Sản xuất kháng thể đơn dòng kháng hormon FSH

TÓM TẮT Việc định lượng chính xác Follicle Stimulating Hormone (FSH) có thể giúp phát hiện sớm các rối loạn sinh sản của gia súc. Có nhiều phương pháp định lượng FSH nhưng trên thực tế việc sử dụng phương pháp hóa miễn dịch, đặc biệt sử dụng kháng thể đơn dòng mang tính khả thi hơn so với các giải pháp khác cả về khả năng áp dụng và độ đặc hiệu. Trong nghiên cứu này, 02 dòng tế bào lai Mo_FSH1 và Mo_FSH8 sinh kháng thể đơn dòng đặc hiệu với FSH đã được tạo ra sau khi lai giữa tế bào lympho B của lách chuột mẫn cảm với kháng nguyên FSH gắn albumin với tế bào myeloma SP20Ag14. Nồng độ kháng nguyên gây miễn dịch tốt nhất là 250 µgconlần. Sau khi kiểm tra tính đặc hiệu trên các kháng nguyên glycoprotein khác nhau, dòng Mo_FSH8 được lựa chọn để nhân nuôi lượng lớn và gây báng trên chuột. Từ 7 chuột có báng trên tổng số 10 chuột thí nghiệm, đã thu được 38 ml dịch báng. Tiếp đó, 72,04 mg kháng thể đơn dòng được tinh sạch từ số dịch báng trên và cất giữ ở 800C để phục vụ nghiên cứu tạo kit định lượng FSH.

NGHIÊN CỨU TẠO CÁC DÒNG TẾ BÀO LAI SINH KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG KHÁNG ĐẶC HIỆU FOLLICLE STIMULATING HORMONE (FSH) Đỗ Thị Thảo1, Nguyễn Thị Trang1, Nguyễn Thị Nga1, Nguyễn Thị Cúc1, Đỗ Thị Phương1, Nguyễn Bá Mùi2, Phạm Kim Đăng2 Viện Công Nghệ Sinh học, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam Khoa Chăn nuôi & Nuôi trồng thủy sản, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội TÓM TẮT Việc định lượng xác Follicle Stimulating Hormone (FSH) giúp phát sớm rối loạn sinh sản gia súc Có nhiều phương pháp định lượng FSH thực tế việc sử dụng phương pháp hóa miễn dịch, đặc biệt sử dụng kháng thể đơn dòng mang tính khả thi so với giải pháp khác khả áp dụng độ đặc hiệu Trong nghiên cứu này, 02 dòng tế bào lai Mo_FSH1 Mo_FSH8 sinh kháng thể đơn dòng đặc hiệu với FSH tạo sau lai tế bào lympho B lách chuột mẫn cảm với kháng nguyên FSH gắn albumin với tế bào myeloma SP2/0-Ag14 Nồng độ kháng nguyên gây miễn dịch tốt 250 µg/con/lần Sau kiểm tra tính đặc hiệu kháng nguyên glycoprotein khác nhau, dòng Mo_FSH8 lựa chọn để nhân nuôi lượng lớn gây báng chuột Từ chuột có báng tổng số 10 chuột thí nghiệm, thu 38 ml dịch báng Tiếp đó, 72,04 mg kháng thể đơn dòng tinh từ số dịch báng cất giữ -80 0C để phục vụ nghiên cứu tạo kit định lượng FSH Từ khoá: Enzyme Linked Immuno Absorbent Assay (ELISA), Hybridomas, monoclonal antibody, myeloma, , Follicle Stimulating Hormone, glycoprotein MỞ ĐẦU Được sản sinh từ thùy trước tuyến yên, FSH (Follicle Stimulating Hormone) hay gọi kích noãn tố hormone sinh dục có chất glycoprotein Đúng tên gọi gia súc có chức kích thích phát triển, thành thục noãn nang, đặc biết kích thích phát triển lớp tế bào hạt qua tăng cường tổng hợp estrogenes Cùng với LH, hormone tiết theo qui luật mang tính chu kỳ Nồng độ FSH bắt đầu gia tăng vòng - 14 ngày sau bò đẻ, lúc bắt đầu xuất sóng nang sau sinh Do đó, việc định lượng FSH LH có ý nghĩa lớn việc chẩn đoán trường hợp rối loạn sinh sản gia súc hiên tượng không xuất chu kỳ tính, chậm sinh, vô sinh thiểu quan sinh dục làm sở cho can thiệp nhằm nâng cao suất sinh sản hiệu kinh tế chăn nuôi Trên thực tế, Việt Nam có nghiên cứu cho biết việc định lượng FSH kết hợp với khám buồng trứng giúp chẩn đoán nguyên nhân gây rối loạn trình sinh sản bò sữa (Đào Thị Thúy Hồng, 2009) Công nghệ sản xuất kháng thể đơn dòng phát triển mạnh mẽ năm gần đóng vai trò vô quan trọng khoa học thực tiễn Một số ứng dụng để chẩn đoán nhanh xác số bệnh người vật nuôi nhờ vào tính đặc hiệu độ nhạy cao kháng thể đơn dòng (Brich, Lennox, 1995; Celis et al., 1994; Kohler, Misltein, 1975; Me, Speir, 1996) Hiện nay, nhiều Hãng giới sử dụng kháng thể đơn dòng kháng FSH kit hóa miễn dịch phục vụ việc định tính định lượng hormone này, chẳng hạn FSH ELISA kit (PHOENIX PHARMCEUTICAL); Follicle Stimulating Hormone ELISA KIT (Antibody, USA) v.v mang lại hiệu quan trọng chăn nuôi Trong đó, Việt Nam việc ứng dụng vào thực tế gặp nhiều khó khăn phải nhập kít, giá thành cao, bị động nên ứng dụng số nghiên cứu mà chưa ứng dụng thực tiễn sản xuất (Lê Văn Thọ Lê Xuân Cương, 1979) Chính vậy, việc chủ động nghiên cứu tạo dòng tế bào lai sản sinh kháng thể đơn dòng kháng đặc hiệu FSH cung cấp cho việc chế tạo kit ELISA định lượng hay que thử nhanh FSH phục vụ chăn nuôi nói chung chăn nuôi bò nói riêng cần thiết VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Phương pháp nuôi cấy tế bào Sp2/0-Ag14 in vitro Tế bào Sp2/0-Ag14 GS J M Pezzuto thuộc trường Đại học Hawaii, Hoa Kỳ cung cấp Tế bào nuôi cấy môi trường RPMI-1640 có bổ sung 10% FBS, 1% PSF, 10% Sodium pyruvat (GIBCO) Phương pháp gây miễn dịch Chuột BALB/c gây miễn dịch với kháng nguyên FSH Albumin (Sigma) Kháng nguyên tiêm da chuột nồng độ 100 µg/con/lần; 250µg/con/lần 500 µg/con/lần trộn với tá dược CFA (Completed Freund’s adjuvant, Sigma) theo tỉ lệ 1:1 cho lần tiêm đầu với tá dược IFA (Incompleted Freund’s adjuvant, Sigma) theo tỉ lệ 1:1 cho lần tiêm nhắc lại (Celis A et al., 1994) Lần tiêm nhắc lại thực vào 3-4 tuần sau lần tiêm đầu Lần tiêm cuối cho chuột thực ngày trước lấy tế bào lympho B Phương pháp lai tế bào tách dòng Thu tế bào lympho B từ lách chuột gây miễn dịch đem lai với tế bào Sp2/0-Ag14 với tỉ lệ 1:20 điều kiện tác động polyethylene glycol Tế bào lai pha môi trường có bổ sung HAT chia vào phiến 96 giếng Sau ngày thay môi trường có bổ sung 10% HT Sau ngày, 100 µl dịch thu từ giếng nuôi tế bào kiểm tra có mặt kháng thể kháng đặc hiệu FSH phương pháp ELISA Dịch có giá trị OD cao tức có kháng thể kháng FSH tương ứng với xuất tế bào lai có khả sản xuất kháng thể kháng FSH Thu nhận tế bào lai hybridomas từ giếng có hoạt tính mạnh cấy chuyển sang phiến 24 giếng để tiếp tục nuôi cấy tách dòng Sau trình tách dòng, lựa chọn giếng có dòng tế bào, có sinh kháng thể kháng FSH để nhân nuôi lượng lớn, từ tinh kiểm tra hiệu giá kháng thể đơn dòng thu Phương pháp ELISA để kiểm tra có mặt kháng thể kháng đặc hiệu FSH Phương pháp ELISA thực theo Liddell Cryer (1993) Kháng nguyên pha Carbonate coating buffer (100 µl/giếng) ủ 37 oC Rửa Washing buffer Tiếp tục bổ sung 100 µl dịch