộ môn Thổ nhưỡng và Môi trường Đất, khoa Môi trường, trường Đại họcKhoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, phòng Nano Y sinh, viện Khoa họcVật liệu, trung tâm Khoa học Tự nhiên và Công nghệ Quốc Gia và Bệnh viện Quânđội Trung ương 108 Kết quả của đề tài là cơ sở để đẩy mạnh thêm những nghiêncứu nhằm ứng dụng hạt nano từ và phương pháp chụp cộng hưởng từ hạt nhân vàoviệc chẩn đoán và điều trị ung thư trên bệnh nhân

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Những khái niệm cơ bản về hạt nano từ và ứng dụng

- Vật liệu nano hai chiều là vật liệu trong đó một chiều có kích thước nano,hai chiều tự do, ví dụ như màng mỏng…

- Ngoài ra còn có vật liệu cấu trúc nano hay nanocomposite, trong đó chỉ cómột phần của vật liệu có kích thước nano, hoặc cấu trúc của nó có nano khôngchiều, một chiều, hai chiều đan xen lẫn nhau

Ngoài cách phân loại vật liệu nano dựa vào hình dáng vật liệu, người ta còn

có thể phân loại dựa vào độ cảm từ Bất cứ vật liệu kim loại nào cũng có sự hưởngứng với từ trường ngoài, thể hiện bằng độ từ hoá (từ độ, M) Tỷ số c = M/H đượcgọi là độ cảm từ, trong đó H là cường độ từ trường Tuỳ thuộc vào giá trị độ cảm từ

có thể phân ra làm các loại vật liệu từ khác nhau

 Vật liệu có c nhỏ hơn rất nhiều so với 0 (xấp xỉ -10-6) được gọi là vậtliệu nghịch từ

 Vật liệu có c xấp xỉ 1 (chênh lệch khoảng 10-6) được gọi là vật liệuthuận từ

 Vật liệu có c với giá trị rất lớn so với 0 có thể là vật liệu sắt từ [14].Ngoài độ cảm từ, nhiều thông số khác cũng rất quan trọng trong việc xácđịnh tính chất của vật liệu, ví dụ như: từ độ bão hoà (từ độ đạt cực đại tại từ trường

lớn), từ dư (từ độ còn dư sau khi ngừng tác động của từ trường ngoài), lực kháng từ(từ trường ngoài cần thiết để một hệ, sau khi đạt trạng thái bão hoà từ, bị khử từ)…Nếu kích thước của hạt giảm đến một giá trị nào đó (thông thường từ vài đến vàichục nanomet, phụ thuộc vào từng vật liệu cụ thể), tính sắt từ biến mất, chuyểnđộng nhiệt sẽ thắng thế và làm cho vật liệu trở thành vật liệu siêu thuận từ Đối vớivật liệu siêu thuận từ, từ dư và lực kháng từ bằng không Điều đó có nghĩa là, khingừng tác động của từ trường ngoài, vật liệu sẽ không còn từ tính nữa Đây là mộtđặc điểm rất quan trọng khi dùng vật liệu này cho các ứng dụng y sinh học [2, 24].

1.1.2 Hạt nano từ

Hạt nano từ là vật liệu nano không chiều tức là cả ba chiều của nó đều cókích thước nano (<1000 nm) Hạt nano từ được dùng trong y-sinh học cần phải thỏamãn ba điều kiện sau:

- Tính đồng nhất của các hạt cao Tính đồng nhất cơ bản là về kích thước –một tính chất có liên quan nhiều đến phương pháp chế tạo

- Từ độ bão hòa lớn

- Vật liệu có tính tương hợp sinh học cao (không có độc tính) [24] Tínhtương hợp sinh học liên quan đến bản chất của vật liệu sau khi đã được xử lý bềmặt

Trong tự nhiên, sắt là vật liệu có từ độ bão hoà lớn nhất tại nhiệt độ phòng.Ngoài ra sắt còn là nguyên tố không độc và rất quan trọng đối với cơ thể người, cótính ổn định khi làm việc trong môi trường không khí nên các vật liệu như oxit sắtđược nghiên cứu rất nhiều để làm hạt nano từ ứng dụng trong sinh y học

Hạt nano từ dùng trong y sinh học thường ở dạng dung dịch nên còn gọi làchất lỏng từ (CLT) Một dung dịch từ gồm ba thành phần: lõi là hạt Fe3O4 có kíchthước nano, chất hoạt hoá bề mặt và dung môi Trong đó:

- Lõi Fe3O4 có kích thước nano là thành phần quyết định đến tính chất từ củadung dịch từ

- Chất hoạt hóa bề mặt (CHHBM) có tác dụng làm cho hạt nano phân tántrong dung môi, tránh kết tụ lại với nhau ngay cả khi có mặt của từ trường ngoài,

ngoài ra nó còn có tác dụng “che chở” hạt nano khỏi sự phát hiện của hệ thống miễndịch của cơ thể và tạo các mối liên kết hoá học với các phân tử khác.

- Dung môi là chất lỏng mang toàn bộ hệ [33] Đối với các loại chất lỏng từdùng trong sinh học, thì dung môi thường hướng tới pH = 7.0 – 7.2

1.1.3 Ứng dụng của hạt nano từ trong lĩnh vực sinh y học

Ý tưởng sử dụng các hạt nhỏ trong chẩn đoán và chữa bệnh đã được bắt đầu

từ cách đây gần 60 năm, sau phát hiện của các nhà khoa học công ty Hoá chất Dow(Dow Chemical Company) về các hạt polymer có kích thước rất đồng đều Cho đếnnay, việc nghiên cứu và phát triển ý tưởng này đã mang lại những ứng dụng đột phátrong lĩnh vực y – sinh học Nguyên lý chung của các ứng dụng là lợi dụng một sốtính chất ưu việt của các hạt nhỏ để điều khiển chúng thâm nhập vào cơ thể hoặctương tác với các thực thể sinh vật như tế bào (10 ÷ 100 μm), vi-rút (20 ÷ 450 nm),protein (5 ÷ 50 nm), gen (rộng 2 nm và dài 10 ÷ 100 nm) mà không bị phát hiện.Thông thường để làm việc này, người ta phải lựa chọn hạt có kích thước phù hợp vàbiến đổi bề mặt của chúng bằng cách gắn thêm các phân tử sinh học như kháng thểđơn dòng, lectin, peptide hoặc hoocmôn Với lớp vỏ bọc như vậy, không những cáchạt đã có khả năng tương hợp sinh học tốt và tồn tại lâu trong cơ thể mà chúng còn

có thể được gắn một cách có điều khiển vào các vùng mô mong muốn Đặc biệttrong trường hợp của các hạt nano từ, khả năng tương tác của chúng đối với từtrường là lợi thế lớn nhất và quan trọng trong một loạt các ứng dụng y – sinh họcnhư:

- Tách, phân lập các tế bào và các thực thể sinh học ra khỏi một môi trường

hỗn hợp.

- Dẫn truyền thuốc, gen và các nuclide phóng xạ tới mô đích.

- Liệu pháp nhiệt – từ trong điều trị ung thư.

- Tăng độ tương phản ảnh trong phương pháp chẩn đoán bằng chụp cộng

hưởng từ.

1.1.3.1 Tách, phân lập các tế bào và thực thể sinh học ra khỏi một môi trường hỗn hợp

Trong y – sinh học, việc tách riêng các thực thể sinh học ra khỏi môi trườngtồn tại tự nhiên của chúng là rất cần thiết để thu được các mẫu tinh khiết dùng trongphân tích hoặc một số mục đích khác Quá trình sử dụng các hạt từ tương hợp sinhhọc để tách chiết thông thường bao gồm hai bước: (i) gắn hoặc đánh dấu các thựcthể sinh học bằng vật liệu từ và (ii) tách các thực thể này bằng một thiết bị tuyển từ.Khi đó các thực thể sinh học đã được gắn hạt từ sẽ được từ trường giữ lại hoặc lôi rakhỏi môi trường chứa chúng

Bước đầu tiên được thực hiện bằng cách biến đổi bề mặt của các hạt từ bằngphương pháp hoá học, thông thường là bọc hạt từ bằng các phân tử tương hợp sinhhọc như dextran, polyvinyl alcohol và phospholipid Bên cạnh vai trò như một cầunối giữa hạt từ với tế bào hoặc phân tử, lớp bọc còn nâng cao độ ổn định của chấtlỏng từ Sau quá trình bọc hạt, các chất là kháng thể hoặc các phân tử như hoócmôn

và axít folic sẽ được sử dụng để tạo liên kết với bề mặt tế bào Vì các kháng nguyênchỉ liên kết với kháng thể của chúng nên đây là một cách đánh dấu tế bào bằng cáchạt từ rất chính xác Hiện nay, các hạt từ được gắn kháng nguyên đã được gắn thànhcông với nhiều loại tế bào như tế bào hồng cầu, tế bào ung thư phổi, tế bào ung thư

cơ quan sinh dục hoặc với cả các vi khuẩn [29] Hầu hết các thí nghiệm nghiên cứucho đến nay đều sử dụng hạt sắt ôxít (Fe3O4 hoặc Fe2O3) vì chúng là nguyên tố cómặt trong cơ thể sinh vật và có bề mặt dễ biến đổi

Bước thứ hai, tách các thực thể sinh học ra khỏi hạt, được thực hiện nhờ sự

hỗ trợ của từ trường ngoài

Hình 1 Minh hoạ nguyên

lý sử dụng hạt nano từ và từ trường ngoài để tách các thực thể sinh vật [29]

Hình 1 minh hoạ đơn giản về nguyên lý tách các thực thể sinh vật ra khỏimột hỗn hợp sử dụng từ trường Các thực thể sinh vật có từ tính (được gắn với hạtnano từ màu đen) được tách ra khỏi dung dịch mang khi chúng chảy qua vùng tácdụng của một gradient từ trường

Cho đến nay tách chiết bằng từ trường đã được sử dụng thành công trong cáclĩnh vực nghiên cứu y học và sinh học Phương pháp này cho hiệu quả cao khi dùng

để tách các tế bào của một số loại ung thư ra khỏi máu Ngoài ra người ta đã tăngcường khả năng phát hiện vi rút sốt rét kí sinh trong các mẫu máu bằng việc tối ưuhoá tính chất từ của các vi rút kí sinh hoặc bằng cách đánh dấu các tế bào hồng cầuvới các hạt từ được gắn kháng nguyên Bên cạnh đó còn có các ứng dụng khác nhưkhuếch đại và phát hiện DNA, đếm tế bào (đo mômen từ của các hạt từ) và một sốcảm biến xác định vị trí cũng như định vị các tế bào chức năng trong cơ thể [29]

1.1.3.2 Dẫn truyền thuốc, gen và các nuclide phóng xạ tới mô đích

Khoảng 20 năm trở lại đây, đã có nhiều nghiên cứu về cách vận chuyển vàdẫn truyền thuốc nhằm mục đích làm tăng nồng độ thuốc chống ung thư trong khối

u mà không bị phân tán ở những vùng mô tế bào khoẻ mạnh Bằng cách này khôngnhững người ta có thể hạn chế các tác dụng phụ nguy hiểm nảy sinh trong quá trìnhđiều trị mà còn có thể giảm thiểu tối đa liều lượng thuốc đưa vào cơ thể Hầu hếtcác nghiên cứu tập trung vào kỹ thuật sử dụng từ trường để giữ các hạt từ “mangthuốc” ở vị trí các mô tế bào xác định, tránh không cho chúng trôi theo dòng máu

Hình 2 Minh hoạ về nguyên

lý vận chuyển

và tập trung thuốc [4].

Cơ sở của phương pháp dựa trên việc sử dụng các phân tử thuốc (thường làđộc đối với tế bào - cytotoxic) được gắn các hạt từ tương hợp sinh học (có thể đượcgọi là hạt mang) Hỗn hợp thuốc/hạt mang này được đưa vào cơ thể qua hệ tuầnhoàn Sau khi thâm nhập vào mạch máu, chúng được giữ lại ở các vùng mong muốnbằng một từ trường ngoài (nam châm) Khi đã được định vị, các phân tử thuốc cóthể được giải phóng theo cơ chế hoạt động của emzym hoặc do sự khác biệt về cácđiều kiện sinh lý ở vùng khối u như độ pH, độ thẩm thấu hoặc nhiệt độ [5] Nguyên

lý vận chuyển thuốc vào khối u dưới tác dụng từ trường của một nam châm vĩnhcửu được minh hoạ trên hình 2 So với các mô bình thường, khối u có số lượngmạch máu nuôi lớn hơn rất nhiều, do vậy khả năng cung cấp khối lượng thuốc cũngcao hơn [4]

Cấu trúc của một hạt từ kích thước nano mang thuốc gồm hai phần: (i) lõi hạt

từ (thường là sắt ôxít) được bọc bởi (ii) một lớp polymer tương hợp sinh học Cácpolymer thông dụng hiện nay là PVA hoặc dextran Trong một số trường hợp người

ta còn sử dụng lớp bọc vô cơ như silic ôxít Ngoài tác dụng bảo vệ các hạt khỏi ảnhhưởng của môi trường xung quanh, đặc điểm quan trọng nhất của lớp bọc là làm cầunối để chức năng hoá các hạt khi gắn vào chúng các nhóm carboxyl, biotin, avidin,carbodi-imide hoặc một số phân tử khác [29]

Hình 3 Cấu trúc của một hệ nano – thuốc

Có thểcoi phươngpháp sử dụnghạt từ để dẫntruyền thuốc làmột dạng hoá

trị cục bộ Cho đến nay có khoảng gần 50 loại hoá chất đang được sử dụng thườngxuyên trong điều trị ung thư [4] Các thuốc này tác động đến hệ gen của tế bào, canthiệp vào quá trình trao đổi chất hoặc phá huỷ cấu trúc và ngăn cản sự phát triển của

tế bào Chúng được phân loại thành nhiều nhóm dựa theo cơ chế hoạt động như:

