nấm sclerotium rolfsii và khả năng đối kháng Tricoderma vs nấm gây bệnh vùng rễ..........................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................
Phần I : Mở đầu 1.1 Đặt vấn đề Việt Nam nước ta nằm vùng khí hậu nhiệt đới ẩm gió mùa, nên hệ thống trồng nói chung rau màu nói riêng đa dạng tạo điều kiện thuận lợi cho sâu bệnh phát sinh gây hại dẫn tới làm giảm suất, chất lượng sản phẩm, tăng chi phí,và làm giảm hiệu kinh tế cho người sản xuất Bệnh hại xuất hầu hết loại trồng vùng trồng nước ta Theo tính tốn FAO đến năm 1986, thiệt hại nấm gây chiếm đến 80%, 20% lại vi sinh vật khác Các nấm gây bệnh tồn đất nguyên nhân gây thiệt hại suất nghiêm trọng cho trồng Việt Nam Do tính chất trồng trọt quanh năm vùng châu thổ Việt Nam, lan truyền tác nhân gây bệnh nước tưới, nước kém, giống khơng bệnh khí hậu nhiệt đới yếu tố tạo điều kiện thuận lợi cho phát triển bệnh Các loại rau cà rau họ hoa thập tự, họ cà… loại rau có chứa hàm lượng dinh dưỡng cao, có ý nghĩa to lớn mặt y học, mang lại hiệu kinh tế cho người sản xuất Ở nước ta, việc trồng phát triển rau họ hoa thập tự mang ý nghĩa mặt luân canh tăng vụ tăng suất đơn vị diện tích, lồi rau khuyến khích phát triển Nấm gây hại vùng rễ Fusarium, Phytophthora, Phythium, Sclerotium rolfsii, Rhizoctonia solani, …có phổ ký chủ rộng, tồn đất với thời gian dài kể điều kiện khơng có ký chủ Chúng bảo tồn sợi nấm, hạch nấm, hậu bào tử, bào tử trứng bào tử có vách dày đất tàn dư trồng.Nấm xâm nhiễm, gây hại trồng làm cho rễ tế bào mạch dẫn không khả hút nước chất dinh dưỡng từ giá thể Vì mà triệu chứng bệnh nấm đất gây thường giống nhau, gây héo vàng, cịi cọc chết cây.Nhiệt độ thích hợp nấm 25 – 28 0C, nhiệt độ thấp – 10 0C, cao 35 0C pH thích hợp cho nấm – 6,5 Điều kiện lạnh khơ thích hợp cho nấm bảo tồn điều kiện nóng ẩm Chính việc phịng trừ bệnh hại vùng rễ khó khăn Để góp phần vào việc nghiên cứu tìm biện pháp tốt nhằm hạn chế gây hại bệnh nấm đất hại vùng rễ, đồng ý phân công Bộ môn Bệnh cây, Khoa Nông học, Học Viện Nông nghiệp Hà Nội, tiến hành thực đề tài: “Nghiên cứu phòng trừ bệnh nấm hại vùng rễ số rau Thanh Trì, Từ Liêm- Hà Nội” 1.2 Mục địch yêu cầu 1.2.1 Mục đích _Nghiên cứu phong trừ số bệnh nấm hại vùng rễ trồng cạn sử dụng nấm đối kháng phòng trừ bệnh 1.2.2 Yêu cầu _ Điều tra thành phần bệnh hại số rau trồng phổ biến Từ Liêm Thanh Trì- Hà Nội _ Phân lập số nấm hại vùng rễ rau _ Xác định ảnh hưởng điều kiện canh tác đến tình hình gây hại số bệnh (mật độ, giống,chế độ bón phân, chân đất) _ Nghiên cứu số đặc điểm sinh học hình thái tác nhân gây bệnh đặc tính gây bệnh chúng _ Thử nghiệm hiệu lực ức chế chế phẩm nấm Trichoderma,phân vi sinh nấm Rhizoctonia solani, Sclerotium rolfsii điều kiện chậu vại Phần II : Tổng quan nghiên cứu giới nước Nấm gây hại vùng rễ Fusarium, Phytophthora, Sclerotium rolfsii, Rhizoctonia solani, Phythium…có phổ ký chủ rộng, tồn đất với thời gian dài kể điều kiện khơng có ký chủ Chúng bảo tồn sợi nấm, hạch nấm, hậu bào tử, bào tử trứng bào tử có vách dày đất tàn dư trồng Như nấm Rhizoctonia solan gây hại