cần kiểm tra vào giếng, ủ 1giờ 37oC Goat-Antimouse IgG conjugate HRP sử dụng để kiểm tra có mặt kháng thể kháng FSH Thêm 100 µl/giếng chất TMB ủ 37oC Đọc kết ELISA bước sóng 450nm Bố trí thí nghiệm Tiến hành gây miễn dịch cho 06 chuột BALB/c với kháng nguyên (FSH gắn albumin) Trong đó, chuột chia làm lô thí nghiệm: lô 1; 2; lô tiêm kháng nguyên liều tương ứng 10, 50, 250 µg/con/lần Sau trình gây miễn dịch, máu từ hốc mắt chuột thu lại tách huyết Các mẫu huyết sử dụng cho phản ứng ELISA để kiểm tra khả đáp ứng miễn dịch lô thí nghiệm KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Gây miễn dịch cho chuột Kết kiểm tra khả đáp ứng miễn dịch cho thấy, chuột lô gây miễn liều 10 µg/con/lần cho đáp ứng miễn dịch thấp lô với liều kháng nguyên 250 µg/con/lần cho đáp ứng cao thể qua giá trị OD cao phản ứng ELISA (Hình 1) Như vậy, với quy trình gây miễn dịch sử dụng liều kháng nguyên FSH gắn albumin mức 250 µg/con/lần để gây miễn dịch cho chuột phù hợp Dựa vào kết này, lô số lựa chọn để thu tế bào lympho B phục vụ cho trình lai tạo tế bào sau Hình Hoạt độ kháng thể từ kháng huyết chuột gây miễn dịch Lai tạo chọn dòng tế bào hybrid sản xuất kháng thể đơn dòng kháng đặc hiệu FSH Sau trình dung hợp tế bào (trên 288 giếng) sàng lọc môi trường chọn lọc HAT HT, 196 giếng có xuất tế bào lai Như vậy, hiệu lai (fusion efficiency) đạt 68,06% (196/288) Có thể nói hiệu lai nghiên cứu tương đối cao phù hợp với nghiên cứu trước Đỗ Thị Thảo công ( 2008, 2010);cũng nghiên cứu Fatima YUCEL (1999) Đế chọn giếng có tế bào lai sinh kháng thể mong muốn, phương pháp ELISA sử dụng nhằm kiểm tra có mặt kháng thể kháng FSH dịch thu giếng Kết cho thấy có 68/196 giếng (đạt 34,69 %) dương tính Trên sở đó, giếng có giá trị OD cao lựa chọn để thu nhận, làm dòng phương pháp pha loãng tới hạn chọn lọc phương pháp ELISA Mười hai dòng tế bào lai sinh kháng thể đơn dòng kháng FSH tốt kí hiệu Mo_FSH1 đến Mo_FSH12 tương ứng với 12 giếng có giá trị OD cao nằm khoảng từ 1,48 đến 2,93 lựa chọn Như vậy, tỉ lệ số dòng tế bào sinh kháng thể có tính đặc hiệu với kháng nguyên FSH /số dòng tế bào sinh kháng thể dương tính với kháng nguyên FSH là: 2/69 Tỉ lệ phù hợp với kết nghiên cứu Fatima YUCEL (1999) Các dòng nói nhân nuôi cấp độ lớn hơn, trình nhân nuôi, dòng tế bào lai Mo_FSH1, Mo_FSH2, Mo_FSH5, Mo_FSH6, Mo_FSH8, Mo_FSH9, Mo_FSH10, Mo_FSH11 thể khả sinh kháng thể với hiệu suất tốt hẳn dòng lại Chính vậy, 08 dòng lựa chọn nhân nuôi để thu kháng thể đơn dòng nhằm tiếp tục trình sàng lọc kiểm tra tính đặc hiệu kháng nguyên khác Hình Cụm tế bào lai (clone) dòng Mo_FSH8 phát triển, độ phóng đại 10×20 10×10 Đánh giá tính đặc hiệu hiệu giá kháng thể dòng tế bào chọn Để đáp ứng yêu cầu thực tiễn cần phải có dòng tế bào sinh kháng thể tốt, kháng thể đơn dòng thu phải có tính đặc hiệu độ nhạy cao, dòng tế bào kiểm tra hiệu giá kháng thể tính đặc hiệu kháng thể đơn dòng với hormon glycoprotein khác có cấu trúc gần giống với FSH là: Luteinizing hormone (LH), human chorionic gonadotropin (HCG), Thyroid-stimulating hormone (TSH) Kết cho thấy: dòng tế bào Mo_FSH1 Mo_FSH8 