- Các hợp chất alkyl hoá (cyclophosphamide, busulfan, mitoxantrone) có tácdụng với ADN Phản ứng với thuốc alkyl hoá làm quá trình nhân đôi của ADNtrong giai đoạn phân chia tế bào bị sai hỏng và do vậy giết chết tế bào

- Các chất chống chuyển hoá như 5-fluorouracil, methotrexate kiềm chế pha

S trong chu trình tế bào bằng cách ngăn lại quá trình tiền tổng hợp axít nucleic

- Các chất ngăn chặn sự phân bào (vincrictin, vinblastin) kiềm chế quá trìnhphân chia tế bào

- Antineoplastic antibiotics (adriamycin, bleomycin) ngăn chặn quá trìnhtổng hợp của ARN phụ thuộc vào ADN

Trong hoá trị, thông thường các thuốc không phân biệt được sự khác nhaugiữa tế bào khối u và các tế bào của mô khoẻ mạnh, do vậy chúng cũng làm hỏngcác tế bào bình thường này và gây ra các tác dụng phụ không mong muốn Chính vìvậy phương pháp hoá trị cục bộ có ưu thế hơn hẳn do tập trung được các tác nhânđiều trị hoá học ở vùng khối u, nhờ đó có thể giảm thiểu các tác dụng đối với môbình thường

Năm 1983, các hạt từ lần đầu tiên đã được sử dụng để mang thuốc(doxorubicin) tới các khối u được cấy trên chuột [34] Kết quả bước đầu rất khảquan khi trên 80% số chuột có các khối u đã giảm hoàn toàn so với trường hợp hoátrị thông thường với liều thuốc lớn hơn 10 lần Trong những năm thập kỉ 70,Kramer (1974) và Rahman (1974) đã tiến hành gắn các tác nhân daunorubicin,mercaptopurine và actinomycine vào hạt mang Các hạt này thường bị phá huỷtrong các cơ quan cơ thể bởi tác động cơ học và tác động của enzyme, do vậy khôngmang lại hiệu quả điều trị cao [34] Đến năm 1996, Bergemann lần đầu tiên tạođược liên kết hoá học trực tiếp giữa các tác nhân thuốc với chất lỏng từ (hạt từ đượcbọc bởi tinh bột – starch) [4], nhờ đó giải quyết được vấn đề không bền vững của

các hạt mang Sau đó Lubbe đã thử nghiệm tác dụng của chất lỏng từ này trên cơthể chuột và thấy rằng độc tính của chúng đối với cơ thể là rất thấp Vào năm 1997,Kuznetsov sử dụng các hạt đơn phân tán có lõi sắt hoặc sắt oxít, được gắn với mộtcấu trúc cácbon hoặc được bọc cácbon phía ngoài Kích thước hạt từ 0,01 đến 1micromet và hạt được kết hợp với dung dịch thuốc kháng ung thư Sau khi thửnghiệm điều trị trên hơn 100 bệnh nhân với nhiều loại ung thư khác nhau, kết quảcho thấy hầu hết các trường hợp đều khỏi hoặc tình trạng bệnh thoái lui đáng kể[23] Cũng vào năm này, Allen công bố chế tạo được các hạt tải từ tính có khả năngdẫn truyền thuốc (magnetically targetable carrier, MTCTM) với thành phần là hợpkim của sắt và than hoạt tính (kích thước 0,5  2 μm) được gắn với paclitaxel, mộttác nhân tiềm năng trong chữa trị ung thư đầu và cổ [6] Các hạt tải này có thể giảiphóng 38% lượng thuốc hấp phụ được vào huyết thanh trong vòng 24 h Chúng cóthể bị giữ bởi từ trường trong mạch máu nhỏ (tốc độ chảy 0.2 cm/s) và trong độngmạch chính (tốc độ chảy 28 cm/s) Một số kết quả thử nghiệm điều trị trên cơ thểngười cho đến nay cũng rất khả quan [4] Từ tháng 4 năm 2001 đến tháng 6 năm

2002, sử dụng một từ trường được chiếu vào vùng khối u, bốn bệnh nhân đã đượctiêm vào động mạch một dung dịch gồm các hạt sắt được bọc cácbon, có gắn cácphân tử dauxorubicine Một trong số đó có kích thước khối u thu nhỏ đáng kể, trongthời gian quan sát từ 5 đến 17 tháng Nhóm của Alexiou đã thực hiện một số nghiêncứu tiền điều trị, trong đó các hạt nano từ (đường kính 100nm) gắn cácmitoxantrone (của Wyeth-Pharma, Đức) được tiêm vào mạch máu của thỏ mangkhối u ung thư Một từ trường rất mạnh (1,7 T) đã được sử dụng để chiếu lên vùngkhối u Trong thí nghiệm dẫn thuốc này, toàn bộ khối u đã giảm hẳn chỉ cần sửdụng 20  50% liều thuốc hoá trị thông thường và không gây phản ứng phụ có hạinào [4]

Một số nhà khoa học cũng đưa ra ý tưởng khảo sát khả năng gắn các nuclonphóng xạ thay vì các tác nhân hoá trị vào các hạt từ Ưu thế của hệ này so với hệthuốc/hạt từ là các khối u không cần “bắt” các tác nhân mà vẫn chịu tác dụng củanuclon phóng xạ Các đồng vị phóng xạ khác nhau có thể được sử dụng để điều trị

trên các khoảng cách khác nhau, tuỳ thuộc theo bản chất của nguyên tố (ví dụ 90Y cóthể phát xạ tới 12 mm trong mô tế bào) Trong thí nghiệm thực hiện trên cơ thểchuột, nhóm của Hafeli đã tiêm các hạt từ đường tĩnh mạch tập trung ở gần mộtkhối u dưới da bụng và sử dụng một nam châm nhỏ ở phía trên Kết quả cho thấyphóng xạ phát ra từ các nguyên tử 90Y đã tiêu diệt được > 50% khối u [15].

Bên cạnh các kết quả khả quan đã đạt được cũng tồn tại một số hạn chế màphương pháp dẫn truyền thuốc sử dụng hạt từ cần phải vượt qua để có thể được ứngdụng chữa trị rộng rãi, đó là: (i) các mạch máu ở vùng mô đích có thể bị tắc do sựkết tụ với nhau của các hạt từ, (ii) không thể áp dụng các tham số điều trị trên cơ thểđộng vật đối với cơ thể người vì khoảng cách giữa các vùng điều trị lớn hơn và cầncường độ từ trường mạnh hơn, (iii) sau khi được giải phóng, thuốc không còn đượcđiều khiển bằng từ trường nên chúng vẫn có thể phân tán tự do trong cơ thể và cóthể làm tổn hại các tế bào khoẻ mạnh

Ngoài ra, hiệu quả của phương pháp còn phụ thuộc vào nhiều tham số vật lýnhư cường độ và sự không đồng nhất của từ trường, thể tích và tính chất từ của cáchạt Thông thường các chất lỏng từ được đưa trực tiếp vào cơ thể theo đường tĩnhmạch hoặc động mạch, do vậy các tham số động học như tốc độ của dòng máu,nồng độ chất lỏng từ, khả năng hấp thụ thuốc của tế bào ở vùng mô ung thư và thờigian lưu thông của hạt cũng rất quan trọng Bên cạnh đó cũng cần phải xét đến độsâu của vùng cần thuốc (khoảng cách tới nguồn phát từ trường), độ mạnh yếu củaliên kết giữa thuốc và hạt từ cùng với thể tích của khối u [25]