rau họ hoa thập tự 2.1 Nghiên cứu nước nấm Rhizoctonia solani gây hại rau họ hoa thập tự 2.1.1 Những nghiên cứu nước Nấm R solani tác nhân gây bệnh cho trống có nguồn gốc đất,là lồi nấm phổ biến xuất khắp vùng trồng giới (Janice Y Uchida, 2008) Theo Farr D.F.,et a(1989) riêng Mỹ có đến 500 lồi thực vật kí củ lồi nấm Ở Nhật R solani gây hại 142 loài thực vật thuộc 52 họ thực vật khác với số loài ký chủ kể đến: đậu tương, cà chua, dưa chuột Nấm R solani Decandolle mô tả vào năm 1815, có tên Rhizoctona crocorum lồi R solani quan trọng nhất.Tuy nhiên bệnh biết đến vào năm1858 Julius Kuhn nghiên cứu bệnh lở cổ rễ khoai tây (Paulo Ceresini, 1999) Theo Khetmalat M.B et al.(1984) Ngoài khả truyền bệnh qua đất, qua tàn dư trồng nấm Rhizoctonia solani cịn có khả truyền bệnh qua hạt giống với tỷ lệ 10%, cịn Mỹ có năm lên tới 30% đặc biệt sợi nấm R solani mọc lồi nấm hoại sinh đất chứa đầy dủ chất hữu Theo Khetmalat M.B et al.(1984) Ngoài khả truyền bệnh qua đất, qua tàn dư trồng nấm Rhizoctonia solani có khả truyền bệnh qua hạt giống với tỷ lệ 10%, cịn Mỹ có năm lên tới 30%.đặc biệt sợi nấm R solani mọc loài nấm hoại sinh đất chứa đầy dủ chất hữu Theo Upmanyu S CTV (2003) nấm R.solani phân bố rộng khắp nơi khắp giới, xâm nhiễm gây hại hàng trăm loại trồng khác gây thiệt hại nặng suất chất lượng nông sản.Triệu chứng gây hại nấm R solani khác tùy thuộc vào phận Tuy nhiên chúng công vào phần mặt đất rễ, trụ mầm hạt giống ( Paulo Ceresini,1999) Đa số triệu chứng R solani gây thường biết đến với tên “ damping off” Hạt giống bị nhiễm nấm bị sức nảy mầm Giai đoạn từ mầm đến 1-2 thật bị lồi nấm cơng bị đổ gục chết Triệu chứng thường xuất bệnh chấm màu nâu hay nâu đỏ gần phần thân sát mặt đất tiếp giáp với đất (Janice Y Uchida, 2008) Khi nghiên cứu cải bắp, Denis Persley (1994) cho biết tượng thối thân thối bắp cải nấm R.solani xâm nhiễm gây hại Triệu chứng xuất thân gần sát mặt đất, xuất vết thối ướt màu tối thân chuyển trồng đồng ruộng mọc chậm, cịi cọc bị chết Theo Ogoshi A.,(1987) nguồn nấm tồn chủ yếu dạng sợi nấm hạch nấm Nấm Rhizoctoniasolani tồn đất từ đến năm, gặp điều kiện thuận lợi nấm nảy mầm hình thành sợi nấm xâm nhập gây hại trồng Theo Papavizas GC CTV (1975) phận nhiễm bệnh bao phủ lớp sợi nấm trắng, sợi nấm phát triển dày đặc, co cụm Nấm lan truyền đồng ruộng nhờ nguồn nước, dụng cụ lao động, vết thương giới tàn dư bệnh Nấm R.a solani loài đa thực, gây hại nhiều loại trồng khác nhau.Nấm chủ yếu tồn dạng sợi hạch đất, tàn dư bệnh cỏ dại.Hạch nấm có kích thước trung bình khoảng mm, hạch nấm thơ, khơng đều, hình bầu dục có màu nâu.Nấm Rhizoctonia solani hình thành bào tử đảm hình quay nhờ phương thức sinh sản hữu tính, trường hợp gặp tự nhiên Theo Vincelli P C CTV (1989) hạch nấm R solani hình thành nhiều ngồi ánh sáng, hình thành hạch thường nhanh chóng giảm nhiệt độ đột ngột Nấm qua đông đất dạng sợi nấm hạch nấm.Trong điều kiện đất khô hạch nấm sức sống 21 tháng Theo Upmanyu S CTV (2003) bệnh lở cổ rễ nấm R solani gây dễ nhầm với triệu chứng bệnh nấm Phytopthora Pythium gây Tuy hình dạng sợi nấm R solani