có độ đặc hiệu cao có phản ứng dương tính với FSH âm tính với tất kháng nguyên lại Đồng thời, hiệu giá kháng thể đơn dòng dòng tương đối tốt (2500 với dòng Mo_FSH1 3000 với dòng Mo_FSH8) Từ kết nghiên cứu trên, dòng tế bào lai tiến hành nhân nuôi in vitro để thu số lượng lớn nhằm tạo nguồn tế bào để tạo báng cho chuột để lưu giữ bảo quản nitrogen lỏng Bảng Tính đặc hiệu hiệu giá kháng thể dòng tế bào sinh kháng thể đơn dòng kháng FSH STT Dòng TB FSH LH HCG TSH Hiệu giá Mo_FSH1 + - - - 2500 Mo_FSH2 + + - - 1000 Mo_FSH5 + - - + 3000 Mo_FSH6 + + - - 2000 Mo_FSH8 + - - - 3000 Mo_FSH9 + + - - 2000 Mo_FSH10 + - + + 1000 Mo_FSH11 + - + + 1000 Ghi chú: (+) có kết dương tính với giá trị OD≥ 0,5 phản ứng ELISA; (-) kết âm tính với giá trị OD ≤ 0,5 phản ứng ELISA Gây báng thực nghiệm chuột dòng tế bào lai Mo_FSH8 Có thể nói, kháng thể đơn dòng thu từ dịch nuôi cấy thường tinh sạch, nhiên, hàm lượng chúng thấp sử dụng để sản xuất kit chẩn đoán không khả thi giá thành cao Trong đó, sử dụng tế bào lai để gây báng chuột lượng kháng thể đơn dòng thu thường cao gấp 100 – 1000 lần so với dịch nuôi cấy Do đó, từ kết nghiên cứu in vitro, 10 chuột thí nghiệm dòng BALB/c tiến hành gây báng tế bào lai Mo_FSH8 (theo Liddel Cryer, 1993) Kết cho thấy có chuột xuất báng thu 38 ml dịch báng tương ứng với lượng kháng thể thu 72,01 mg Từ tính hàm lượng kháng thể ml dịch báng nghiên cứu là: 1,895 mg/ml Tuy giá trị thấp so với công bố Tonti K cộng với kết đạt là: 2,5 mg kháng thể/ml dịch báng 20µg kháng thể/ml dịch nuôi cấy tế bào nhóm nghiên cứu Noppavan Janejai et al với kết mà họ đạt là: mg kháng thể/ml dịch báng thấy hàm lượng kháng thể thu từ dịch báng nghiên cứu cho kết khả quan (Tonti K et al., 1981; Noppavan Janejai et al., 1998) Lượng dịch báng thu trải qua bước tinh sạch, thu nhận bảo quản kháng thể đơn dòng tủ lạnh sâu –80 0C để tiến tới nghiên cứu, hoàn thiện quy trình gắn với chất nhũ vàng (Colloid Gold) nhằm ứng dụng việc tạo kit ELISA EIA định lượng FSH sau KẾT LUẬN Nghiên cứu thành công tạo dòng tế bào lai sinh kháng thể đơn dòng kháng đặc hiệu FSH Liều gây miễn dịch cho chuột tôt với kháng nguyên FSHalbumin 250 µg/con/lần Sau trình lai tách dòng, dòng tế bào lai Mo_FSH1 Mo_FSH8 sản sinh kháng thể đơn dòng kháng FSH chất lượng cao lựa chọn Từ đó, dòng Mo_FSH8 lựa chọn để gây báng cho chuột thu 38 ml dịch báng tương ứng với lượng kháng thể đơn dòng thu 72,01 mg Lượng kháng thể đơn dòng thu nhận bảo quản tủ lạnh sâu -80 oC để phục vụ cho việc tạo kit định lượng FSH sau Lời cảm ơn: Chúng xin chân thành cảm ơn GS J.M Pezzuto, trường đại học Hawaii, Hoa Kỳ giúp đỡ thực công trình nghiên cứu TÀI LIỆU THAM KHẢO Đào Thị Thúy Hồng (2009) Xác định hàm lượng số hormone sinh sản phương pháp miễn dịch enzym (ENZYM LINKED IMMUNO SORBENT ASSAY) để chẩn đoán, điều trị tượng rối loạn trình thụ tinh bò sữa nguyên nhân bệnh lý buồng trứng, Luận văn thạc sỹ Nông nghiệp, Đại học Nông nghiệp Lê Văn Thọ, Lê Xuân Cương (1979) Kích dục tố ứng dụng chăn nuôi NXB Nông nghiệp, Hà Nội Đỗ Thị Thảo, Đỗ Thị Phương, Đỗ Khắc Hiếu, Hà Thị Thu, Đinh Thương