1.1.3.3 Tăng độ tương phản ảnh trong phương pháp chẩn đoán bằng chụp cộng hưởng từ.

Các hạt nano siêu thuận từ được tạo thành từ oxit sắt thường được sử dụngnhư tác nhân làm tăng độ tương phản ảnh trong chụp cộng hưởng từ Sự có mặt củachúng làm nhiễu loạn từ trường địa phương nên làm thay đổi giá trị từ trường đi rấtnhiều Dựa trên đặc tính của từng mô trong cơ thể mà độ hấp thụ hạt nano mạnh hayyếu Ví dụ, hạt nano có kích thước 30nm được bọc dextran có thể nhanh chóng đivào gan và lách trong khi ở các cơ quan khác thì chậm hơn Như vậy, mật độ hạt

nano ở các cơ quan là khác nhau dẫn đến sự nhiễu loạn từ trường địa phương cũngkhác nhau làm tăng độ tương phản trong ảnh cộng hưởng từ [14].

1.1.3.4 Liệu pháp nhiệt – từ trong điều trị ung thư

Phương pháp nhiệt-từ trị sử dụng trong chữa trị ung thư được Gilchrist vàcác cộng sự đề xuất lần đầu tiên cách đây khoảng 50 năm [8] Ý tưởng của ông làtập trung các hạt từ trong vùng khối u và sau đó đốt nóng chúng dưới tác dụng củamột từ trường xoay chiều, do vậy chỉ những vùng mô tế bào nào có chứa hạt từ mớichịu tác dụng của nhiệt (hình 4)

Hình 4 Minh hoạ về quá trình đốt nhiệt sử dụng hạt

nano từ

Trong thí nghiệmcủa Gilchrist, các hạt

Fe3O4 với kích thước0,02  0,1 μm đượctiêm vào màng trongthành ruột của chó để chúng có thể tập trung trong vùng các hạch bạch cầu Sau đócác hạch này được cắt ra khỏi cơ thể và đưa vào vùng từ trường xoay chiều cócường độ 200  240 Oe Kết quả cho thấy nồng độ 5 mg hạt từ trên mỗi gam hạchbạch cầu có thể đạt được tốc độ tăng nhiệt 14 oC/3 phút Hai năm sau đó, cũngnhóm này tiếp tục thực hiện nghiên cứu thử nghiệm trên thỏ và thu được kết quả tốtkhi các hạch đã bị hoại tử hoàn toàn sau 3 phút đốt nóng trong từ trường 470 Oe Kể

từ các thành công ban đầu này, nhiệt-từ trị sử dụng hạt từ đã được coi như một trongnhững phương pháp triển vọng nhất trong cuộc chiến chống lại ung thư Phươngpháp này sau đó được phát triển theo ba hướng, phân loại bởi các cách đưa hạt từvào vùng khối u [27]:

- Nhiệt trị theo đường động mạch (AEH – arterial embolizationhyperthermia): cơ sở của phương pháp dựa vào đặc điểm là các khối u gan được

khối u hạt từ

từ trường xoay chiều

nuôi bởi hệ động mạch gan, trong khi các mô tế bào gan bình thường lại nhận đượcnguồn cung cấp máu từ hệ tĩnh mạch chủ Khi tiêm các hạt từ vào đường độngmạch gan, người ta thấy rằng chúng tập trung ở vùng khối u với nồng độ cao hơnhẳn những vùng khác Phương pháp này rất phù hợp với việc chữa trị ung thư gan

ác tính và cũng là cơ sở của một số phương pháp được sử dụng hiện nay như xạ trịchọn lọc (selective internal radiation therapy), hoá trị động mạch gan (hepaticarterial chemotherapy) và hoá trị liên động mạch (transaterial chemoembolization).Cho đến nay chưa có thí nghiệm nhiệt trị động mạch nào được thực hiện trên cơ thểbệnh nhân nhưng đã có một số thí nghiệm thực hiện trên cơ thể thỏ và lợn [26] Thínghiệm đầu tiên sử dụng các hạt magnemite (Fe3O4) đường kính 150 nm phân tántrong lipiodol (một hỗn hợp của iốt với dầu thực vật) Trong từ trường xoay chiều(53 kHz; 30 kA/m), nhiệt độ đốt các tế bào đã tăng lên đến 48 oC trong 5 phút Dolipiodol gây ra một số tác dụng phụ với tế bào và mô nên sau đó các hạt Fe3O4 nàyđược bọc trong một hạt polymer nền (SIR-Sphere của công ty Sirtex Medical Ltd –

Úc, đường kính hạt nền vào khoảng 32 μm) và phân tán trong dung dịch Tween 1%.Các hạt nền này là an toàn và tồn tại lâu, gây ảnh hưởng không đáng kể cũng nhưkhông mất tính sắt từ sau 28 ngày được tiêm vào cơ thể cũng như làm thay đổi mứcion serium hoặc ferritin, cho thấy các hạt không mất trạng thái sắt từ

- Nhiệt trị tiêm trực tiếp (DIH – direct injection hyperthermia): đây làphương pháp tiêm trực tiếp dung dịch của các hạt sắt từ có kích thước tương đối lớnvào vùng khối u và sau đó sử dụng từ trường xoay chiều để đốt nóng chúng, vì vậynhiệt tạo ra từ các hạt bên ngoài tế bào Ngược lại với nhiệt trị động mạch là nhiệttoả ra từ các hạt sắt từ trong mạch máu

- Nhiệt trị nội bào (IH – intracellular hyperthermia): đây là phương phápnhiệt-từ trị sử dụng các hạt từ phức tạp hơn Các hạt có thể được bọc với các khángthể đặc hiệu và được đưa đến khối u qua đường động mạch hoặc tiêm trực tiếp Một

số nghiên cứu cho thấy các hạt từ này sau đó có thể chui vào tế bào ung thư nênngười ta thường gọi đây là phương pháp nhiệt trị nội bào Ngoài ra các hạt từ vẫnđược tập trung ở bên ngoài tế bào và đóng góp vào quá trình đốt nóng khối u [27]

Một số kết quả nghiên cứu về liệu pháp nhiệt-từ trị chữa ung thư:

Kết quả nghiên cứu trên động vật:

Thí nghiệm tiên phong của Gilchrist và các cộng sự thực hiện vào năm 1957

đã mở ra nhiều vấn đề nghiên cứu, không chỉ trên lĩnh vực y sinh cơ bản mà còn làcác vấn đề về từ học hạt nano và kĩ thuật điều trị Sau đó, có nhiều thí nghiệm đãđược thực hiện trên cơ thể các động vật như chuột, thỏ, chó và lợn [27] Nhìnchung, hầu hết các nghiên cứu này đều cho thấy có thể đạt được nhiệt độ cao đủ đểtiêu diệt các khối u trên cơ thể động vật Năm 1979, Gordon và các cộng sự lần đầutiên sử dụng chất lỏng từ gồm các hạt magnetite được bọc dextran để chữa ung thư

vú trên chuột Khác biệt chính trong thí nghiệm của Gilchrist và Gordon là các hạt

từ Gilchrist sử dụng có kích thước khá lớn, trong khi các hạt trong thí nghiệm củaGordon có kích thước trung bình 6 nm 100 mg magnetite đã được tiêm chậm vàotĩnh mạch đuôi chuột trong hơn 10 phút Sau 48h, chuột được đặt vào trong một từtrường xoay chiều trong 12 phút Nhiệt độ vùng khối u không được đo trực tiếptrong quá trình điều trị nhưng Gordon đã xác định công suất toả nhiệt của các hạt từ

qua các thí nghiệm ex-vivo với các khối u đã được cắt ra ngoài Tốc độ tăng nhiệt

được ghi nhận trong thí nghiệm này là 8 oC trong 12 phút Chuột đã chết sau thínghiệm 1 tuần, và hầu hết các hạt magnetite được tìm thấy trong gan, lách và thận.Qua các ảnh hiển vi điện tử, Gordon đã phát hiện thấy có một số hạt từ đã bị “nuốt”bởi các tế bào trong khối u ung thư Từ kết quả này, Gordon đã đề xuất khái niệm

về phương pháp “nhiệt trị nội tế bào” với nguyên lý đốt nóng từng tế bào ung thưđơn lẻ bằng việc đưa các hạt từ vào bên trong chúng, sau đó tác dụng từ trườngxoay chiều [11]

Sau đó vào những năm 1986-1989, Lerrch và Pizzarello đã cố gắng lặp lại vàtìm hiểu kĩ hơn thí nghiệm của Gordon trong các điều kiện thí nghiệm tương tự,nhưng kết quả thu được lại rất khác biệt [22] Khả năng bắt các hạt magnetite củacác tế bào trong gan, lách và phổi lớn hơn rất nhiều so với các tế bào trong khối u.Các nghiên cứu cho thấy thể tích khối u đã phát triển gấp đôi theo thời gian 60ngày sau thí nghiệm, chỉ có một số khối u không thay đổi, tuỳ theo số lần chiếu từ

trường xoay chiều Các phép đo nhiệt độ ngay sau mỗi lần chữa trị cũng cho thấynhiệt độ trong vùng khối u không tăng lên, mặc dù cường độ từ trường là rất cao (40kA/m).

Một số thí nghiệm khác cũng cho thấy những kết quả khả quan của liệu phápnhiệt – từ trị chữa ung thư trên động vật Năm 1983, Luderer và các cộng sự đã điềutrị các khối u sarcoma Meth-A trên chuột bằng các hạt sắt gốm - thuỷ tinh kíchthước 1,5 µm trong từ trường 10 kHz và 40 kA/m 50% động vật đã hoàn toànkhông còn khối u sau 5 ngày chữa trị [22] Sau đó vào năm 1997, nhóm của Jordantiến hành thí nghiệm trên chuột được cấy khối u vú C3H và đã công bố kết quả với

tỉ lệ 44 % sống sót và có khối u nhỏ đi hoặc biến mất sau 2 tháng kể từ khi điều trị[21] Kết quả tốt nhất được công bố bởi Yanase và các cộng sự vào năm 1998, chothấy 87,5 % số chuột với các khối u không tái phát triển trong vòng ba tháng [35](hình 4) Sử dụng các magnetoliposome (một loại hạt từ bao gồm lõi là hạt Fe3O4được bọc bởi một lớp mỡ bên ngoài) được gắn với các phân tử kháng thể, Le và cáccộng sự đã công bố thành công trong việc khống chế các khối u [16] Và cho đếnnay, song song với các thí nghiệm trên động vật còn có một số bằng phát minh sángchế về phương pháp nhiệt trị sử dụng hạt từ đã được đăng kí [15, 32]

Hình 5 Quá trình phát triển khổi u trên cơ thể chuột trong thí nghiệm của Yanase và các

cộng sự [35]

Mỗi đường cong tương ứng với một chuột thí nghiệm theo thời gian áp dụng điều trị trong

từ trường xoay chiều Sự tái phát triển của khối u không còn xuất hiện sau 3 tháng [35].

Kết quả nghiên cứu trong nuôi cấy tế bào in vitro

Nhiều nghiên cứu về nhiệt - từ trị cũng được thực hiện với các thí nghiệm

trên các dòng tế bào ung thư nuôi cấy in vitro Mục đích chính của các thí nghiệm

này là thử nghiệm tính tương hợp sinh học của các hạt Fe3O4 đã được bọc cácpolymer bề mặt và khảo sát tương tác của các hạt từ với các loại tế bào khác nhautrong dung dịch Các vỏ bọc thường được sử dụng là dextran, carboxydextran,citrate, polyethleneglycol hoặc starch Độc tính của các hạt từ này đã được nghiêncứu bởi Hafeli và Pauer [13]

Vào năm 1993, Chan và các cộng sự đã tiến hành thí nghiệm đốt nhiệt - từ in

vitro với các hạt Fe3O4 bọc dextran (được gọi là các hạt ôxít sắt từ tính dạng keo,CMIO – colloidal magnetic iron oxide) Các hạt CMIO dextran không có độc tínhvới các tế bào được ủ trong 24h với nồng độ hạt 10 mg/ml Sau thí nghiệm đối vớicác tế bào ung thư phổi dòng A549, Chan đã đưa ra kết luận rằng các tế bào ung thư

bị tiêu diệt hoàn toàn là do tác dụng của nhiệt [7] Cũng vào năm này, nhóm nghiêncứu của Jordan đã thử nghiệm khả năng bắt hạt từ của các tế bào carcinoma ngườikhi đặt các khối u vào môi trường chất lỏng từ (các hạt ôxít sắt được bọc dextran)trong nhiều ngày Qua các ảnh chụp hiển vi điện tử, Jordan nhận thấy lớp bọcdextran của nhiều hạt đã bị hyđrát hoá bởi các enzyme tiêu hoá Quá trình phá vỡlớp bọc dextran khiến các hạt bị kết tụ lại thành chuỗi bên trong tế bào Dựa vào cáckết quả trên, Jordan đã đưa ra kết luận rằng trên thực tế các tế bào ung thư có thểbắt đủ lượng hạt từ, nhưng do lớp bọc dextran bị phá huỷ và các hạt từ kết tụ lại vớinhau nên nhiệt lượng toả ra từ bên trong tế bào thấp hơn yêu cầu, do vậy hầu hết các

tế bào đều có thể sống sót sau chiếu từ trường xoay chiều Mặc dù không đạt đượchiệu quả tốt trong nhiệt-từ trị nội tế bào với các hạt Fe3O4 bọc dextran nhưng Jordanvẫn rất tin tưởng vào khả năng ứng dụng của phương pháp này khi sử dụng một sốvật liệu với các loại vỏ bọc khác

Ngược lại với quan điểm về nhiệt trị nội bào của Jordan, một số nhómnghiên cứu khác là Hergt [16], Rabin [31] và Neuberger [28] đã đưa ra các ý kiếncho rằng tác dụng của nhiệt ở mức độ tế bào là không đáng kể và hoàn toàn không

có lý do gì để phân biệt giữa “nhiệt trị nội bào” với “nhiệt trị ngoại bào” Điều quantrọng trong việc điều trị là phải đạt được nồng độ hạt từ trong khối u đủ cao, bấtchấp vị trí của hạt từ ở trong hay ở ngoài tế bào ung thư.

