Tài liệu thông tin về sắc kí lỏng

Sắc kí họ kĩ thuật hoá học phân tích dùng để tách chất hỗn hợp Bao gồm: hỗn hợp chứa chất cần phân tích trong”pha động” di chuyển qua “pha tĩnh” Khi tiếp xúc với pha tĩnh, cấu tử hỗn hợp phân bố pha động pha tĩnh tương ứng với tính chất chúng (tính bị hấp phụ, tính tan, …) Trong hệ thống sắc ký có phân tử pha động chuyển động dọc theo hệ sắc ký Các chất khác có lực khác với pha động pha tĩnh Trong trình chuyển động dọc theo hệ sắc ký hết lớp pha tĩnh đến lớp pha tĩnh khác, lặp lặp lại trình hấp phụ, phản hấp phụ Hệ chất có lực lớn với pha tĩnh chuyện động chậm qua hệ thống sắc ký so với chất tương tác yếu pha Nhờ đặc điểm mà người ta tách chất qua trình sắc ký Cơ sở phương pháp sắc kí:dựa vào phân bố khác chất pha động tĩnh Phân loại: sắc kí khí( Gas Chromatography- GC) sắc kí lỏng (liquid Chromatography) SẮC KÍ LỎNG Khái niệm: - Quá trình tách dựa vào tính chất hóa học, vật lý hóa lý chất - Dựa trình: hấp phụ giải hấp phụ - Xảy liên tục pha: Pha tĩnh: chất rắn lỏng Pha động: chất lỏng (1 chất hỗn hợp nhiều chất) Pha động: hòa tan di chuyển chất phân tích Pha tĩnh: giữ chất phân tích SKL chia thành nhóm - SK lỏng áp suất thường (sắc ký cổ điển) - SK lỏng áp suất cao (SKL hiệu cao: HPLC) (High Performance Liquid Chromatography) Phân loại sắc kí: Dựa theo chế chia tách sắc kí, người ta chia thành loại sau: 1-Sắc kí hấp phụ: Quá trình sắc kí dựa mạnh yếu khác pha tĩnh chat61tan rửa giải(phản hấp phụ) pha động để kéo chất tan khỏi cột Sự tách hỗn hợp phụ thuộc vào tính động học chất hấp phụ Có loại hấp phụ: -Sắc kí hấp phụ pha thuận (NP-HPLC) : pha tĩnh phân cực, pha động không phân cực -Sắc kí hấp phụ pha đảo (RP-HPLC): pha tĩnh không phan cực, pha động phân cực Chủ yếu sử dụng RP-HPLC 2-sắc kí phân bố- sắc kí chiết (LLC) 3-SK trao đổi ion (IE-HPLC) – SK ray phân tử- SK gel (IG- HPLC) Hoặc dựa vào trạng thái pha tĩnh, người ta chia làm loại: Pha động: Lỏng SK lỏng – lỏng (LLC) (Liquid – liquid chromatography) Pha tĩnh: Lỏng Pha động: lỏng SK lỏng – rắn (LSC) (Liquid – solid chromatography) Pha tĩnh: Rắn Sắc kí lỏng hiệu cao (HPLC): KN: Sắc kí lỏng hiệu cao phương pháp chia tach1trong pha động chất lỏng pha tĩnh chứa cột chất rắn phân chia dạng tiểu phân chất lng3 phủ lên chất mang rắn, hay chất mang biến dổi phương pháp hóa học voi71cac1 nhóm chức hữu cơ.Quá trình sắc kí lỏng dựa chế hấp phụ, phân bố,trao đổi Ion hay phân loại theo kích cỡ (rây phân tử) Trong đó: Bình chứa dung môi pha động Bộ phận tiêm mẫu Cột sắc kí( pha tĩnh) Detector(nhận tín hiệu) Hệ thống máy tính gắn phần mềm nhận tín hiệu xử lí liệu, điều khiển hệ thống HPLC, in liệu Ngoài có số hệ thống sắc kí lỏng có phận khử mùi đặt trước bơm cao áp có tác dụng nhằm loại trừ bọt nhỏ sót lại tron dung môi pha động, bọt nhỏ gây ảnh hưởng cho kêt phân tích sai BÌNH CHỨA DUNG MÔI PHA ĐÔNG: -hiện máy HPLC thường có đầu dung môi vào đầu bơm cao áp cho phape1 sử dụng cúng lần đường dung môi Tuy nhiên, theo kinh nghiệm ta sử dụng tối đa la đường BƠM CAO ÁP(hệ thống