đặc trưng, đường kính sợi nấm từ -12µm, sợi nấm cịn non thường khơng có màu già có màu nâu đậm Sợi nấm mọc từ sợi nấm bố mẹ thường tạo thành góc 45– 90O so với sợi nấm bố mẹ, vị trí phân nhánh thường có vách ngăn thắt lại Một số chủng nấm có khả hình thành hạch nấm màu nâu, dẹt, khơng định hình có kích thước trung bình khoảng 6mm, chúng hình thành mơ bệnh phân huỷ Cũng có chủng khơng hình thành hạch nấm, chủng khác phổ ký chủ, đặc tính gây bệnh, yêu cầu nhiệt độ, pH ẩm độ Theo Sneh CTV (1994) nấm R solani thuộc họ Thelephoraceae, lớp nấm đảm (Basidiomycetes), xếp vào nấm trơ, nhóm nấm bất tồn (Deuteromycetes) Giai đoạn hữu tính gọi Thanatephorus cucumeris thuộc họ Caratobasidiaceae, Tulasnellales, lớp Hymenomycetes Vấn đề phòng trừ bệnh lở cổ rễ nấm R solani gây nhiều tác giả đề cập như: sử dụng thuốc hóa học, dùng chất kháng sinh, sử dụng biện pháp canh tác, biện pháp sinh học đặc biệt dùng biện pháp phòng trừ tổng hợp Đối với biện pháp chọn tạo giống chống bệnh nhà nghiên cứu sử dụng biện pháp lai tạo, chọn lọc cá thể…để chọn tạo giống trồng có khả kháng bệnh cao Áp dụng biện phấp canh tác như: trước gieo trồng cần tưới tiêu nước, trồng vớ mật độ khoảng cách thích hợp tránh dẫn đến ẩm độ cao điều kiện thích hợp cho nấm phát sinh gây hại tiến hành dọn tàn dư bệnh khỏi đồng ruộng có tác dụng làm giảm lượng nguồn bệnh đất, đồng thời tiến hành luân canh với trồng khác họ mẫn cảm với nấm bệnh có tác dụng làm giảm mức độ gây bệnh Tuy nhiên để có hiệu phòng trừ nhanh nhà nghiên cứu sử dụng loại thuốc hóa học trừ nấm Methyl thiophanate, Chlorothalanil,…được sử dụng cách hợp lý có tác dụng phòng trừ bệnh nấm R solani gây (Janice Y Uchida,2008) Việc sử dụng nấm đối khángTrichoderma sp nấm gây hại trồng có từ đầu thập niên 30 Người đề suất vấn đề Wending (Mordue JEM CTV, 1989) Gần việc nghiên cứu nấm Trichoderma sp sản xuất chế phẩm nhiều nhà nghiên cứu khoa học giới tiến hành công bố Trên giới nhiều nước sử dụng chế phẩm Trichoderma sp theo nhiều phương pháp khác như: xử lý hạt giống, bón vào đất, phun lên hay nhúng rễ vào dung dịch bào tử nấm Harman GE Và CTV (2004) đưa số biện pháp sau: xử lý hạt giống với thuốc khuyến cáo, trồng đất khử trùng, giữ sinh trưởng tốt tránh cho không bị tổn thương, đảm bảo tàn dư trồng phân hủy hết trước đem trồng lại diện tích cũ, sử dụng số thuốc Tại Thái Lan, Dasseco Meka (2006) cho biết phủ khuyến khích nhân dân sử dụng chế phẩm sinh học giúp bảo vệ mơi trường an tồn thực phẩm cho người dân đồng thời triệt bệnh lâu dài, tận gốc, theo thống kê năm 2006 việc sử dụng chế phẩm sinh học Trichoderma sp 87% Theo Ada Viterbo Ilan Chet viện khoa học Weizmann, Ixraen (2009) nước Châu phi phân tích Trichoderma loại nấm có mặt hầu hết loại đất nơng nghiệp Chúng có khả kiềm chế loại nấm khác phát triển, trỏ thành đồng minh quan trọng giúp trồng chống lại loại nấm gây bệnh cách tạo cấu phòng vệ toàn trồng (Induced systemic resistance- ISR), tăng cường cho hệ miễn dịch 2.1.2 Những nghiên cứu nước Theo Phan Thị Nhất năm 2000 cho loài trồng : họ thập tự, bầu bí trồng đất thịt nặng úng