Một số thí nghiệm in vitro cũng được tiến hành với mục đích nghiên cứu khả

năng các hạt từ được gắn hướng đích lên tế bào ung thư Năm 1995, Suzuki đã đạtđược hiệu quả khi gắn các kháng thể đơn dòng đặc hiệu với tế bào ung thư dòngBM314 lên hạt nano từ bọc PEG Sau thời gian ủ, trên mỗi tế bào BM314 tác giả đãphát hiện thấy có 90pg sắt từ, cao gấp bốn lần so với trên các tế bào không đượcgắn Tuy nhiên hiệu suất gắn hạt từ này vẫn là thấp để có thể tạo được tác dụng điềutrị bằng nhiệt độ đối với các tế bào ung thư

Kết quả nghiên cứu áp dụng với bệnh nhân

Mặc dù đã thu được một số kết quả khả quan nhưng việc tiến đến áp dụngthử nghiệm trên cơ thể người vẫn gặp nhiều khó khăn, chủ yếu do kích thước cácthiết bị thường tương đối nhỏ và chỉ phù hợp với cơ thể động vật Vào giữa nhữngnăm 1990, nhóm nghiên cứu của Jordan đã đẩy mạnh phát triển phương thức nhiệt-

từ trị để bước đầu thử nghiệm trên cơ thể người [21, 22] Mục tiêu của nghiên cứu

là cố gắng đạt được lượng hạt từ có nồng độ đủ cao ở vùng khối u, và sau đó điềukhiển chính xác nhiệt độ đốt bằng việc tính toán chính xác công suất toả nhiệt vàphân bố hạt từ trong khối u Trước tiên, các phân bố của các hạt từ phải được quansát bằng các thiết bị như siêu âm, chụp xạ hoặc MRI sau khi tiêm vào trong cơ thể.Sau đó, sử dụng phân bố không gian và công suất toả nhiệt (SLP) của các hạt từ đểtính chính xác khoảng tăng nhiệt độ trong vùng khối u Nhiệt độ được đo với việc

sử dụng các đầu dò quang học được đưa vào cơ thể Quá trình đốt nóng có thể đượcđiều khiển bởi các thông số như cường độ từ trường và thời gian chiếu Tuy nhiênngay cả với khối u có dạng hình cầu, đạt được sự phân bố đồng nhất các hạt từ cũng

là rất khó khăn Cho đến nay nhóm nghiên cứu của Jordan đã chế tạo một thiết bịtạo từ trường xoay chiều MFH – 300 F với tần số 100 kHz và cường độ 18 kA/m(hình 6) và bắt đầu thử nghiệm chữa trị một số loại ung thư trên cơ thể người [9, 10,17-20]

Hình 6 Thiết bị MFH-300F (công ty MagForce) dùng trong nhiệt – từ trị [21]

1.2 Chụp cộng hưởng từ hạt nhân (MRI)

1.2.1 Lịch sử phát triển của kĩ thuật chụp cộng hưởng từ hạt nhân

Chụp cộng hưởng từ hay MRI (Magnetic Resonance Imaging) là một kỹ

thuật chẩn đoán y khoa tạo ra hình ảnh giải phẫu của cơ thể nhờ sử dụng từ trường

và sóng radio Phương pháp này không sử dụng tia X nên có độ an toàn cao chobệnh nhân Máy chụp cộng hưởng từ là một thiết bị nhạy cảm và đa năng giúp tathấy hình ảnh các lớp cắt của các bộ phận cơ thể từ nhiều góc độ trong một khoảngthời gian ngắn

Chụp cộng hưởng từ là một phương pháp chẩn đoán hình ảnh hiện đại, hiệuquả và phổ biến trên thế giới Ngày nay, MRI được sử dụng để kiểm tra gần nhưmọi cơ quan trong cơ thể Kỹ thuật này đặc biệt có giá trị trong việc chụp ảnh chitiết não hoặc dây cột sống Kể từ khi MRI mang lại những hình ảnh 3 chiều, bác sĩ

có thể nắm được thông tin về địa điểm thương tổn Những thông tin như vậy rất cógiá trị trước khi phẫu thuật chẳng hạn như tiểu phẫu não

Nguyên lý cộng hưởng từ hạt nhân được Felix Block và Edward Puroel pháthiện vào năm 1946, cộng hưởng từ được ứng dụng rộng rãi từ năm 1950 Năm

1952, hai nhà vật lý Felix Block và Edward Puroell được trao giải Nobel Vật lý nhờ

sự phát hiện và ứng dụng cộng hưởng từ Năm 1980, chiếc máy cộng hưởng từ đầutiên trên thế giới được đưa vào hoạt động để tạo ảnh cơ thể người Năm 1987, MRIđược ứng dụng trong chẩn đoán các bệnh lý tim mạch bằng kỹ thuật cardiac MRI.Năm 1993, ứng dụng MRI để chẩn đoán các bệnh lý não, thần kinh Ngày nay, kỹthuật tạo ảnh cộng hưởng từ (MRI) đã trở thành phổ biến trong y học chẩn đoánhình ảnh trên thế giới cũng như tại các bệnh viện lớn của Việt Nam

Hình 7 Hình ảnh chụp cộng hưởng từ chẩn đoán ung thư

1.2.2 Nguyên

lý và kỹ thuật

chụp cộng

hưởng từ hạt nhân (MRI)

 Từ tính của hạt nhân nguyên tử

Như chúng ta đã biết các hạt cơ bản của nguyên tử đều mang điện tích nhưproton mang điện dương, electron mang điện âm và với đặc tính tự quay quanh trục(tính chất spin) thì chúng đều sinh ra một từ trường Hạt nhân của nguyên tử hydro

chỉ chứa duy nhất một một proton (không có neutron) nên nó còn được gọi đơn giản

là proton Hydro chiếm một lượng lớn trong thành phần của nước và mỡ, nhữngchất có mặt ở hầu hết các mô của cơ thể, vì thế nó đóng một vai trò rất quan trọngtrong việc tạo hình ảnh cộng hưởng từ

Khi không có tác dụng của từ trường ngoài, các proton quay quanh trục của

nó với hướng các trục quay hoàn toàn ngẫu nhiên Khi đó, từ trường của chúng sẽtriệt tiêu nhau làm từ trường tổng số bằng zero

Khi có tác động của từ trường ngoài, ký hiệu là B0, các proton sẽ chịu tácđộng của từ trường ngoài và định hướng lại trục quay của mình theo hướng từtrường ngoài B0, một số có trục quay cùng chiều với chiều của B0, một số lại có trụcquay ngược chiều với B0 Thực tế đo đạc cho thấy, với một triệu proton trong cơthể, số lượng proton cùng chiều với B0 chỉ nhiều hơn một hoặc hai so với các protonngược chiều Sự khác biệt rất nhỏ này được gọi là độ từ hóa thực M0, từ trường cơ

sở để tạo ra tín hiệu cộng hưởng từ Độ từ hóa thực tăng lên khi cường độ từ trường

