XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG METRONIDAZOL TRONG HUYẾT TƯƠNG CHÓ BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Bùi Thị Thanh Châm*, Nguyễn Thu Quỳnh, Nguyễn Khắc Tùng, Đoàn Thanh Hiếu Trường Đại học Y- Dược – ĐHTN TÓM TẮT Metronidazol dẫn chất nitroimidazol sử dụng từ lâu điều trị bệnh vi khuẩn kị khí, động vật nguyên sinh amip, Giardia Mục đích nghiên cứu nhằm thẩm định nồng độ metronidazol huyết tương chó phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) với chuẩn nội carbamazepin bước sóng 320nm Sau kết tủa protein huyết tương acetonitril, metronidazol chuẩn nội tiến hành định lượng với điều kiện sắc ký: cột RESTEK untra C18 (5àm 250ì4,6mm) nhit 25C, pha ng acetonitril : đệm K2HPO4 pH 4,5 tỷ lệ 30:70 (v/v), tốc độ dịng 1,0 ml/phút Phương pháp phân tích có giới hạn định lượng 0,02 μg/ml, RSD < 20% Khoảng tuyến tính 0,2 - 40 µg/ml Độ xác 4,22 – 11,65% Độ 100,68 – 106,49% Phương pháp sử dụng đánh giá sinh khả dụng metronidazol giải phóng đại tràng Từ khóa: Định lượng, Metronidazol, huyết tương chó, sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) ĐẶT VẤN ĐỀ Metronidazol dẫn chất - nitro - imidazol, có phổ hoạt tính rộng động vật nguyên sinh amip, Giardia vi khuẩn kị khí Thuốc có tác dụng mạnh điều trị nhiễm động vật nguyên sinh Entamoeba histolytica, Giardia lamblia Trichomonas vaginalis [1] Với mục đích tăng cường tác dụng điều trị đồng thời làm giảm tác dụng không mong muốn metronidazol, nghiên cứu bào chế viên metronidazol giải phóng đại tràng Để đánh giá mức độ giải phóng, hấp thu thuốc đích cần định lượng nồng độ thuốc huyết tương sau uống Vì vậy, tiến hành nghiên cứu với mục tiêu xây dưng phương pháp định lượng metronidazol huyết tương chó sắc ký lỏng hiệu cao, đồng thời thẩm định lại phương pháp, làm sở để đánh giá sinh khả dụng chế phẩm so với dạng bào chế thông thường NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nội dung nghiên cứu (I)Lấy máu tĩnh mạch cổ chó, ly tâm lấy huyết tương (II) Pha dung dịch gốc metronidazol (MTZ) carbamazepin (CAR) pha loãng thành nồng độ khác huyết tương trắng (III) Ly tâm, loại tủa, lọc qua màng lọc định lượng phương pháp HPLC (IV) Xử lý, phân tích, đánh giá kết Phương pháp nghiên cứu (I) Súc vật thí nghiệm chó đực, trọng lượng 10- 12 kg, lấy máu tĩnh mạch cổ, đem ly tâm 3000 vòng/ phút, thu lấy phần dung dịch huyết tương trắng (II) Dung dịch gốc: 1mg MTZ 0,2 mg CAR pha acetonitril (ACN), sau pha lỗng thành nồng độ khác huyết tương trắng (III) Ly tâm, loại tủa, lọc qua màng lọc 0,45 µm tiến hành định lượng phương pháp HPLC với cỏc iu kin: - Ct RESTEK untra C18 5àm 250ì4,6mm - Nhiệt độ phân tích: nhiệt độ phịng - Detector UV: 320 nm - Thể tích tiêm: 20µl - Pha động: acetonitrile, đệm phosphat pH 4,5 thêm 0,1% TEA tỷ lệ 30: 70 - Tốc độ dòng 1ml/phút - Thể tích tiêm: 20µl - Chất chuẩn