nước nhiều vụ thường bị bệnh lở cổ rễ nặng chân đất khác (đất cao, thịt nhẹ) Theo Nguyễn Kim Vân CTV (2001), nấm R solani thường gây bệnh phần rễ, thân sát mặt đất, triệu chứng thường gặp thối rễ, teo thắt thân.Sự xâm nhiễm nấm hạch nấm, nguồn hạch nấm từ đất, tàn dư trồng hay hạt củ giống bị bệnh.Kết trình xâm nhiễm làm cho mô bệnh chuyển màu nâu thối bị đổ rạp xuống.Trong điều kiện thích hợp, triệu chứng bệnh xuất từ 3-7 ngày sau diễn trình xâm nhiễm Theo Nguyễn Kim Vân CTV (2001) Việt Nam, nấm R solani gây hại cho trồng quanh năm đặc biệt gây hại nặng vào vụ xuân Kết cho thấy ruộng bắp cải bị bệnh thối bắp nặng tỉnh Bắc Ninh, Hà Tây, Thái Nguyên tác giả giám định xác tác nhân gây bệnh nấm R solani gây ra.Nấm bệnh gây hại cải bắp thường vào giai đoạn con, triệu chứng đặc trưng nhấ rễ, cổ rễ gốc thân sát mặt đất bị thâm đen gốc thân, cổ rễ sau lan rộng nhanh bao bọc quanh cổ rễ, sau 5-6 ngày bị đổ gục chết lụi hàng loạt đồng ruộng Ngồi nấm cịn gây tượng thối bắp trưởng thành gọi thối nâu, vết bệnh lúc đầu vết chết màu nâu vàng sợi nấm có màu trắng xám sau vết bệnh lan nhanh thối toàn bắp.Tỉ lệ bệnh nấm bệnh gây cải bắp vụ xuân vào giai đoạn chuẩn bị thu hoạch dao động từ - 99% vùng trồng rau xung quanh Hà Nội Như nấm R solaniđều phát triển gây bệnh đồng ruộng hầu hết thời vụ trồng cải bắp tỉnh phía Bắc nước ta, kể vụ cải bắp chịu nhiệt vụ hè thu vụ đơng vụ Phân bố chủng nấm R solani số tỉnh trồng cải bắpkhác thuộc phía Bắc Việt Nam Hà Nội, Bắc Ninh, Bắc Giang, Hà Tây (cũ), Thái Nguyên cho thấy chủng nấm R solani vùng địa lý khác có đặc điểm phát triển khác Trong chủng nấm nghiên cứu có chủng nấm có khả hình thành hạch nấm môi trường chủng BC-GL50, R1342, LG100 BN17b Bốn chủng gây thối bắp trưởng thành Hai chủng SP#4 TN002 không hình thành hạch, chủng gây thối bắp chủng gây lở cổ rễ giai đoạn Dùng thuốc hoá học Mexyl MZ, Topsin, Validamycin Rovaral để phòng trừ bệnh lở cổ rễ cải bắp Kết đạt với độ hữu hiệu từ 67,5đến 90% Theo kết nghiên cứu Trường Đại học Nông nghiêp I viện BVTV tiến hành thí nghiệm điều kiện nhiệt độ từ 21-30OC cho thấy nhiệt độ từ 28-30 OC cho nấm R.solani phát triển hình thành hình thành hạc nấm nhanh so với ngưỡng nhiệt độ thấp Trong điều kiện ẩm độ cao thường xuyên 95% hạch nấm hình thành tăng nhanh 37% đất cát tăng 42% đất phù sa Trong điều kiện đất khô kiệt sau ngaỳ có ẩm độ cao hạch nấm phát triển hình thành hạch nấm Khi nghiên cứu đặc điểm sinh học hạch nấm R solani.Theo kết đề tài 02A-07-01 viện BVTV (1990) cho thấy nguồn nấm tồn dạng hạch lâu đấttrên tàn dư trồng kí chủ phụ.Khi gặp điều kiện nhiêt, ẩm độ thích hợp hạch nấm náy mầm phát triển nhanh Do việc áp dụng biên pháp hạn chế nguồn hạch nấm tồn đồng ruộng cần thiết Năm 2005-2006, nghiên cứu nấm R.solani hại số trồng cạn Đỗ Tấn Dũng cho biết bệnh lở cổ rễ phát sinh gây hại nhiều trồng khác vùng Hà Nội Tác hại chủ yếu bệnh gây nên tượng lở cổ rễ, chết làm ảnh hưởng không nhỏ đến sinh trưởng phát triển đến suất, đặc biệt giai đoạn vườn ươm giai đoạn gieo trồng ruộng sản xuất Tản nấm phát triển ban đầu có màu trắng đục, sau