Vân, Đinh Duy Kháng, Lê Trần Bình (2008) Tạo dòng tế bào lai sản xuất kháng thể đơn dòng kháng protein vỏ VP28 virus gây bệnh đốm trắng tôm sú, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 6(2): 203 – 208 Đ T Thảo, N T Cúc, N T Nga, N T Trang, Đ T Phương (2010) Nghiên cứu tạo dòng tế bào lai sinh kháng thể đơn dòng kháng alpha-fetoprotein (AFP) để hỗ trợ chẩn đoán sớm ung thư tế bào gan người, Y học Việt Nam, 372: 90-94 Birch J R, Lennox E S (1995) Monoclonal antibodies: principles and applications, John Wiley & Sons Celis A, Dejgaard Kurt, Julio E Celis (1994) Production of mouse monoclonal antibodies, Cell Biol, 2: 269 – 275 Fatima YUCEL (1999) Production of Monoclonal antibody specific for progesterone, Tr J of Boilogy, 23: 393-399 Kohler G, Milstein C (1975) Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefinied sepcificity, Nature, 256 (5517): 495-497 Liddell E J, Cryer A (1991) A practical guide to monoclonal antibodies, John Wiley & Sons 10 Me C, Speir R E (1996) Monoclonal antibodies in biotechnology theoretical and practical, Aspects Cambridge, 92 – 98 11 Noppavan Janejai, Jaranee Pheungphosop, Wanpen Boonwanich, Wiyada Charoensiriwatana (1998) A Plot study for the production of monoclonal antibody by bioreactor, Bull Dept Med Scl, 40(3): 239-246 12 Tontti K, Stenman U H, Sutinen M L, Selander R K, Schröder J (1981) Characterization of a monoclonal antibody to human alpha-fetoprotein and its use in affinity chromatography, Journal of Immunological Methods, 46(3) SUMMARY STUDYING ON CREATION OF HYBRIDOMAS PRODUCING MONOCLONAL ANTIBODY SPECIFIC FOR FOLLICLE STIMULATING HORMONE Do Thi Thao1, INguyen Thi Trang1, Nguyen Thi Nga1, Nguyen Thi Cuc1, Do Thi Phuong1, Nguyen Ba Mui2, Pham Kim Dang2 Institute of Biotechnology, Vietnam Academy of Science and Technology 2Faculty of Animal sciences & Aquaculture, Hanoi University of Agriculture i Follicle Stimulating Hormone (FSH) quantitation could be helpful as indicator of reproductive disease in cattle To quantity the amount of serum FSH, using monoclonal antibody is highly feasible In this study, clones of hybridomas named as Mo_FSH1 and Mo_FSH8 which were able to produce very specific monoclonal antibody against FSH were selected Those cells were fused between myeloma SP2/0-Ag14 cells and the B lymphoid cells isolated from spleen of the FSH immunized mouse Without any cross reaction with other tested glycoproteins, the clone Mo_FSH8 was selected for further in vitro culture at the larger scale to inject into BALB/c mice for ascite fluid propagation Among 10 Mo-FSH8 injected mice, we got ones which were collected with 38 ml of ascite fluid in total After purification process, there were 72.01 mg of purified monoclonal antibody were gained Those are all aliquoted and saved at the -80 0C for developing the quantitative FSH kit in future Keywords: Enzyme Linked Immuno Absorbent Assay (ELISA) Hybridomas, monoclonal antibody, myeloma, Follicle Stimulating Hormone, glycoprotein Author for correspondence: Thao Thi Do, Tel: 04-38361774; Email: thaodo@ibt.ac.vn