metronidazol Viện kiểm nghiệm cung cấp - Chuẩn nội: carbamazepin Viện kiểm nghiệm cung cấp - Các hóa chất sử dụng đạt tiêu chuẩn dành cho HPLC Hình Sắc ký đồ mẫu thử Thẩm định quy trình định lượng: Theo hướng dẫn FDA (2001) (độ đặc hiệu, giới hạn định lượng dưới, độ tuyến tính, tỷ lệ thu hồi, độ ổn định) [3] (iiii) Xử lý, phân tích, đánh giá kết dựa thời gian lưu t R, diện tích chiều cao pic thu sắc ký đồ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Khảo sát lựa chọn thơng số q trình sắc ký: Sau q trình khảo sát với điều kiện sẵn có phịng thí nghiệm, lựa chọn điều kiện sắc ký có khả tách riêng pic MTZ khỏi thành phần tạp có mẫu huyết tương sau: - Ct sc ký: ct RESTEK untra C18, 250ì4,6mm, 5àm - Nhiệt độ phân tích: nhiệt độ phịng - Pha động: acetonitrile, đệm phosphat pH 4,5 thêm 0,1% TEA tỷ lệ 30: 70 - Bước sóng phát hiện: 320 nm - Tốc độ dịng 1ml/phút - Thể tích tiêm: 20µl - Chuẩn nội: carbamazepin Thẩm định phương pháp 2.1 Tính đặc hiệu phương pháp Phân tích mẫu trắng mẫu chuẩn có nồng độ MTZ, CAR 40µg/ml Kết phân tích cho thấy: sắc đồ mẫu chuẩn xuất pic MTZ với thời gian lưu 2,59 phút pic CAR với thời gian lưu 4,79 phút (Hình 1); Sắc ký đồ mẫu trắng khơng có pic vị trí (Hình 2) Hình 2.Sác ký đồ mẫu trắng Điều kiện sắc ký tối ưu cho phân tách MTZ khỏi pic huyết tương 2.2 Đường chuẩn khoảng tuyến tính Phân tích mẫu chuẩn metronidazol huyết tương có nồng độ từ 0,2 đến 40 µg/ml từ đáp ứng pic MTZ chuẩn nội CAR nồng độ tương ứng, xây dựng phương trình hồi qui tỷ lệ đáp ứng pic MTZ/CAR nồng độ MTZ có mẫu Đường chuẩn phải có hệ số tương quan > 0,98 75% số điểm đường chuẩn, bao gồm mẫu có nồng độ thấp mẫu có nồng độ cao phải có độ nằm khoảng từ 85% đến 115% theo qui định Riêng điểm thấp đường chuẩn cho phép sai số không 20% [2] Kết thu trình bày Bảng Hình Bảng Kết đánh giá độ tuyến tính phương pháp định lượng MTZ huyết tương Nồng độ A(mAU,s) C xác định từ đường chuẩn (µg/ml) Nồng độ So với giá trị MTZ CAR MTZ/CAR (µg/ml) thực (%) 0,2 469565,15 6345475 0,074 0,076 100,5 0,5 561299,082 6035474 0,093 0,092 97,4 686902,2 5724185 0,120 0,118 99,9 1898781 5491888 0,346 0,331 105,6 10 3286035 5512413 0,596 0,597 103,6 20 5971858 5424720 1,101 1,129 105,6 40 12984899 5892683 2,204 2,193 85,5 Hình Đồ thị biểu diễn tương quan tuyến tính tỷ lệ diện tích pic MTZ/CAR nồng độ MTZ huyết tương Nhận xét: Đường chuẩn với giá trị R2= 0,9997 > 0,98 tất điểm đường chuẩn có độ nằm khoảng từ 85% đến 115% Điều cho thấy, khoảng nồng độ khảo sát có tương quan tuyến tính nồng độ MTZ huyết tương với tỷ lệ diện tích pic chuẩn/chuẩn nội thu Khoảng tuyến tính phù hợp để định lượng MTZ huyết tương Khoảng tuyến tính xác định từ 0,2 - 40 µg/ml 2.3 Giới hạn định lượng (LLOQ) Xác định đáp ứng pic mẫu chuẩn, mẫu trắng Tính nồng độ MTZ mẫu chuẩn từ tỷ lệ diện tích pic MTZ/CAR đường chuẩn; từ xác định độ cách so