B0 tăng, có nghĩa là tín hiệu cộng hưởng từ tỉ lệ thuận với độ lớn của B0[1, 3, 12]

 Tần số cộng hưởng

Tốc độ quay của các proton đều giống nhau và phụ thuộc vào từ trườngngoài Mối liên hệ giữa tấc độ quay của proton và cường độ từ trường được diễn tảbằng phương trình Larmor :

f = γBB

f là tần số cộng hưởng

B là cường độ từ trường

γB là hằng số Larmor (42,58MHZ/T)[3, 12]

 Hiện tượng cộng hưởng từ

Để mô tả hiện tượng cộng hưởng từ, chúng ta xây dựng một hệ trục tọa độvuông góc với 3 trục xyz như trong hình…Trục z là trục thẳng đứng theo chiều tácdụng của từ trường ngoài B0 và mặt phẳng xy vuông góc với trục z Từ trường ngoài

B0 gây ra một độ từ hóa thực M0 có vector hướng cùng chiều với B0, vì vậy độ từ

hóa thực còn được gọi là độ từ hóa dọc Các proton luc này đang quay với tần sốγBB0.

Hình 8 Sự tạo thành vector từ hoá thực

Lúcnày, nếu phát

radio (xungRF-xung kíchthích) quayquanh trục z với tần số cộng hưởng γBB0, tạo một từ trường B1 vuông góc vơi B0 vớicùng tần số cộng hưởng γBB0 của các proton Như vậy với các proton, B1 là từtrương tĩnh Dưới tác dụng của từ trường B1 trong một khoản thời gian nhất định,vector M0 thay đổi và lệch khỏi trục z một góc α (góc lật) Giá trị của α phụ thuộcvào độ lớn của B1 và thời gian phát xung Khi α bằng 90o, độ từ hóa thực sẽ bị lậtngang vào mặt phẳng xy và lúc này độ từ hóa thực trở thành độ từ hóa ngang Độ từhóa ngang quay quoanh trục z làm xuất hiện một sóng radio có thể đo được, đóchính là tín hiệu cộng hưởng từ

Hình 9 Vector từ hoá ngang vuông góc với

Oz

Khi tắt xungkích thích RF, độ từhóa ngang giảm dầnrồi mất hẳn kéo theotín hiệu cộng hưởng

từ cũng giản dần rồi mất hẳn Khoảng thời gian này gọi là T2 Trên thực tế, người tacoi T2 là khoảng thời gian tín hiệu mất khoảng 63% độ lớn so với ban đầu Đồngthời với quá trình hồi dãn ngang, lúc này, khi đã tắt xung RF thì dưới tác dụng của

từ trường duy nhất B0, các proton tương tác với từ trường dẫn đến khôi phục lại độ

từ hóa dọc M0 ban đầu Khoảng thời gian này gọ là T1 T1 được xem như khoảngthời gian cần thiết để độ từ hóa dọc khôi phục lại 63% độ lớn M0 ban đầu của nó [1,3]

 Các nguyên lí tương phản trong kĩ thuật chụp cộng hưởng từ

 Độ tương phản ảnh.

Khi chụp ảnh cộng hưởng từ, sự khác biệt cấu trúc giữa các mô được xácđịnh bằng sự khác biệt về cường độ tín hiệu giữa chúng Thông thường, cường độtín hiệu được biểu hiện trên hình bằng bằng mức độ đen trắng, cường độ càng caothì cấu trúc càng trắng và ngược lại Mức độ khác biệt đen trắng này được gọi là độtương phản của hình

Để có được đủ dữ liệu cho một hình ảnh cộng hưởng từ, chúng ta cần phảiphát xung kích thích nhiều lần, tương ứng với nhiều lần đo tín hiệu Khoảng cáchthời gian giữa hai lần phát xung kích thích được gọi là thời kích TR Khoảng cáchthời gian từ lúc phát xung kích thích đến lúc thực hiện đo tín hiệu được gọi là thờivang TE Ngoài thời kích TR và thời vang TE, người ta có thể sử dụng một góc lật

α nhỏ hơn 90o với mục đích chỉ làm lật một phần vector từ hóa dọc thành vector từhóa ngang đủ tạo ra một lượng tín hiệu cần thiết, giảm bớt thời gian khôi phục hoàntoàn vector từ hóa dọc [3]

độ từ hóa ngang ở lần kích thích tiếp theo khá lớn, trong khi đó mô có T1 dài chỉ

khôi phục được một phần độ từ hóa dọc nên độ từ hóa ngang tương ứng ở lần kíchthích tiếp theo sẽ nhỏ Khi đó, nếu đo tín hiệu tại một thời điểm khá ngắn sau khiphát xung kích thích (thời vang TE ngắn), tín hiệu của mô có T1 ngắn sẽ cao (màutrắng) còn tín hiệu của mô có T1 dài sẽ thấp (màu đen) Cụ thể là dịch (nước) sẽ cómàu đen, mỡ màu trắng nhất và các mô mềm màu xám [3].

Trong nguyên lí chụp trọng T2 (còn gọi tắt là chụp T2), người ta tận dụng sựkhác biệt thời gian T2 giữa các mô, nghĩa là tốc độ suy giảm tín hiệu: mô có T2càng ngắn, tấc độ suy giảm càng nhanh Trước tiên người ta dùng thời kích TR đủdài để độ từ hóa dọc của các mô đều khôi phục hoàn toàn, cho ra độ từ hóa ngangtốt nhất có thể khi có xung kích thích Sau khi phát xung kích thích, ta đo tín hiệutại một thời điểm khá dài sau đó (thời vang TE dài) Lúc này các mô có thời gian T2ngắn hầu như đã mất hết tín hiệu, các mô có thời gian T2 dài chỉ mất một phần tínhiệu cho ra hình trọng T2, trong đó mô có T2 dài sẽ có tín hiệu cao (màu trắng) còn

mô có T2 ngắn sẽ có tín hiệu thấp (màu đen) Cụ thể là nước sẽ có màu trắng nhất,các mô mềm có màu xám, các mô có tín hiệu suy giảm cực nhanh (T2 cực ngắn)như vỏ xương thì rất đen[3]

1.2.3 Ưu điểm của chụp cộng hưởng từ hạt nhân (MRI)

- Ảnh của cấu trúc các mô mềm trong cơ thể như tim, phổi, gan và các cơquan khác rõ hơn và chi tiết hơn so với ảnh được tạo bằng các phương pháp khác

- MRI giúp cho các bác sĩ đánh giá được các chức năng hoạt động cũng nhưcấu trúc của nhiều cơ quan nội tạng trong cơ thể

- Sự chi tiết làm cho MRI trở thành công cụ vô giá trong chẩn đoán thời kìđầu và trong việc đánh giá các khối u trong cơ thể

- Tạo ảnh bằng MRI không gây tác dụng phụ như trong tạo ảnh bằng chụp Xquang thường quy và chụp CT

- MRI cho phép dò ra các điểm bất thường ẩn sau các lớp xương mà cácphương pháp tạo ảnh khác khó có thể nhận ra

- MRI có thể cung cấp nhanh và chuẩn xác so với tia X trong việc chẩn đoáncác bệnh về tim mạch

- Không phát ra các bức xạ gây nguy hiểm cho con người[3].