chuyển sang màu nâu sẫm Sợi nấm có đặc điểm mọc mịn ép sát bề mặt môi trường nuôi cấy, sợi nấm đa bào phân nhánh nhiều, chỗ phân nhánh sợi nấm thắt lại, sát có vách ngăn, phân nhánh gần vng góc Hạch nấm cịn non có màu trắng, già có màu nâu, thơ.Trong điều kiện ngoại cảnh thuận lợi nấm Rhizoctonia solani hình thành hạch non sau - ngày hạch già sau - ngày ni cấy.Số lượng hạch nấm hình thành khơng nhiều, kích thước hạch nấm nhỏ Theo Nguyễn Lân Hùng (2006) để hạn chế gây hại bệnh lở cổ rễ cần thực tốt biện pháp vệ sinh vườn ươm, tạo giống bệnh Khi bệnh hại nặng khó phịng trừ nấm tồn đất Khi tiến hành khảo sát hiệu lực nấm đối kháng Trichoderma viride với isolate nấm R solani gây bệnh lở cổ rễ môi trường nhân tạo PGA, tác giả cho biết thêm loài nấm đối kháng Trichoderma viride có mặt trước Tại trường Đại Học Nơng Nghiệp I Hà Nội nấm đối kháng Trichoderma viride Bộ môn Bệnh cây- Nông dược phân lập từ năm 1996 Theo Vũ Triệu Mân CTV cho biết,các mẫu phân lập nấmTrichoderma viride có hoạt tính đối kháng mạnh số nấm đất Nấm đối kháng Trichoderma viride nghiên cứu tiêu sinh học gồm khâu kỹ thuật sau: Nuôi cấy giống nấm Trichoderma viride môi trường PGA, nhân giống môi trường giá thể, nghiền bột thu nhận bào tử, pha trộn chất phụ gia thành dạng bột mịn, đóng gói bảo quản, sử dụng Lượng bào tử/1g chế phẩm 5x109 bào tử/gam chất 10 Phần III : Nội dung phương pháp nghiên cứu 3.1 Đối tượng, vật liệu dụng cụ nghiên cứu 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu : -Một số nấm hại vùng rễ trồng cạn -Nấm đối kháng Trichoderma viride 3.1.2 Vật liệu nghiên cứu : - Giống: rau họ hoa thập tự, rau họ cà - Chế phẩm sinh học Trichoderma, phân vi sinh môn bệnh Khoa Nông học, Học viện Nông nghiệp Hà Nội cung cấp - Dụng cụ thí nghiệm + Dụng cụ: đĩa petri, panh, que cấy nấm, tủ định ôn, phịng ni cấy nấm, loại cốc thủy tinh, ống đong, bình đựng nước, nồi hấp, tủ lạnh, kính hiển vi quang học, khay đựng mẫu, cân điện tử, bếp điện, đèn cồn, dao, đũa thủy tinh, lam kính, lamen, máy PCR máy li tâm + Hóa chất:Agar, Glucose, Sucrose, khoai tây, nước cất vôtrùng, cồn, giấy bạc, màng bọc đĩa petri 3.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 3.2.1 Thời gian nghiên cứu Địa điểm nghiên cứu _ Địa điểm: + Vùng trồng rau Từ Liêm-Hà Nội + Vùng trồng rau Thanh Trì-Hà Nội + Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam _Thời gian: Từ tháng 1/2016 đến tháng 7/2016 11 3.3 Nội dung nghiên cứu - Điều tra tình hình bệnh lở cổ rễ, héo gốc mốc trắng hại cà chua, đậu, lạc, họ hoa thập tự số vùng trồng rau Thanh Trì, Từ Liêm- Hà Nội - Quan sát đặc điểm hình thái: nấm, sợi nấm, bào tử, hạch nấm,…và đặc điểm sinh học nấm bệnh - Điều tra ảnh hưởng số yếu tố sinh thái, giống, mật độ trồng, kỹ thuật chăm sóc đến khả gây hại nấm bệnh - Đánh giá mức độ nhiễm bệnh nấm Rhizoctonia solani, Sclerotium rolfsii số trồng cạn - Thử nghiệm hiệu lực ức chế chế phẩm sinh học (Trichoderma, phân vi sinh) số nồng độ khác đến phát triển nấm điều kiện chậu vại 3.4 Phương pháp nghiên cứu 3.4.1 Phương pháp điều tra thu thập mẫu bệnh Phương pháp