cung cấp dung môi) - Bơm pha động vào cột thực trình chia tách sắc kí, bơm phải tạo áp suất cao khoảng 250-500 atm phải tạo dòng liên tục.Máy sắc kí lỏng thường có áp suất tối đa 412Bar( 1atm=0,98 Bar) Tốc độ dòng 0,1-9,999 ml/phút - Điểu khiển tốc độ dòng, áp suất pha động theo thong số cài đặt BỘ PHẬN TIÊM MẪU: Đưa mẫu vào cột theo phương pháp không ngừng dòng chảy Có cách đưa mẫu vào cột; tiêm mẫu thủ công tiêm mẫu tự động (autosample) Tiêm thủ công tiêm tự động( autosampler) Cột sắc kí (Column) - Cột chứa pha tĩnh coi trái tim hệ thống sắc kí lỏng hiệu cao - Yếu tố định trình tách sắc ký - Thường làm thép không rỉ, chiều dài cột khoảng 10-25 cm, đường kính 25mm ĐẦU DÒ (detector) - Thiết bị phát chất phân tích chúng khỏi cột (định tính định lượng) - Có nhiều loại khác tùy mục đích phân tích: UV-VIS, huỳnh quang, độ dẫn, điện hóa,khối phổ HỆ THỐNG GHI NHẬN VÀ XỬ LÍ TÍN HIỆU: - Thu thập xử lý kết Detector truyền sang - Recorder, Computer + printer, software Các trình tách sắc ký lỏng - Quá trình quan trọng phương pháp sắc ký - Những cân động xảy pha tĩnh pha động cột sắc ký - Là vận chuyển phân bố liên tục chất PT từ đầu cột đến cuối cột - Chất phân tích phân bố pha, pha động chảy qua cột tách với tốc độ định gradient - Hiệu trình tách phụ thuộc nhiều vào tương tác chất pha tĩnh pha động - Mục đích sắc ký tách định tính chất hỗn hợp chất phức tạp - Thời gian chất PT bị pha tĩnh lưu giữ (thời gian lưu) định bởi: Bản chất pha tĩnh, cấu trúc tính chất chất PT Bản chất thành phần pha động dùng để rửa giải chất PT khỏi cột sắc ký (pha tĩnh) - Ghi lại toàn trình tách sắc ký hỗn hợp chất PT sắc ký đồ gồm nhiều peak - Đặc điểm peak PT: • Các peak tách rời hoàn toàn • Chập phần • Chập hoàn toàn Ưu điểm phương pháp sắc ký - Có thể phân tích đồng thời nhiều hợp chất - Không cần làm bay mẫu - Độ phân giải cao nhờ trình tách cột - Độ nhạy cao (ppm-ppb) nhờ đầu dò - Thể tích mẫu phân tích nhỏ (1-100µL) 10 Mẫu PT qua cột: tồn đồng thời thành phần: - SP không chuyển động - Chất PT vừa chuyển động từ đầu cột đến cuối cột, đồng thời phân bố lại SP MP: Bị SP hấp phụ, rửa giải MP - MP: dung môi rửa giải chuyển động Tương tác với chất, lôi kéo mang chất PT khỏi cột tương tác chính: - Sự tương tác cân chất PT với SP - Sự tương tác cân chất PT với MP - Sự tương tác SP MP Ftot = Fa + Fb + Fc - Chất có lực tương tác lơn bị giữ lại lâu cột - Chất có F nhỏ bị rửa giải Ftot khác nhiều trình tách tốt Tổng tương tác định chất rửa giải khỏi cột trước tiên lực lưu giữ cột nhỏ ngược lại 11 Đối với chất, lưu giữ qui định lực Fa, Fb,Fc Trong Fa Fb giữ vai trò định, Fc yếu tố ảnh hưởng không lớn đây, Fa lực lưu giữ chất phân tích cột Fb lực kéo pha động chất phân tích khỏi cột Như vậy, chất khác Fa Fb khác nhau.Kết chất khác si chuyển cột với tốc độ khác tách hỏi khỏi cột QUÁ TRÌNH TÁCH thể qua hình PHA ĐỘNG THỜI GIAN 12 A B Cột nhồi sắc kí pha thuận:silicagel trung tính Pha tĩnh: Cột loại cột dùng để tách chất không phân cực hay phân cực.Trên bề mặt hoạt động có chứa nhóm OH phân