sánh với giá trị thực có mẫu Bảng Kết xác định giới hạn định lượng (LLOQ) Diện tích pic (mAU.s) STT Mẫu chuẩn Mẫu trắng MTZ CAR Rt=2.600-2.607 Rt=4.807-4.820 469565 6345475 456424 6342088 445412 6355157 468782 6279421 490389 6035474 515836 5711308 474401 SD 25263 RSD (%) 5.33 Kết Bảng cho thấy, khoảng thời gian 2,6 phút đáp ứng mẫu huyết tương trắng 0, đáp ứng mẫu chuẩn lớn đáp ứng mẫu huyết tương trắng > lần, độ lặp lại sau lần phân tích cho RSD = 5,33 (< 20%) Như vậy, mẫu chuẩn chứa MTZ có nồng độ 0,2µg/ml đáp ứng u cầu giới hạn định lượng phương pháp phân tích đủ độ nhạy để định lượng MTZ huyết tương 2.4 Xác định độ đúng, độ xác phương pháp Kết Bảng cho thấy phương pháp có độ đạt yêu cầu (100,68 – 106,49%) độ lệch nằm giới hạn cho phép (± 15%) độ lặp lại với giá trị RSD (4,22 – 11,65%) Phương pháp phân tích MTZ huyết tương chó đáp ứng yêu cầu độ đúng, độ xác phương pháp phân tích dịch sinh học Bảng Kết khảo sát độ lặp lại phương pháp Diện tích pic (mAU,s) Mẫu STT Độ Thống kê MTZ CAR MTZ/CAR 644566 5847292 0,110 113,6 591547 5881877 0,101 89,4 LQC = 105,63% SD = 11,09 RSD (%) = 10,50 645089 5841104 0,110 114,1 601189 5765239 0,104 98,7 615613 5611084 0,110 112,3 MQC 1852680 6279421 0,295 108,1 = 106,49% SD = 4,50 1574681 5711308 0,276 99,1 RSD (%) = 4,22 1618956 5559215 0,291 106,4 1561909 5183772 0,301 111,1 1514788 5146702 0,294 107,8 HQC 8830543 6171174 1,431 85,6 = 100,68% SD = 11,73 9071125 5935162 1,528 91,7 RSD (%) = 11,65 10949270 6359211 1,722 103,8 11128461 6187296 1,799 108,6 10800629 5746747 1,879 113,7 2.5 Xác định độ tìm lại phương pháp Tỷ lệ thu hồi: Xác định tỷ lệ thu hồi chất chuẩn nội chuẩn cách so sánh diện tích pic MTZ CAR từ mẫu huyết tương với diện tích pic chúng mẫu pha động có chứa nồng độ Kết thu Bảng Bảng Kết xác định độ tìm lại phương pháp Diện tích pic % tìm lại STT Huyết tương Pha động SpicMTZ Spic CAR SpicMTZ Spic CAR MTZ CAR 644566 5847292 756591 6560315 85.2 89.1 LQC 591547 5881877 883560 6729560 67.0 87.4 645089 5841104 914632 6455114 70.5 90.5 601189 5765239 795602 6840062 75.6 84.3 615613 5611084 661079 7052193 93.1 79.6 Diện tích pic % tìm lại STT MQC Huyết tương Pha động SpicMTZ Spic CAR SpicMTZ Spic CAR MTZ CAR 1852680 6279421 1995783 6960315 92.8 90.2 1574681 5711308 2073565 7729560 75.9 73.9 1618956 5559215 1904670 7685114 85.0 72.3 HQC STT 1561909 1514788 5183772 1785662 6840062 5146702 1972599 7052193 Diện tích pic Huyết tương Pha động SpicMTZ Spic CAR SpicMTZ Spic CAR 8830543 6171174 8547203 5729856 9071125 5935162 9505830 5692052 10949270 6359211 9969369 6894456 11128461 6187296 13940145 6972108 10800629 5746747 9920384 7120748 87.5 75.8 76.8 73.0 % tìm lại MTZ 103.3 95.4 109.8 79.8 108.9 CAR 107.7 104.3 92.2 88.7 80.7 KẾT LUẬN Đã xây dựng phương pháp định lượng metronidazole huyết tương chó với cột sắc ký RESTEK untra C18 5μm 250x4,6mm