điều tra xác định thành phần bệnh lở cổ rễ đồng ruộng: Điều tra bệnh hại trồng theo QCVN 01-38: 2010/ Bộ Nông nghiệp PTNT, điều tra 10 điểm chéo góc điểm 10 Theo phương pháp nghiên cứu BVTV tập 3, Viện BVTV năm 200 Chọn ký chủ điều tra ruộng khác Cố định điểm điều - tra, điều tra định kỳ ngày lần tuyến với yếu tố điều tra khu vực điều tra cố định từ đầu vụ vào ngày thứ 2, thứ hàng tuần, - X X theo phương pháp viện BVTV • Điều tra điểm đường chéo X • Mỗi điểm 10cây, điểm điều tra cách bờ 2m Quan sát triệu chứng mức độ bị bệnh lở cổ rễ X cà chua, rau X họ hoa thập tự số vùng trồng Thu thập mẫu bệnh có triệu chứng bệnh 3.4.2 Nghiên cứu phịng thí nghiệm 12 *Chuẩn bị môi trường nuôi cấy - Đĩa Petri, ống đong, ống nghiệm, bình tam giác, đũa thủy tinh khử trùng 140oC - Que cấy nấm, dao cắt, panh, buồng cấy khử trùng tia cực tím, cồn, đèn cồn - Trong q trình nghiên cứu, sử dụng loại môi trường nhân tạo WA, PGA, PDA PSA để phân lập nấm, quan sát nấm mọc môi trường nhanh nhiệt độ phịng thí nghiệm 25 – 27oC * Mơi trường WA (Water Agar) Thành phần: - Nước cất : 1000ml - Agar : 20g Cách điều chế: Đun sôi nước cất, sau cho agar vào khuấy cho tan hết đổ vào bình tam giác sạch, bịt kín miệng giấy bạc Sau đem hấp khử trùng 121oC, 1.5 atm thời gian 20 – 25 phút, để nguội 55 – 60 oC, sau rót vào đĩa petri khử trùng 140oC * Môi trường PGA (Potato Glucose Agar) Thành phần: - Nước cất : 1000ml - Khoai tây : 200g - Agar : 20g 13 - Đường Glucose : 20g Cách điều chế: Chọn củ khoai tây bệnh, rửa sạch, gọt vỏ, thái hạt lựu cho vào nồi nước cất 1000ml đun sôi, sau đun sơi 20 phút lọc lấy phần nước qua phễu có màng lọc, cho thêm nước cất đủ 1000ml Sau đó, cho từ từ agar vào khuấy cho đường glucose vào Mơi trường cho vào bình tam giác dậy nút giấy bạc lại Sau đem hấp khử trùng 121 oC, 1.5 atm thời gian 20 – 25 phút, để nguội 55 – 60oC, rót vào đĩa petri khử trùng 140oC *Môi trường PCA: Thành phần: Khoai tây: 100g Agar: 20g Cà rốt: 100g Nước cất: 1000ml Cách chế tạo (1000ml): tương tự môi trường PGA Công dụng : để nhân sinh khối nấm Rhizoctonia solani trichoderma viride phục vụ cho việc lây bệnh nhân tao *Phân lập nấm gây bệnh giám định mẫu Sau thu thập mẫu bệnh có triệu chứng điển hình, tiến hành rửa mẫu bệnh sau rửa lại nước cất vô trùng dùng giấy thấm vô trùng làm khô mẫu bệnh Cắt mô gốc thân bệnh thành mảnh nhỏ kích thước 1-2x12mm( ranh giới mô bệnh mô khỏe) đưa vào sát trùng cồn 70 O 35 giây thấm khô giấy thấm vô trùng Dùng que cấy khử trùng cấy mô bệnh vào môi trường WA để điều kiện nhiệt độ thích hợp 25-28C Sau sợi 14 nấm mọc cách mô bệnh 2cm dùng que cấy khử trùng cắt phần đầu sợi nấm sang môi trường PGA, 5-6 lần nấm Kỹ thuật cấy truyền: Khử trùng que cấy cồn 96O lửa đèn cồn.Dùng que cấy để nguội cắt phần đầu sợi nấm đặt sang môi trường PGA chuổn bị sẵn, ấn nhẹ để sợi nấm tiếp xúc với môi trường Để giám định nấm, dùng kính hiển vi để xác định nấm bệnh dựa vào đặc điểm hình thái tiến hành lây bệnh nhân tạo nhằm xác định xác nguyên nhân gây bệnh 3.4.3 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái , sinh học nấm