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Chuột nhắt trắng (Mus muscullus) dòng Swiss

Chuột nhắt trắng Swiss 8 tuần tuổi (trọng lượng 18 - 20g) dùng để gây u,được Viện vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp Chuột được nuôi trong điều kiệnnhiệt độ ổn định 25 – 27ºC, được cung cấp thức ăn và nước uống đầy đủ, đảm bảokhỏe mạnh khi bắt đầu thí nghiệm

Hình 10 Chuột nhắt trắng Swiss

2.1.2 Một số dòng tế

bào ung thư và tế bào

lành

2.1.2.1 Các dòng tế bào ung thư

Bảng 1 Một số dòng tế bào ung thư sử dụng trong luận văn và đặc điểm của chúng

Hình thái Tế bào mô

liên kết Tế bào biểu mô Tế bào biểu mô

Tế bào biểu mô

Tế bào biểu mô

Cách thức

phát triển Trôi nổi

Bám dính đơn lớp

Bám dính đơn lớp

Bám dính đơn lớp

Bám dính đơn lớp

Môi

trường

nuôi cấy

RPMI 1640 + 5-10% FBS + 1% PeniSepto

RPMI 1640 + 5-10% FBS + 1% PeniSepto

DMEM + 10% FBS + 1%

5-PeniSepto

DMEM + 10% FBS + 1% PeniSepto

DMEM + 10% FBS + 1% PeniSepto

5-Môi

trường

bảo quản

RPMI 1640 + 50% FBS +10% DMSO

RPMI 1640 + 50% FBS +10% DMSO

2.1.3 Vật liệu nano từ (hay chất lỏng từ)

2 loại vật liệu nano từ được sử dụng là H01 và E6

H01 – dung dịch hạt nano từ Fe3O4 bọc bằng axit Oleic và gắn Curcumin.Hàm lượng sắt là 7.2 mg/ml, 10% Curcumin

E6 – dung dịch hạt nano từ Fe3O4 bọc bằng Copolime poli (axit acrylic –styrene) Hàm lượng sắt là 10mg/ml

Hình 11 Ảnh SEM của mẫu E6 – dung dịch hạt nano

từ Fe 3 O 4 bọc bằng Copolime poli (axit acrylic – styrene), hạt

có kích thước khoảng 100nm

H01 và E6 được cung cấp bởi nhóm nghiên cứu vật liệu Nano Y sinh ở ViệnKhoa học Vật liệu, trung tâm Khoa học Tự nhiên và công nghệ Quốc gia

2.2 Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm

2.2.1 Môi trường nuôi cấy

 Môi trường nuôi cấy RPMI 1640 của Gibco BRL (Mỹ)

 Môi trường nuôi cấy DMEM low/high Glucose của Gibco BRL (Mỹ)

2.2.2 Hóa chất

 FBS: Invitrogen, Mỹ

 PBS: Invitrogen, Mỹ

 Trypan Blue 0,4% của Merk

 Nước cất và nước khử ion đã được khử trùng

 Penicillin-Streptomycine 100 IU/ml của Invitrogen, Mỹ

 Trypsine: của Gibco BRL (Mỹ)

 Thuốc gây mê Thiopental

 Acid Sulfuric 98% và acid Perchloric 15%

2.2.3 Máy móc thiết bị

 Tủ hood của Esco, Mỹ

 Tủ ấm CO2 của Shell Lab, Mỹ

 Kính hiển vi soi ngược Axiovert 40CFL của Carl Zeiss, Đức

 Kính hiển vi quang học của Carl Zeiss, Đức

 Pipette aid của Gilson

 Pipette man 1ml, 200µl, 100µl, 10µl của Gilson

 Máy li tâm Universal 320

 Bình ổn nhiệt Gra Operation SS40-1, Đức

 Máy lọc khí IQAir Cleanroom, Thụy sỹ

 Nồi hấp ALP,Ltd, Nhật, Model CL-32L

 Máy chụp ảnh cộng hưởng từ 1.5T (Philips)

 Máy phát từ trường xoay chiều RDO, Model HFI của Mỹ

 Máy quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) Shimazdu của Nhật

2.2.4 Vật tư tiêu hao

 Chai nuôi cấy T25, T75, đĩa Pettri các cỡ, đĩa 24 giếng của Corning (Mỹ)

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp tạo u rắn dưới da và cơ đùi cho chuột nhắt trắng Swiss bằng cấy ghép dòng tế bào Sarcoma 180

Phương pháp tạo u rắn cho chuột nhắt trắng Swiss được tiến hành theophương pháp thường quy của nhóm Nghiên cứu Ung thư Thực nghiệm:

Trích báng chuột (đã giữ giống 10 - 12 ngày) bằng kim tiêm loại 18G rồiđem pha loãng bằng dung dịch sinh lý PBS Xác định mật độ tế bào và tỉ lệ chết(sau khi nhuộm với blue trypan) bằng buồng đếm Thoma dưới kính hiển vi quanghọc Sau đó đem pha huyền dịch tế bào sao cho có mật độ 5 x 106 tế bào/ml

2.3.1.1 Tạo u rắn dưới da

Tiêm 0.2ml huyền dịch vừa pha vào dưới da chuột (vị trí tiêm là phần ngực,lệch sang bên phải, trước khi tiêm tiến hành tẩy sạch lông chuột quanh vị trí tiêm)mỗi chuột (tương đương 1x106 tế bào ung thư/con) Sau khi cấy ghép tế bào ungthư, chuột được phân lô, đánh dấu, chăm sóc cẩn thận và theo dõi sự phát triển của

u rắn đã tạo

2.3.1.2 Tạo u đùi

Tiêm 0,2ml huyền dịch vừa pha vào bắp đùi mỗi chuột (tương đương 1x106

tế bào ung thư/con) Sau khi cấy truyền ung thư chuột được phân lô, chăm sóc cẩnthận và theo dõi sự phát triển của u rắn đã tạo

Hằng ngày theo dõi sự phát triển của khối u bằng cách quan sát và đo kíchthước, tính thể tích u Tiến hành đo chiều dài và chiều rộng của khối u bằng thướckẹp hoặc thước dây Sau đó tính khối lượng của u bằng công thức:

V(mg) = a x b2/2Trong đó a là chiều dài của u (mm)

sẽ có màu sáng lấp lánh, tế bào chết sẽ có màu xanh của thuốc nhuộm Đếm bằngbuồng đếm Thoma, tính tỷ lệ tế bào sống Qua đó xác định nồng độ độc ngưỡng củaH01 và E6 đối với từng dòng tế bào Nồng độ độc ngưỡng là nồng độ hạt từ khi ủvới tế bào đang nuôi cấy thì tỷ lệ sống của tế bào là trên 70%