bước sóng 320nm, pha động acetonitril: đệm phosphat pH 4,5 (30:70), tốc độ dịng 1ml/phút áp dụng để nghiên cứu, đánh giá sinh khả dụng viên metronidazol giải phóng đại tràng Phương pháp thẩm định tiêu theo hướng dẫn thẩm định phương pháp phân tích dịch sinh học: tính đặc hiệu với MTZ, giới hạn định lượng dưới, khoảng tuyến tính để định lượng MTZ dịch sinh học 0,2 - 40 µg/ml độ xác đạt yêu cầu phân tích dùng phân tích dịch sinh học TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Bộ Y tế (2002), Dược thư quốc gia Việt Nam [2] Trần Thị Vân Anh cộng (2014), Định lượng metformin huyết tương chó sắc ký lỏng hiệu cao, Tạp chí Y - Dược học quân số 8-2014 [3] FDA, US, Department of Health and Human Service, Center for drug evaluation and research (2001) Guidance for industry, bioanalytical method validation ABSTRACT DERTEMINATION OF METRONIDAZOLE IN DOG PLASMA BY HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY Bui Thi Thanh Cham*, Nguyen Thu Quynh, Nguyen Khac Tung, Đoan Thanh Hieu Thainguyen University of Medicine and Pharmacy Metronidazole [2-methyl-5-nitroimidazole-1-ethanol] is a nitroimidazol derivative, which is used in the long term therapy for trichomoniasis, amoebiasis and giardiasis The aim of this study is to validate the analytical method of metronidazole in dog plasma by high pressure liquid chromatography (HPLC) with detector UV (at 320nm) using carbamazepine as an intenal standard After precipating protein in plasma by acetonitrile, metronidazole and intenal standard were eluted from RESTEK untra C18 column (5àm 250ì4,6mm) at 25C with a mobile phase consisting of acetonitrile and pH 4,5 K2HPO4 (30:70 v/v), at a flow rate of 1.0 ml/min 0,1% TEA was added to the mobile phase to help for the elution.The lower limit of quantitation was 0,02 μg/ml with a relative standard deviation of less than 20% A linear range of 0,2 - 40 µg/ml was established This HPLC method was validated with the precision of 2,70 – 6,35%, respectively The accuracy was 100,68 – 106,49% respectively This validated method is sensitive and repetable enough to be used in bioavailability studies in dogs Keywords: Dertermination, metronidazol, dog plasma, high performance liquid chromatography (HPLC) ... 0,2µg/ml đáp ứng u cầu giới hạn định lượng phương pháp phân tích đủ độ nhạy để định lượng MTZ huyết tương 2.4 Xác định độ đúng, độ xác phương pháp Kết Bảng cho thấy phương pháp có độ đạt yêu cầu (100,68... 109.8 79.8 108.9 CAR 107.7 104.3 92.2 88.7 80.7 KẾT LUẬN Đã xây dựng phương pháp định lượng metronidazole huyết tương chó với cột sắc ký RESTEK untra C18 5μm 250x4,6mm bước sóng 320nm, pha động... sinh khả dụng viên metronidazol giải phóng đại tràng Phương pháp thẩm định tiêu theo hướng dẫn thẩm định phương pháp phân tích dịch sinh học: tính đặc hiệu với MTZ, giới hạn định lượng dưới, khoảng