hại trồng phịng thí nghiệm Nghiên cứu đặc điểm hình thái nấm Quan sát mơ tả đực điểm triệu chứng, hình dạng hạch nấm, sợi nấm, bào tử nấm, đo kích thước, chụp hình Phân lập, ni cấy, lưu giữ nguồn làm thí nghiệm Giám định dựa vào hình thái nấm gây bệnh (bào tử, sơi nấm , hạch nấm, đặc điểm nảy mầm, vùi áp vòi hút đĩa áp…) Nghiên cứu đặc điểm sinh học nấm Nghiên cứu ảnh hưởng điểu kiện ngoại cảnh đến sinh trưởng phát triển nấm gây bệnh • Ảnh hưởng mơi trường ni cấy - Thí nghiệm đc bố trí vs loại môi trường PGA WGA PCA CLA, nấm đc cấy chuyển vào môi trường đặt điều kiện phòng 12h chiếu sang 12h chiếu tối - Gồm công thức, công thức lần nhắc lại, lần nhắc lại đĩa petri Thời gian theo dõi ngày 15 CT1 : Cấy môi trường PGA CT3 : Cấy môi trường PCA CT2 : Cấy môi trường WGA CT4 : Cấy môi trường CLA - Chỉ tiêu theo dõi: + Quan sát hình thái, màu sắc tản nấm + Đo đường kính tản nấm (mm) Đường kính trung bình (d) tính theo cơng thức: (d1 + d2)/2 ( d1, d2 kích thước đường chéo tản nấm) • Ảnh hưởng ngưỡng nhiệt độ khác đến phát triển nấm R.solani - Sử dụng nguồn nấm Cấy nấm vào đĩa petri ngưỡng nhiệt độ, - 25oC, 30oC, 35oC 40oC Thí nghiệm gồm công thức, công thức nhắc lại lần, lần nhắc lại đĩa petri Thời gian theo dõi ngày - CT1: 25oC CT3: 35oC CT2: 30oC CT4: 40oC Chỉ tiêu theo dõi + Hình thái, màu sắc tản nấm + Đo đường kính tản nấm (mm) Đường kính trung bình (d) tính theo cơng thức: (d1 + d2) / (d1, d2 kích thước đường chéo tản nấm) • - Ảnh hưởng pH môi trường đến phát triển nấm R.solani Sử dụng nguồn nấm Cấy nấm vào đĩa petri ngưỡng pH: 5, 6, 7, 16 - Thí nghiệm gồm cơng thức, cơng thức nhắc lại lần, lần nhắc lại đĩa petri Thời gian theo dõi ngày CT1: Cấy đối chứng CT2: pH = CT4: pH = CT3: pH = CT5: pH = - Chỉ tiêu theo dõi: + Quan sát hình thái, màu sắc tản nấm + Đo đường kính tản nấm (mm) Đường kính trung bình (d) tính theo cơng thức: (d1 + d2)/2 ( d1, d2 kích thước đường chéo tản nấm) 3.4.4 Phương pháp lây bệnh nhân tạo -Dùng que cấy kim tiêm chọc vào phần thân lây bệnh gắn miếng thạch nhỏ từ mẫu tác nhân gây bệnh làm vào vị trí vết thương (hoặc tiêm lượng nhỏ dịch bào tử vào thân, dùng kim ống tiêm) -Dùng que cấy kim tiêm chọc vào phần thân đối chứng không lây bệnh -Dùng parafilm màng ny lon bọc vết thương vị trí lây bệnh -Tưới ẩm cho đất ngày -Kiểm tra so sánh lây bệnh với đối chứng 3.3.5 Phương pháp khảo sát hiệu lực ức chế nấm Trichodema viride (T.viride) điều kiện chậu vại *Thí nghiệm 1: 17 - Hiệu lực đối kháng nấm T.viride nấm R.solani, Sclerotium - biện pháp xử lý hạt giống lạc, đậu tương Thí nghiệm gồm cơng thức, CT nhắc lại lần, lần nhắc lại chậu, chậu gieo 30 hạt thí nghiệm bố trí đất khử trùng o o CT1: Đối chứng Chỉ gieo hạt lạc, đậu tương CT2: Cho nấm gây bệnh vào đất sau 24h bổ sung chế phẩm chế phẩm Trichoderma vào đất gieo hạt o CT3: Xử lý đất chế phẩm Trichoderma sau 24h đem gieo hạt o CT4: Xử lý đất nấm bệnh sau 24h đem gieo hạt Chỉ tiêu theo dõi: theo dõi số hạt chết, số chết CT sau xử lý - 7,14,21 ngày Từ tính hiệu lực phòng trừ củ chế phẩm nấm Trichoderma viride *Thí nghiệm - Hiệu lực đối