cực ưa nước Cấu tạo cột sau: - Cột silica mạch carbon: -Si-CH2CH2CH2CN -Si-CH2CH2CH2NH2 -Si-CH2CH2CH2OCH(OH)-CH2(OH) + Cột cyano: đa mục đích 13 + Cột amino: phân tích đường + Cột diol: protein - Dung môi chủ yếu: không phân cực + Hydrocarbon: hexan, pentan, octan + Aromatic hydrocarbon: benzen, toluen, xylen,… + Chloroform CHCl3 + Methylene chloride CH2Cl2 - Dung môi phụ: phân cực phân cực + Ethanol, methanol,… Liên kết hydrogen thời gian lưu - Liên kết hydrogen + Mẫu phân tích có: –COOH: nhóm carboxyl Liên kết hydrogen mạnh –OH : nhóm hydroxyl –NH2 : nhóm amino + Mẫu phân tích có nhóm tert-butyl nhóm không phân cực lớn LK hydrogen yếu Cột nhồi sắc ký pha đảo - Cột: không phân cực - Pha động: phân cực - Cột silica alkyl hóa nhóm –OH bề mặt silica trung tính: 14 Cột C18 (ODS) Cot C8 (octyl) Bề mặt không phân cực hay phân cực (hay ky nuoc) Cột C4 (butyl) Cột phenyl Xác định chất phân cực, không phân cực phân cực Thời gian lưu liên kết kỵ nước Dung môi HPLC pha đảo - Dung môi phân cực: Methanol (CH3OH: MEOH), acetonitrile (CH3CN: ACN) - Dung dịch đệm Tối ưu hóa tỉ lệ dd đệm/ dung môi quan trọng để trình tách tốt So sánh pha thường pha đảo 15 Ứng dụng HPLC: Chủ yếu xác định hợp chất hữu khó bay nhiều đối tượng khác nhau: + Amino acid + Acid hữu + Thuốc trừ sâu + … Sắc ký ion (Ion Chromatography) Ion Exchange - Phân tích hợp chất ion - Có loại cột: + Cột trao đổi cation Strong cation exchange: (R-SO3-) Weak cation exchange: (R-COO-) + Cột trao đổi anion: Strong anion exchange: (R4N+) Weak anion exchange: diethyl aminoethyl) Pha động: thường dung dịch đệm dung môi nước Anion: • Carbonat/bicarbonate (Na2CO3/NaHCO3) • Potassium hydroxide (KOH) Cation: • Nitric acid • Tartaric acid • Tartaric acid/dipicolinic acid 16 • Tartaric acid/citric acid 17 18 [...]... nhau.Kết quả là các chất khác nhau sẽ si chuyển trong cột với tốc độ khác nhau và tách ra hỏi nhau khi ra khỏi cột QUÁ TRÌNH TÁCH được thể hiện qua hình dưới đây PHA ĐỘNG THỜI GIAN 12 A B Cột nhồi trong sắc kí pha thuận:silicagel trung tính Pha tĩnh: Cột này là loại cột dùng để tách các chất không phân cực hay ít phân cực.Trên bề mặt hoạt động của nó có chứa các nhóm OH phân cực ưa nước Cấu tạo cột như... phân tích có: –COOH: nhóm carboxyl Liên kết hydrogen mạnh –OH : nhóm hydroxyl –NH2 : nhóm amino + Mẫu phân tích có nhóm tert-butyl hoặc các nhóm không phân cực lớn à LK hydrogen sẽ yếu Cột nhồi trong sắc ký pha đảo - Cột: không phân cực - Pha động: phân cực - Cột silica đã alkyl hóa các nhóm –OH trên bề mặt silica trung tính: 14 Cột C18 (ODS) Cot C8 (octyl) Bề mặt không phân cực hay ít phân cực (hay... quá trình tách tốt So sánh pha thường và pha đảo 15 Ứng dụng của HPLC: Chủ yếu xác định các hợp chất hữu cơ khó bay hơi trong nhiều đối tượng khác nhau: + Amino acid + Acid hữu cơ + Thuốc trừ sâu + … Sắc ký ion (Ion Chromatography) Ion Exchange - Phân tích các hợp chất ion - Có 2 loại cột: + Cột trao đổi cation Strong cation exchange: (R-SO3-) Weak cation exchange: (R-COO-) + Cột trao đổi anion: Strong