kháng nấm T.viride nấm R.solani, Sclerotium - giai đoạn ( cà chua, bắp cải) Thí nghiệm gồm công thức vs lần nhắc lại, lần khay, khay 25 - o o o CT1: Trồng vào đất khử trùng CT2: Nhúng vào dung dịch gây bệnh 30” sau đem trồng CT3: Nhúng vào dung dịch có chế phẩm Trichoderma 30” o sau đem trồng CT4: Nhúng vào dung dịch có chế phẩm Trichoderma sau trồng vào bổ sung nấm bệnh Tiến hành theo dõi số bị nhiễm bệnh sau tuần xử lý Tính TLB(%) 3.3.6 Phương pháp xử lý số liệu Cơng thức tính - Theo dõi triệu chứng dấu hiệu bệnh Chỉ tiêu theo dõi: tính tỷ lệ bệnh (TLB)(%) hiệu phịng trừ (%) 18 (TLB)(%) = x100% A: số bị bệnh B: số điều tra - Hiệu lực đối kháng nấm Trichoderma viride nhà lưới Áp dụng công thức Abbott K (%) = x 100 Trong K : độ hữu hiệu C: tỷ lệ bênh (%) CT đối chứng sau xử lý T: tỷ lệ bênh (%) CT thí nghiệm sau xử lý - Các kết tính tốn sai số thí nghiệm phương pháp phân tích phương sai với phần mềm IRRISTAT 5.0 PHẦN 4: Dự kiến thời gian kết thực - Thời gian thực hiện: Nội dung Điều tra tình hình diễn biến bệnh hại vùng rễ số vùng Thanh Trì, Từ Liêm Thu thập mẫu bệnh Tháng Tháng Tháng Tháng Tháng * * * * * * * * * * 19 Tháng Tháng số vùng Thanh Trì, Từ Liêm Quan sát mơ tả đặc điểm, hình thái triệu chứng bệnh hại trồng Lây nhiếm xác định phạm vi kí chủ Xác định hiệu lực phòng trừ hiệu lực nấm đối kháng Trichoderma sp hiệu lực sử dụng nấm vi sinh Viết báo cáo tốt nghiệp - * * * * * * * * * * * * Dự kiến kết đạt +Bảng thành phần bệnh hại số rau trồng phổ biến Từ Liêm Thanh Trì- Hà Nội + Hình ảnh đặc hiểm tản nấm sợi nấm hạch nấm bào tử + Bảng diễn biến số bệnh bệnh lở cổ rễ, héo rũ gốc mốc trắng, thối gốc số trồng cạn + Ảnh hưởng điều kiện canh tác đến tình hình gây hại số bệnh (mật độ, giống,chế độ bón phân, chân đất) + Kết khả phòng trừ nấm Trichooderma phòng trừ số bệnh nấm hại vùng rễ điều kiện chậu vại 20 PHẦN 5: TÀI LIỆU THAM KHẢO * Tài liệu nước Đỗ Tấn Dũng 2011-2012: Nghiên cứu bệnh lở cổ rễ hại số trồng cạn vùng Hà Nội Vũ Triệu Mân (2002) Giáo trình bệnh NXB Nông nghiệp Hà Nội Nguyễn Kim Vân Đỗ Tấn Dũng(2002): “ Một số nghiên cứu nguyên nhân gây bệnh hại trồng có nguồn gốc từ đất nấm đối kháng T.v phòng chống bệnh” Báo cáo hội thảo khoa học- NXB Nông nghiệp Hà Nội 4 Phan Thị Nhất (2000): Sâu bệnh hại lương thực thực phẩm biện pháp phịng trừ, NXB Nơng nghiệp Hà Nội 5.Viện BVTV(2000) phương pháp nghiên cưú BVTV tập 3, NXB Nơng nghiệp, Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp: “ Nghiên cứu bệnh nấm hại cay rau họ hoa thập tự Gia Lâm- Hà Nôi” http://123doc.org/document/1381145-khoa-luan-tot-nghiep-nghien-cuu-benh- nam-hai-cay-rau-ho-hoa-thap-tu-tai-gia-lam-ha-noi.htm?page=5 * Tài liệu nước 21 8.Barush Sneh, Lec Burpee, Alkiwa Ogoshi 1973 “ Identification of Rhizoctonia solani species” APS press 9.Branch, W.L and Brunnemen, T.B (1993).White mold and Rhizoctonia control resistance pea nuttissues on ger mination of sclerotium rolfsii, p124-126 10.Khara,H.S, Hadwan, H.A (1990) Invivostudies on antagonism Ngày…tháng…năm 2016 Giáo viên hướng dẫn: Người thực hiện: ThS Nguyễn Thị Thanh Hồng 22